وأيد هذه الدراسة الجديدة FMMU إيجاد الأساس والمعاهد الوطنية للصحة التي تمول جزئيا.

1. الخلية الدبقية الثقافة يمكن أن يكون مثقف الخلايا الدبقية من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. يظهر في الشكل العملية برمتها العملية. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="عملية 1" /> يوم الثقافة طلاء 1 لوحة وcoverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكروسكوب تعقيم جاف الجولة coverslips في الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة coverslips تعقيمها في تعقيم لوحة الثقافة 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف coverslips مع يسين بولي واحتضان لمدة 2 ساعة تحت درجة حرارة الجذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات معطف الثقافة جيدا في 6 بنفس طريقة الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips و 6 - جيدا لوحة الثقافة مرتين بالماء المقطر والهواء الجاف في غطاء الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 المتوسطة DMEM ميكرولتر (FBS مع 10 ٪) في كل بئر في 24 لوحة وكذلك 2 مل في كل بئر في 6 - جيدا لوحة ووضعها في الحاضنة تحت درجة 37 مع 5 ٪ CO 2 </li></ol> اليوم 2 القشرة عزل وزراعة الخلايا الدبقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم تشريح تدفق إيجابي غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش جميع الأسطح مع الايثانول 70 ٪ وانتظر 15 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير متوترة : تخدير الفئران الوليدة (P2 - P6) من انخفاض حرارة الجسم ، وقطع رأس في قاعدة ماغنوم framen باستخدام مقص التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الجمجمة على طول الدرز السهمي باستخدام مقص القزحية وتقشر الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ الأمامي ووضعها في المتوسط ​​L15 المبردة ، تحت stereomicroscope ونظيفة بعناية غشاء الجافية والحنون مع الأوعية الدموية ، وعزل القشرة ويغسل عدة مرات مع L15 المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع القشرة الى قطع صغيرة مع مقص المجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.125 ٪ التربسين EDTA - L15 أعدت مع القشرة الى قطع متوسطة واحتضانها في 37 درجة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كتل الأنسجة في المتوسط ​​DMEM 20mL FBS مع 20 ٪ في 50mL الأنبوب ، إضافة إلى الأسهم الدناز الحل النهائي 10ug/mL تركيز ، نضح الحل النسيج صعودا وهبوطا لمدة 20 مرات مع الزجاج المصقول النار Pasteure ماصة ، وجمع الخلايا تعليق واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل تعليق الخلية مرة واحدة مع DMEM المتوسطة ، وإعادة تعليق الخلايا في DMEM FBS مع 10 ٪ ، وعدد الخلايا تحت المجهر مع الخلايا عدادة الكريات البذور ، في 5000-10000/cm 2. المحافظة على الخلايا في الحاضنة 37 درجة 5 ٪ ، وتغير من نصف المتوسط ​​2 مرات في الأسبوع. </li></ol> 2. الجذر الظهري عزل الخلايا العصبية العقد والثقافة وتنقية اليوم 1 تحضير مادة الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف coverslips تعقيمها مع بولي يسين coverslips يغسل ، ومرتين مع تقطير المياه والهواء الجاف ، ووضعها في 24 لوحات جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المتوسطة Neurobasal 100μL مع 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل) ، ووضع لوحة في ثاني درجة 37 5 2 ٪. </li></ol> اليوم 2 عزل DRGs من أجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الغطاء التدفق بالطريقة نفسها كثقافة الخلية الدبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء وفأر حامل (E15) بواسطة جرعة زائدة مع CO 2 ، والبطن تعقيمها بواسطة الايثانول 70 ٪ ، معزولة الأجنة من رحم ووضعها موضع المتوسطة L15 مبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل النخاع الشوكي متصلا مع العقد الجذرية الظهرية تحت stereomicroscope ونقل إلى الأطباق مع 35mm المتوسطة L15 مبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق واحد جمع خلية ويغسل مرة واحدة مع NBF المتوسط ​​(متوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل)). </li></ol> اليوم 3 تنقية الخلايا العصبية DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 18H - 24H بعد البذر الخلايا العصبية ، إضافة 1 ملم الأسهم FUDR تتركز حل للثقافة عصبون إلى تركيز النهائي من 20 ميكرون ، والحجم النهائي من 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72H في وقت لاحق ، يستعاض عن نصف المتوسط ​​مع المتوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50ng/mL) دون FUDR. بعد ذلك ، وتغير كل يوم وسيلة أخرى. </li></ol> 3. Coculture الخلايا العصبية مع الخلايا الدبقية DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعندما وصلت الخلية الدبقية الثقافة التقاء (حوالي 20 يوما بعد البذر) ، وعلى استعداد لcoculture مع الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل 24 ساعة مضيفا ان الخلايا العصبية المنقى ، تم تغيير الخلايا الدبقية المتوسطة والمتوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تم جمع الخلايا العصبية تنقيته من الآبار والثقافة ، والحصول على تعليق واحد الخلايا عن طريق تمرير الميكانيكية من خلال ماصة النار Pasteure المصقول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فرز العدد ، كان المصنف في الخلايا العصبية 500/cm 2 على الخلايا الدبقية متكدسة في المتوسط ​​Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50ng/mL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تسجيل نمو الخلايا العصبية والتصاق الخلايا الدبقية على neurite وتحليلها في نقاط زمنية مختلفة بواسطة برنامج تحليل الصور وكيمياء سيتولوجية مناعية باستخدام الأجسام المضادة نوع من الخلايا المحددة. </li></ol> 4. ممثل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الخلايا الدبقية : بعد الغرس وسوف تصبح الخلايا الدبقية متموجة حوالي 20 يوما. تحت microsc النقيض من المرحلةمكتب مستشار رئيس الوزراء ، تم التعرف عليه بسهولة أن مختلف المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الدبقية المورفولوجية المختلفة شكلت الأساسات نمط النمو والخلايا النجمية GFAP إيجابية شكلت أكثر من 90 ٪ كما هو مبين من خلال تقنية immuocytochemisty (الشكل 1 ، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأظهرت الخلايا العصبية DRG في أسلوب لدينا ، بعد 72 ساعة FUDR العلاج ، ونقاء من الخلايا العصبية DRG سيصل عالية مثل 99 ٪ في غضون 6 أيام ، morphologies فريدة من نوعها والتي ترتفع فيها كثافة نمو neurite (الشكل 3 الشكل 4) : DRG الخلايا العصبية الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلية الدبقية والخلايا العصبية coculture : DRG الخلايا العصبية الالتصاق وثمرة neurite حدث بسهولة على الخلايا الدبقية في غضون 4 ساعات بعد الغرس والملاحظات بعناية أظهرت أن تأثرت التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite بواسطة الخلية الدبقية المجموعات السكانية الفرعية الخاصة التي شكلت الأساسات نمط النمو ، يمكن التعرف بسهولة على هذا تحت المجهر النقيض من مرحلة وكيمياء سيتولوجية مناعية (الشكل 5 الشكل 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مورفولوجيا الخلايا الدبقية متموجة. كانت مطلية الخلايا الدبقية القشرية على ساترة المغلفة متعدد الليزين وتربيتها لمدة 20 يوما ، لاحظ نمط النمو مختلفة من الخلايا الدبقية ، الخلايا على الجانب الأيسر رتبت بطريقة المشعة. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الخلايا الدبقية متموجة صفها الدبقية الضد لييفي الحمضية (GFAP) البروتين. ملاحظة الترتيب يشع من الخلايا (الحمراء) GFAP إيجابي على الجانب الأيمن. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. نمت الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في المختبر من دون علاج FUDR. الخلايا الملوثة شكلت خلفية DRG الخلايا العصبية &quot;. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. نمت الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في المختبر بعد العلاج FUDR. تم القضاء على الخلايا الخلفية تلويث تماما. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية المزروعة في الخلايا الدبقية ، وقد تحول دون التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite على خلايا تشع رتبت ومحدودة على الخلايا الدبقية الجانب الأيمن. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. وكان العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية المتزايدة على الخلايا الدبقية التي المسمى neurofilament الأضداد ، وقد تحول دون وneurite (الأخضر) على الترتيب يشع الخلايا الدبقية الجانب الأيسر ومحدودة على الجانب الأيمن ، وصفت جميع الخلايا الدبقية التي الضد GFAP (الحمراء).

<ol>
	<li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury:+time+to+move?.">Spinal cord injury: time to move?.</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li><li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology.">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia.">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li><li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism.">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li><li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination.">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد صمم هذا البروتوكول التجربة للوصول إلى هدفين لدراسة الخلايا الدبقية ، وتأثير عدم التجانس نجمية خصوصا على التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite. وكان الهدف الأول هو الحفاظ على تجانس نجمية قدر الإمكان ، في هذه التجربة ، مختلطة متموجة ثقافة الخلية الدبقية النجمية أغنت ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM(high glucose)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10313-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11415-114</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-077</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4832</td>
<td>culture grade</td>
</tr>
<tr>
<td>NGF(2.5S)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 supplyment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab24575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method

في الجهاز العصبي المركزي لجميع الثدييات ، المحاوير قطعت بعد اصابة غير قادر على تجديد لأهدافها الأصلية والانتعاش وظيفية سيئة للغاية 1. فشل تجديد محور عصبي هو نتيجة تضافر عوامل عدة من بينها البيئة الخلايا الدبقية معادية ، المثبطة الميلين جزيئات ذات الصلة ، وانخفضت القدرة الذاتية على التجدد الخلايا العصبية 2. النجمية هي الأكثر الغالب نوع من الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي وتلعب دورا هاما في وظائف محوار تحت علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الظروف 3. على النقيض من oligodendrocytes مثلي ، النجمية هي خلية السكان غير متجانسة تتألف من قبل مجموعات سكانية فرعية نجمية مختلفة مع morphologies متنوعة والتعبير الجيني 4. الأهمية الفنية لهذا التباين ، مثل تأثيرها على النمو المحور ، غير معروفة الى حد كبير. لدراسة الخلايا الدبقية ، وخصوصا وظيفة نجمية عدم التجانس في سلوك الخلايا العصبية ، التي أنشئت لدينا طريقة جديدة من خلال المشاركة في استنبات الخلايا العصبية المنقى الظهرية عالية العقد الجذرية مع الخلايا الدبقية التي تم الحصول عليها من القشرة الفئران. بواسطة هذه التقنية ، تمكنا من مقارنة مباشرة التصاق الخلايا العصبية والنمو محوار على المجموعات السكانية الفرعية النجمية المختلفة في إطار نفس الشرط. في هذا التقرير ، أن نعطي للبروتوكول مفصل لهذا الأسلوب لعزل الخلايا النجمية والثقافة ، والعزلة الجذرية الظهرية العقد العصبية وتنقيتها ، وشارك في ثقافة DRG الخلايا العصبية مع الخلايا النجمية. ويمكن أيضا هذا الأسلوب أن تمتد إلى مناطق أخرى من الدماغ لدراسة التفاعل الخلوية أو إقليمية محددة بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

Watch this Scientific Journal Video about Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method at JoVE.com

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

في هذا البروتوكول ، وصفت لنا طريقة جديدة لدراسة تأثير عدم التجانس الخلايا الدبقية على النمو مع محوار<em&gt; في المختبر</em&gt; شارك في ثقافة النظام. وكانت الفئران مثقف الخلايا الدبقية القشرية للالتقاء وcocultured عالي النقاء مع الفئران العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية. وتمت مقارنة تأثير مختلف الخلايا الدبقية على التصاق الخلايا العصبية والنمو محوار مباشرة في نفس الثقافة. هذا الأسلوب يوفر طريقة جديدة لدراسة الخلية مباشرة التجانس الدبقية تؤثر على التصاق الخلايا العصبية والنمو محور عصبي.

دراسة التجانس الخلية الدبقية التأثير على النمو أكسون باستخدام أسلوب جديد Coculture

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

study-glial-cell-heterogeneity-influence-on-axon-growth-using-new

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Views.  Cedars Sinai Medical Center, UCLA. في هذا البروتوكول ، وصفت لنا طريقة جديدة لدراسة تأثير عدم التجانس الخلايا الدبقية على النمو مع محوار في المختبر شارك في ثقافة النظام. وكانت الفئران مثقف الخلايا الدبقية القشرية للالتقاء وcocultured عالي النقاء مع الفئران العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصب...

Video: Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

وهناك طريقة لجعل حج القحف على بطني من الجمجمة الوليد القوارض

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الزحف السلوك

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

استخدام التصوير المقطعي التماسك البصري والاستجابة أوبتوكينيتيك كقراءات النظام المرئي الهيكلية والوظيفية في الفئران والجرذان

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...