מחקר זה נתמך על ידי FMMU חדש למציאת הקרן באופן חלקי במימון NIH.

1. תא גליה תרבות ותאי גלייה יכול להיות מתורבת מאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית. התהליך כולו מוצג בתרשים התהליך. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="תהליך 1" /> 1 יום ציפוי תרבות צלחת coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ יבש מעוקרים עגול זכוכית coverslips ב החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט coverslips מעוקר לצלחת 24 לעקר גם תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל coverslips עם פולי-ליזין דגירה למשך 2 שעות תחת טמפרטורה השורש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גם סמל תרבות צלחות באותה דרך כמו בשלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips ו 6 גם צלחת תרבות פעמיים עם מים מזוקקים ואוויר יבש ברדס תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL בינוני DMEM (עם FBS 10%) היטב כל צלחת 24 היטב 2 מ&quot;ל היטב כל צלחת 6-היטב ולשים אותם לתוך החממה תחת תואר 37 עם 5% CO 2 </li></ol> 2 יום קליפת בידוד והתרבות תא גלייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכסה המנוע לנתיחה תזרים חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל אור UV במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רסס את כל המשטחים עם אתנול 70% ולחכות 15 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השינוי במתח: גורי חולדה הרדימי (P2-P6) על ידי היפותרמיה, ועל לערוף בבסיס מגנום framen באמצעות מספריים ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות מספריים איריס לקלף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח הקדמי והכניס אותם לתוך מדיום L15 צונן, תחת stereomicroscope, בזהירות לנקות את קרום הדורה ופיאה עם כלי דם, לבודד את קליפת לשטוף מספר פעמים עם המדיום L15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקליפה לחתיכות קטנות עם מספריים microsurgery. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.125% טריפסין-EDTA מוכן עם המדיום L15 לחתיכות קורטקס דגירה של 37 מעלות במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת גושי רקמה לתוך מדיום DMEM 20mL עם FBS של 20% שפופרת 50 מ&quot;ל, להוסיף פתרון DNase המניות 10ug/mL הריכוז הסופי, לשאוב את הפתרון הרקמה הלוך ושוב במשך 20 פעמים עם זכוכית מלוטשת אש Pasteure פיפטה, לאסוף את ההשעיה תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ההשעיה תא פעם אחת עם DMEM בינוני, מחדש תאים להשעות DMEM עם 10% FBS, לספור תאים תחת מיקרוסקופ עם תאים hemocytometer הזרע בבית 5000-10000/cm 2. שמור על תאים 37 מעלות באינקובטור 5%, שינוי מחצית 2 פעמים בינוני בשבוע. </li></ol> 2. רוט הגבי הגרעינים בידוד נוירונים, התרבות טיהור יום 1 הכינו חומר תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל coverslips מעוקר עם פולי-ליזין, coverslips לשטוף פעמיים עם לזקק מים ואוויר יבש, לשים אותם לתוך 24 גם הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני Neurobasal 100μL עם 2% ו - B27 2.5S NGF (50 נ&quot;ג / מ&quot;ל), לשים צלחת לתוך CO 37 מעלות 5% 2. </li></ol> יום 2 בודד DRGs מעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכסה המנוע לזרום באותו אופן כמו תרבית תאים גליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה בהריון (E15) על ידי מנת יתר עם ​​2 CO, הבטן עיקור על ידי אתנול 70%, עוברים מן הרחם בודדו והכניסו בינוני L15 צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד מיתרי השדרה עם הגרעינים מחובר השורש הגבי תחת stereomicroscope ולהעביר מנות 35mm עם המדיום L15 צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ההשעיה תא בודד ולשטוף פעם עם NBF בינוני (מדיום Neurobasal המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50 ng / mL)). </li></ol> יום 3 נוירונים DRG לטהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 18h-24h לאחר זריעת נוירון, להוסיף 1 FUDR מרוכז mM פתרון מניות לתרבות נוירון לריכוז סופי של 20 מיקרומטר ו נפח סופי של 200 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72h מאוחר יותר, להחליף חצי בינוני עם בינוני Neurobasal המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50ng/mL) ללא FUDR. לאחר מכן, שנה את בינונית בכל יום אחר. </li></ol> 3. נוירונים DRG Coculture עם ותאי גלייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תרבית תאים גליה הגיע המפגש (בסביבות 20 ימים לאחר זריעה), הם היו מוכנים coculture עם הנוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני הוספת נוירונים מטוהרים, גליה בינוני התאים שונו עד בינוני Neurobasal המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50 נ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים מטוהרים נאספו מבארות תרבות, יחיד ההשעיה תאים התקבלו על ידי העברת מכני באמצעות פיפטה Pasteure מלוטש אש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ספירת, נוירונים היו זורעים בבית 500/cm 2 על ותאי גלייה ומחוברות Neurobasal במדיום המכיל 2% B27 ו 2.5S NGF (50ng/mL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים הידבקות וצמיחה neurite על ותאי גלייה יכול להיות נרשמו ונותחו בנקודות זמן שונות על ידי תוכנת ניתוח תמונת immunocytochemistry סוג התא באמצעות נוגדנים ספציפיים. </li></ol> 4. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים גליה: אחרי זריעה, ותאי גלייה יהפוך ומחוברות סביב 20 ימים. תחת microsc בניגוד שלבאופ, זה היה לזהות בקלות כי אחרת subpopulations מורפולוגית תא גלייה נוצר דפוס שונים substructures הצמיחה האסטרוציטים חיובי GFAP היוו יותר מ -90% כפי שמוצג על ידי טכניקה immuocytochemisty (איור 1, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות DRG נוירונים: בשיטה שלנו, לאחר טיפול 72 שעות FUDR, את הטוהר של נוירונים DRG יגיע גבוה ככל 99% תוך 6 ימים, הנוירונים DRG הראה מורפולוגיות הייחודיים שלהם עם צמיחה neurite צפיפות גבוהה (איור 3, איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coculture גליה תא עצב: הידבקות נוירונים DRG ו תולדה neurite התרחש בקלות על ותאי גלייה בתוך 4 שעות לאחר זריעה, תצפיות זהיר הראה כי הידבקות נוירון וצמיחה neurite הושפעו subpopulations תא גלייה שהיוו מיוחד דפוס substructures צמיחה, זה יכול להיות מזוהה בקלות תחת מיקרוסקופ לעומת השלב ועל ידי immunocytochemistry (איור 5, איור 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מורפולוגיה של תאים גליה ומחוברות. ותאי גלייה קליפתיים היו מצופה על coverslip מצופה polylysine ותרבותי עבור 20 ימים, שים לב דפוס צמיחה שונים של תאים גליה, תאים בצד שמאל מסודרים בצורה הקרין. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ותאי גלייה ומחוברות שכותרתו ידי גליה נוגדן fibrillary חומצי חלבון (GFAP). הערה ההסדר קרנה של GFAP (אדום) תאים חיובי בצד ימין. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הגב הגרעינים נוירונים שורש צמח חוץ גופית ללא טיפול FUDR. התאים זיהום נוצר DRG רקע &quot;נוירונים. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הגב הגרעינים נוירונים שורש צמח במבחנה לאחר הטיפול FUDR. התאים רקע זיהום חוסלה לחלוטין. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. הגב בגרעיני הבסיס נוירונים ותאי גלייה גדל על. נוירונים הידבקות וצמיחה neurite היו עצורים על תאים מסודרים הקרין ומוגבל על תאים בצד ימין גליה. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. הגב בגרעיני הבסיס נוירונים ותאי גלייה הגוברת על ידי נוגדן הנקרא neurofilament. Neurite (ירוק) היו עצורים על תאים מסודרים הקרין הצד השמאלי גליה ומוגבלת בצד ימין, כל התאים גליה תויגו על ידי נוגדן GFAP (אדום).

<ol>
	<li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury:+time+to+move?.">Spinal cord injury: time to move?.</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li><li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology.">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia.">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li><li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism.">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li><li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination.">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול הניסוי תוכנן להגיע שתי מטרות ללמוד ותאי גלייה, השפעה ההטרוגניות של astrocyte במיוחד על הידבקות נוירון וצמיחה neurite. המטרה הראשונה היתה לשמור על ההטרוגניות astrocyte ככל האפשר, בניסוי הזה, ומחוברות גליה תרבית תאים האסטרוציטים מועשר היה מעורב תרבות ראשוני ללא כל טיפול ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM(high glucose)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10313-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11415-114</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-077</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4832</td>
<td>culture grade</td>
</tr>
<tr>
<td>NGF(2.5S)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 supplyment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab24575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method

במערכת העצבים המרכזית של כל היונקים, אקסונים ניתק לאחר פציעה אינם מסוגלים להתחדש ליעדים המקוריים שלהם התאוששות תפקודית ירודה מאוד 1. הכישלון של התחדשות האקסון הוא תוצאה משולבת של מספר גורמים, כולל סביבה עוינת תא גלייה, מעכבות מולקולות הקשורות המיאלין וירידה יכולת ההתחדשות הפנימית נוירון 2. האסטרוציטים הם סוג השולט ביותר תא גליה במערכת העצבים המרכזית לשחק תפקיד חשוב בפונקציות האקסון תחת הפיזיולוגיה והפתולוגיה התנאים 3. בניגוד הומולוגיים oligodendrocytes, האסטרוציטים הם אוכלוסייה הטרוגנית תא שהלחין subpopulations astrocyte מורפולוגיות שונות עם מגוון ביטוי גנים 4. משמעות תפקודית של ההטרוגניות הזאת, כמו השפעות על צמיחה האקסון, אינו ידוע ברובו. כדי לחקור את תא גלייה, בעיקר פונקציה של ההטרוגניות astrocyte בהתנהגות נוירון, הקמנו שיטה חדשה על ידי שיתוף culturing גבוה מטוהרים הגב הגרעינים נוירונים ותאי גלייה עם השורש המתקבל בקליפת חולדה. על ידי טכניקה זו, הצלחנו להשוות ישירות הידבקות נוירון וצמיחה האקסון על subpopulations האסטרוציטים שונים בתנאי אותו. בדו&quot;ח זה, אנו נותנים את פרוטוקול מפורט של שיטה זו של בידוד האסטרוציטים ותרבות, השורש הגבי הגרעינים נוירונים בידוד וטיהור, ואת שיתוף התרבות של נוירונים עם DRG האסטרוציטים. שיטה זו יכולה גם להיות מורחבת לאזורים אחרים במוח ללמוד אינטראקציה ספציפית הסלולר או אזורית בין נוירונים ותאי גלייה.

Watch this Scientific Journal Video about Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method at JoVE.com

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

בפרוטוקול זה, אנו תיאר שיטה חדשה ללמוד את השפעת ההטרוגניות תא גליה על צמיחת האקסון עם<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף התרבות המערכת. קליפת המוח עכברוש ותאי גלייה היו בתרבית כדי מפגש ו cocultured עם מטוהרים מאוד הגבי עכברוש שורש עצב הגרעינים. תאים שונים להשפיע על גליה הידבקות נוירונים וצמיחה האקסון הושווה ישירות באותה תרבות. שיטה זו מספקת דרך חדשה ישירות ללמוד תא גלייה ההטרוגניות השפעה על הידבקות נוירון וצמיחה האקסון.

תא גלייה לימוד הטרוגניות השפעה על הצמיחה אקסון בשיטה Coculture חדש

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

study-glial-cell-heterogeneity-influence-on-axon-growth-using-new

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Views.  Cedars Sinai Medical Center, UCLA. בפרוטוקול זה, אנו תיאר שיטה חדשה ללמוד את השפעת ההטרוגניות תא גליה על צמיחת האקסון עם במבחנה שיתוף התרבות המערכת. קליפת המוח עכברוש ותאי גלייה היו בתרבית כדי מפגש ו cocultured עם מטוהרים מאוד הגבי עכברוש שורש עצב הגרעינים. תאים שונים להשפיע על גליה הידבקות נו?...

Video: Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

שיטה להרוויח Craniotomy על גולגולת הגחון של מכרסמים ילוד

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה Optokinetic כמו המפרט מבנית ופונקציונליים מערכת הראייה של עכברים וחולדות

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

שיטה לניתוח שחזור תלת מימד ומציאות וירטואלית של תאים גליאל ונוירוונאליות

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...