وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح OO0G01 طاقة معهد العلوم البيولوجية.

ويتمثل الأسلوب OLIMP على هيميسيلولوز الرئيسية الموجودة في جدران الخلايا النباتات dicot ، xyloglucan ، وذلك باستخدام endoglucanase كما glycosylhydrolase. ويتجلى الأسلوب مع الشتلات Arabidopsis بأسرها مصنع النسيج المصدر. يمكن أن تكون بديلا عن الانزيمات والمواد المصفوفة خارج الخلية اعتمادا على التحليل المطلوب باستخدام نفس الإجراء. 1. جدار الخلية العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد five 5 أيام القديمة الشتلات Arabidopsis كليا أو ما يعادل ذلك من المواد التي تريدها ونقلها إلى أنبوب 1.5mL رد فعل. تأكد من أن يتم وضع هذه المادة في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة اثنين من كرات معدنية 3mm ل الأنبوب رد فعل على أعلى من العينة والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن العينة المجمدة باستخدام الكرة مطحنة (2:30 دقيقة ، 25Hz). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1mL الإيثانول المائي 70 ٪ من العينة. إزالة الكرات المعدنية باستخدام المغناطيس. دوامة بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العينة 14000 دورة في الدقيقة ل10min لتكوير بقايا الكحول التي تحتوي على مواد غير قابلة للذوبان جدار الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1mL من كلوروفورم / الميثانول (1:1 V / V) حل. دوامة جيدا لresuspend الكرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة العينة لمدة 10 دقيقة وإزالتها بعناية طاف بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جفاف العينة باستخدام مكثف. </li></ol> 2. Solubilization من oligosaccharides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لsolubilization resuspend السكاريد وخاصة في شكل oligosaccharides أعمالها بيليه الجافة في 25μl لالعازلة المناسبة. لفورمات الأمونيوم 50mM endoglucanase ، pH4.5 ، يستخدم. إضافة 0.2U من endoglucanase. وقف دوامة والسائلة تدور باستمرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نموذج لاحتضان 16H في 37 في حاضنة درجة مئوية ، والهز في 300rpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المذيب للهضم (المياه) باستخدام مكثف. </li></ol> 3. MALDI - TOF تحليل صدر oligosaccharides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم BioRex الموجبة 501 MSZ الخرز راتنج تبادل لإزالة الأملاح والانزيم من العينة هضمها. شرط حبات عن طريق وضع قسامة في عمود فارغ وغسل الخرز مع كميات وفيرة من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى 50-10 الخرز BioRex العينة هضمها والمجففة. ثم يضاف الماء 10μl ، ليمكن استخدام كميات صغيرة من المواد 5μl من الماء. تزج حبات في حل عن طريق الدوران لفترة وجيزة في الأنبوب. احتضان لمدة لا تقل 10min في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقعة 2μl مصفوفة (2،5 - dihydroxybenzoic حمض (DHB) ، 10mg/ml في الماء) على لوحة الهدف MALDI. تتبخر المذيبات المصفوفة تحت فراغ يؤدي إلى بلورات متجانسة الكيميائية المصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2μl بقعة من الحل عينة المحلاة على رأس الكريستال مصفوفة على لوحة الهدف. إذا كنت ترغب في بقعة عدد كبير من العينات تبقي فقط على اكتشاف لمدة أقصاها 3min. هذا الإطار الزمني يضمن أن العينة الأولى رصدت لم يجف بعد. الانتظار للحصول على 2min إضافية لضمان وجود خلط دقيق لإعادة حل المصفوفة وجزيئات عينة oligosaccharide في العينة رصدت الماضي. الجافة ثم لوحة الهدف في ظل الفراغ. وينبغي أن المزيج عينة / مصفوفة بلورة في أقل من لتمكين 1min تبلور متجانسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة الهدف في مطياف الكتلة - TOF MALDI. يجب تعيين الجهاز إلى وضع reflectron إيجابية مع الجهد المتسارع لل20000V وتأخير من 350 نانومتر ، ومجموعة مختارة الشامل ينبغي 500-3000 دا (قد تتغير اعتمادا على oligomers المتوقعة). بدء اطلاق النار ليزر وجمع أطياف 100-200 لكل عينة ، والتي هي ترجمة لتوليد طائفة ممثل المتوسط ​​(الشكل 2A). يمكن التعرف على أيونات يمثل oligosaccharides محددة من كتلتها أكثر من نسبة (م / ض) تهمة. وينبغي أن يضاف شدة ايون (ارتفاع الذروة) لجميع الأيونات ذات الاهتمام تصل إلى 100 ٪ مما أدى إلى وفرة نسبية في كل oligosaccharide في العينة (الشكل 2B). </li></ol> 4. وفي تحليل OLIMP الموقع ويمكن أيضا أن تستخدم OLIMP مباشرة على النسيج حذف أي خطوات إعداد الجدار. كما etiolated مثالا hypocotyls من Arabidopsis كما تستخدم مصدر الأنسجة النباتية. مرة أخرى ، يتم استخدام endoglucanase لتحديد هيكل xyloglucan hemicelluloses. يمكن أن تكون بديلا إنزيم الأنسجة والمواد اعتمادا على التحليل المطلوب باستخدام نفس الإجراء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محصول etiolated الشتلات ووضعه على لوحة فارغة الهدف MALDI وترك الشتلات الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl ، الذائبة في فورمات الأمونيوم 50mM ، pH4.5) على الشتلات المجففة في الموضع المطلوب. تأكد من أن انخفاض انزيم اللمسات جزئيا لوحة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة الهدف MALDI في حاوية مغلقة مع رطوبة تشبع لتجنب أن تراجع انزيم يجف. احتضان لوحة في قاعة : 16H عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجافة لوحة الهدف MALDI مع الأنسجة النباتية وانخفاض انزيم تحت فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5μl المصفوفة (DHB ؛ 10mg / لتر) على رأس كل بقعة انزيم المجففة. السماح لها الوقوف ل2min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجافة لوحة الهدف MALDI تحت فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينات مع MALDI - TOF. مكان لوحة الهدف مع الأنسجة والبقعة انزيم / مصفوفة (ق) إلى مطياف الكتلة - TOF MALDI. يجب تعيين الجهاز إلى وضع reflectron إيجابية مع الجهد المتسارع لل20000V وتأخير من 350 نانومتر ، ومجموعة مختارة الشامل ينبغي 500-3000 دا (قد تتغير اعتمادا على oligomers المتوقعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء اطلاق النار ليزر على بلورات المصفوفة / عينة NEXT إلى الأنسجة. تأكد من أنك لا تضغط على الأنسجة نفسها ، كما هو الحال في مثل هذه الحالة وقت الرحلة من الجزيئات سيتم إيقاف. جمع نحو 20-50 في بقعة الأطياف ، والتي هي ترجمة لتوليد طائفة ممثل المتوسط ​​(الشكل 3). يمكن التعرف على أيونات يمثل oligosaccharides محددة من كتلتها أكثر من نسبة (م / ض) تهمة. يمكن الابلاغ عن شدة ايون (ايون الارتفاع) وينبغي أن تضاف أيونات كل من الفائدة تصل إلى 100 ٪ مما أدى إلى وفرة نسبية في كل oligosaccharides في العينة. </li></ol> 5. ممثل النتائج ويرد مثال لتحليل OLIMP من xyloglucan hemicelluloses موجودة في Arabidopsis الشتلات في الشكل 2. ويمكن لوجود خلافات كتلة الأيونات وانزيم يعرف جيدا اتسم (endoglucanase) خصوصية يتم تعيين أيونات للهياكل محددة oligosaccharide (الشكل 2A). من الواضح ، لا يمكن أن تميز أيزومرات الهيكلي. الافتراض الأساسي لتحديد الوفرة النسبية لمختلف oligosaccharides (الشكل 2B) هو أن على الاستجابة المواصفات عامل الشامل هي مشابهة جدا لتلك oligosaccharides. كما هو موضح هنا ، والقياس الكمي OLIMP هو تكرار للغاية. ومع ذلك ، يرجى ملاحظة أن متانة الأسلوب يعتمد اعتمادا كبيرا على إشارة إلى نسب الضوضاء من الأيونات في oligosaccharide المختلفة. على سبيل المثال يمكن للتلوث مع أملاح أو كميات أقل من هذه النسبة انخفاضا oligosaccharides. تحليل OLIMP على النسيج نفسه (في تحليل الوضع الطبيعي) تمكن من دراسة مناطق صغيرة ومحددة جدا وينطوي على القليل جدا من إعداد العينة. في المثال المقدمة هنا (الشكل 3) لا النوعي (الأيونات نفسها) ولكن لوحظ اختلاف كمي (التباين في كثافة الأيونات) بين الخضري والجذري الأنسجة من الشتلات Arabidopsis. ويمكن للطريقة التباديل - OLIMP بالتالي تؤدي الى &quot;التصوير&quot; الأنسجة. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مخطط تدفق الإجراء OLIMP استخدام الشتلات Arabidopsis بأكملها كمصدر النبات. الأولى ، هي متآكلة الأنسجة والخلايا مواد الجدار مستعدة (صورة معدلة من فوجينو آخرون 10). ثم يتم الافراج oligosaccharides من السكاريد الجدار خاص باستخدام هيدرولاز محددة. أخيرا ، يتم تحديد الكميات المتوفرة النسبية للذوبان oligosaccharides باستخدام - TOF MALDI مطياف الكتلة. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الوفرة النسبية للoligosaccharides xyloglucan في etiolated شتلة من Arabidopsis على النحو الذي يحدده OLIMP. أ) الممثل الطيف xyloglucan الشامل oligosaccharide ؛ كل أيون يمثل بنية محددة oligosaccharide ، لا يمكن أن تميز أيزومرات الهيكلي. ب) الرسم التخطيطي لشريط المقابلة من أجل تحديد الوفرة النسبية oligosaccharide. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. وفي تحليل OLIMP الموقع باستخدام الشتلات etiolated من Arabidopsis كمثال. ويمكن تحليل كل قطرة انزيم / الهضم (دوائر ملونة) بشكل مستقل ويمكن الحصول على أطياف الكتلة المقابلة وتحليلها. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. OLIMP طيف xylan هيميسيلولوز التي حصلت عليها هضم المواد Miscanthus نبات مع xylanase (Megazyme).

<ol>
	<li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting.">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides.">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li><li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis.">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li><li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls.">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xyloglucan-specific+endo-beta-1,4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus:+expression+cloning+in+yeast,+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme.">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li><li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa:+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides.">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li><li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis.">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li><li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis.">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation:+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations.">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1,2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides.">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity.">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li><li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana.">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li><li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils,+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl.">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li><li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1.">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li><li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan,+a+major+primary+cell+wall+component.">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li><li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+liquid+chromatography,+capillary+electrophoresis,+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants.">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأسلوب OLIMP المعروضة هنا يمكن تحليل حساسة للغاية وسريعة للبوليمرات موجودة في مصفوفات خارج الخلية. OLIMP يجمع الافراج الأنزيمية من oligomers مع تحليل MALDI - TOF اللاحقة. الجيل طائفة - TOF MALDI تستغرق أقل من دقيقة واحدة ، وبالتالي OLIMP هو مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك دراسات الإنتاجية العالية مثل شاشات متحولة. لا يقتصر على OLIMP السكريات النباتية ولكن يحتمل أن يتم تطبيقها على مجموعة واسعة من البوليمرات ، وقلة فقط من توافر الإنزيمات حلمهي محددة. ومع ذلك ، وجود قيود OLIMP هو أنه لا يمكن مطلقا وفرة من البوليمر يمكن الحصول عليها. كما ذكر من قبل ويمكن استخدام OLIMP لدراسة بنية مجموعة متنوعة من السكريات الموجودة في المصفوفة خارج الخلية من تنوع الأنواع. كمثال على ذلك ، الشكل 4 يمثل الطيف OLIMP هيميسيلولوز من الأنواع الرئيسية في العشب ، وxylan. هنا ، تم هضم المواد جدار الخلية المستمدة من العشب Miscanthus المعتدلة باستخدام xylanase.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>37550</td>
<td>10mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>BioRex MSZ 501(D) Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>142-7425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endoglucanase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Megazyme</td>
<td>E-CELTR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylanase M6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Megazyme</td>
<td>E-XYRU6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3mm metal balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>22.455.0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beat mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>Mixer Mill MM400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI-TOF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shimadzu BioTech</td>
<td>Axima Performance</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI target plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kratos Analytical</td>
<td>DE4555TA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpeedVac</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>Vacufuge 5301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MSVMHTS00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Welch</td>
<td>DryFast Ultra 2032</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

oligo mass profiling (olimp) of extracellular polysaccharides

وتوسط في اتصال مباشر من الخلايا للبيئة في العديد من الكائنات الحية عن طريق المصفوفة خارج الخلية. جانب واحد مشترك للمصفوفات خارج الخلية هو أنها تحتوي على جزيئات السكر معقدة في شكل جليكوبروتينات ، البروتيوغليكان ، و / أو السكريات. وتشمل الأمثلة على المصفوفة خارج الخلية من البشر والخلايا الحيوانية التي تتألف أساسا من البروتينات الليفية والبروتيوغليكان أو الجدران السكاريد خلية تقوم النباتات والفطريات ، وبروتيوغليكان / شحمي سكري جدران الخلايا تقوم البكتيريا. كل هذه glycostructures تلعب دورا حيويا في الخلية الى خلية الاتصال والخلية الى البيئة والإشارة. مثال استثنائية معقدة من مصفوفة خارج الخلية موجودة في جدران خلايا النباتات الراقية. جدار مصنوع بالكامل تقريبا من السكريات ، وتصل إلى 75 ٪ من الوزن الجاف ، وتتكون من البوليمرات الحيوية الأكثر وفرة موجودة على هذا الكوكب. لذا ، يجري ابحاثا حول كيفية استخدام هذه المواد أفضل كمورد خالية من الكربون ليحل محل البتروكيماويات المتجددة المستمدة من الوقود الأحفوري. التحدي الرئيسي لتحويل الوقود لا يزال تمردات الجدران لتدهور الأنزيمية أو كيميائية بسبب glycostructures فريدة موجودة في هذا biocomposite فريدة من نوعها. هنا ، نقدم طريقة لتحليل سريع وحساسة من glycostructures جدار الخلية النباتية. ويستند هذا الأسلوب الشامل أليغو التنميط (OLIMP) الافراج الأنزيمية من oligosaccharides من مواد الجدار تسهيل glycosylhydrolases محددة والتحليل اللاحق للمخاليط oligosaccharide solubilized باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة الكتلة الطيفي (MALDI-TOF/MS ) 1 (الشكل 1). OLIMP يتطلب جدران الخلايا فقط 5000 لتحليل كامل ، لا يمكن أن يؤديها على النسيج نفسه 2 ، وغير قابلة للتحلل عالية الإنتاجية 3. بينما لا يمكن أن المبلغ المطلق للoligosaccharides solubilized يحددها OLIMP أن يرسم الوفرة النسبية للايونات في oligosaccharide مختلفة من الأطياف الشامل يعطي أفكارا حول نمط بدائل للالسكاريد الأصلية موجودة في الجدار. يمكن استخدامها لتحليل OLIMP تشكيلة واسعة من البوليمرات الجدار ، وقلة فقط من توافر إنزيمات معينة 4. على سبيل المثال ، لتحليل البوليمرات الموجودة في جدار الخلية النباتية الانزيمات المتوفرة لتحليل xyloglucan hemicelluloses باستخدام xyloglucanase 5 ، 11 ، 12 ، 13 ، xylan باستخدام 6،7 إندو - β - (1-4) ، xylanase أو للحصول على السكريات بكتيني باستخدام مزيج من polygalacturonase وmethylesterase 8. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام نفس مبادئ glycosylhydrolase OLIMP والأنشطة ناقلة الغليكوزيل حتى يتم رصدها وتحديد 9.

Watch this Scientific Journal Video about OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides at JoVE.com

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

وصفت وسيلة سريعة للحصول على نظرة ثاقبة لبنية السكريات في المصفوفة خارج الخلية. الأسلوب يستفيد من خصوصية وحساسية glycosylhydrolases من مطياف الكتلة يسمح تحليل كميات ضئيلة من المواد. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف لاستخدامها مباشرة على النسيج نفسه.

أليغو التنميط قداس (OLIMP) من السكريات خارج الخلية

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

JoVE Journal

Biology

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

13.6K Views.  University of California, Berkeley. وصفت وسيلة سريعة للحصول على نظرة ثاقبة لبنية السكريات في المصفوفة خارج الخلية. الأسلوب يستفيد من خصوصية وحساسية glycosylhydrolases من مطياف الكتلة يسمح تحليل كميات ضئيلة من المواد. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف لاستخدامها مباشرة على النسيج نفسه.

Video: OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

التنميط الضد من قبل أنظمة مناعي Luciferase (الشفاه)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...