دعمت باري بيدرو دي لا مازا المؤسسة هذا العمل.

1) الإدارة من داخل المعدة روتنون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الحجم الكلي للروتينون / مركبة الحل المطلوب. في هذه الحالة 0.01 مل جرام من وزن الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهمة حقنة 1 مل مع حجم المحسوبة سابقا من حل روتينون (0.625 ملغ / مل روتينون ، كربوكسي ميثيل سلولوز 4 ٪ و 1.25 ٪ كلوروفورم) أو حل السيارة (كربوكسي ميثيل سلولوز 4 ٪ و 1.25 ٪ كلوروفورم). في هذه الحالة كان مطابقا لجرعة روتينون 5 ملغم / كغم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الماوس ، وعقد ذيل الفأر مع يد واحدة ، وتمتد على جلد الرقبة بسحبه مع أصابع الأولين من جهة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ثابتة الرأس بين أصابع اثنين العجاف ضد كف اليد وتحويلها رأسا على عقب. الإصلاح الذيل باستخدام الأصابع الرابع والخامس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الرأس نحو الظهر ، اضغط على الحنك لفتح فم الفأر. أعرض بلطف بالتزقيم في الفم. من المهم استخدام إبرة بالتزقيم وليس إبرة العادية. ببطء ، نقل بالتزقيم في اتجاه المعدة بعيدا بما فيه الكفاية. هذا سوف تجنب الحصول على المواد في الرئتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة حل روتينون أو مركبة بالضغط بلطف صمة. عند الانتهاء ، استخراج ببطء تسمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ظهر الحيوان في قفص آخر حتى تتم جميع الحيوانات من القفص. </li></ol> إجراءات Immunostaining 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج ، وتخدير الفئران باستخدام Ketamin 100 ملغم / كغم اوند Xylazin IP 10 ملغم / كغم وperfused intracardially لامتصاص العرق مع 4 ٪ في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم استخراج الشجاعة من قبل التشريح ، ووضعها في السكروز 15 ٪ بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يتم نقل الأنسجة لالسكروز 30 ٪ وحضنت مرة أخرى بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع النسيج في تك النسيج وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ناظم البرد ، يتم نقل 20 ميكرون الأمعاء المقاطع العرضية على الشرائح Superfrost. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحجب وimmunostaining الإجراءات باستخدام أضداد βIII - تويولين ومعاداة synuclein ألفا ، ثم يتم تنفيذها كما هو موضح سابقا 9. </li></ol> 3) تحليل صورة الفا synuclein إدراج فمن المستحسن أن يجهل شخص خارجي المنشأ الصور &#39;ينفذ التحليل. لذا ، ينبغي تدوين البيانات. أجري تحليل الصور باستخدام برنامج فيجي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف صورة مبائر. ثم ، وتقسيم القنوات بحيث يكون من الممكن العمل على كل قناة بشكل مستقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق هذه القنوات التي لن يكون استخدام وحدد تحليل&gt; ضبط مقياس وتعيين حجم بكسل إلى 1. تعيين المسافة المعروفة إلى 0.13 (وهذا يتوقف على الهدف والقرار المستخدمة) وانقر على الصعيد العالمي. سيتم الآن حجم الصورة ستكون معروضة في ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد قناة ألفا synuclein وحدد العقدة ، تأكد من أن اختيار يرفق العقدة في جميع الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط&gt; صورة مكررة لتكرار الصورة. مع العقدة المحددة ، ولن يكون صورة مكررة من حجم العقدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصحافة تحرير&gt; خارج صافية. سيكون جزء من الصورة خارج المنطقة المحددة تصبح سوداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الصورة مرة أخرى لتحديد الخطوات في وقت لاحق مدى الإجراء ذهب. لا ينبغي أن الصور التي تحتوي على إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء الخلفية لاستخدامها في تحليل الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر صورة&gt; عتبة&gt; ضبط ثم حدد MaxEntropy. ثم تنتقل عبر الشرائح في صورة اقتصاص ونسخة أصلية واحدة لضمان أن الإجراءات سارت على ما يرام. عتبة التدهور الحتمي تحديد مستوى كثافة إشارة على أساس الصورة والرسم البياني فقط تلك بكسل مع سيتم عرض كثافات أعلى من هذه العتبة في أكثر من صورة سوداء بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عملية ، ثم انقر على السلس. هذه الخطوة تحول الحواف pixeled الصور في حواف ناعمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عملية ، ثم انقر على الثنائي ، وجعل اختيار الثنائي. سيتم عرض صورته كرجل أسود على صورة بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة مكررة لتنفيذ الخطوة التالية على الصورة تتكرر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على تحليل&gt; تحليل الجزيئات. ثم حدد عرض : الخطوط العريضة وانقر على تلخيص. يجب أن يكون بقية الأوراق في إعدادات الافتراضية. تسلم هذه الوظيفة العدد الإجمالي للبكسل مع إشارة وتلك التي يتم تجميعها معا. وذكرت والسطحية مجموعه بكسل مع الإشارة بالإضافة إلى عدد من مجموعات من بكسل وحجم متوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن وحدد أكبر شريحة أن يضبط بشكل جيد. وسيتم وضع علامة على شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ جدول البيانات مع سطح ألفا synuclein إجمالي عدد الادراج وحجم الجسيمات يعني. لصق البيانات في جداول اكسل أو المشروح في أماكن أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى فيجي والعثور على شريحة المحددة سابقا في قناة β - تويولين ، وتحديده. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد منطقة العقدة وانقر على تحليل ثم حدد التدبير. وسوف يظهر جدول آخر يبينمجموع سطح العقدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البيانات من الجدول إلى ورقة التفوق بالقرب من قياس ألفا synuclein أو نسخ عليه في أماكن أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إكسل ، تقسيم معلمات مختلفة تم الحصول عليها في قياس ألفا synuclein من عقدة للحصول على سطح إجمالي عدد السطحية وإدراج ألفا synuclein تطبيع حسب حجم العقدة. </li></ol> نتائج الممثل 4) عندما يتم تنفيذ بروتوكول إدارة بالتزقيم صحيح مضايقات للحيوان ضئيلة. العلاج باستخدام هذا التركيز من روتينون تمكن من التأثير المحلي روتينون على ENS دون مستويات روتينون في الدم وتثبيط أي مجمع العضلات أو الدماغ الميتوكوندريا أنا حتى بعد 1.5 شهر من العلاج (انظر الشكل 1) إذا أجري تحليل الصور بشكل صحيح وينبغي إجراء تحليل دقيق للنمط ألفا synuclein يكون ممكنا. انه يعطي بيانات موثوقة عن المبلغ الإجمالي للsynuclein ألفا (سطح الإجمالي) ، ألفا synuclein نمط في الخلية (عدد الادراج) وجود شوائب synuclein ألفا (حجم مضمن) (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. علاج الخلل في المحرك روتينون الفئران دون الكشف عن روتينون في الدم أو الجهاز العصبي المركزي. قياسي ، (50 نانوغرام / مل) وchromatogram من عينات دماغ الفئران ملغم / كغم من 20 ، 10 و 5 المعالجة. B و C ، وتحديد مستويات روتينون في الدم (B) والجهاز العصبي المركزي (C). باء ، ومستويات الدم 1 و 2 و 3 ساعات بعد تلقي العلاج. وقسمت الفئران إلى ثلاث مجموعات (ن = 3) وتعامل مع 2.5 و 10 و 5 و 20 ملغم / كغم روتينون (ن = 3) ، تم استخراج 300 ميكرولتر من الدم 1 و 2 و 3 ساعات بعد تناوله روتينون والمجمعة معا من أجل HPLC تحليل جيم ، عولجت فئران لمدة أسبوع مرة واحدة في اليوم مع 5 (ن = 3) ، 10 (ن = 3) و 20 (ن = 1) ملغم / كغم انتزعت روتينون والمخ والدماغ 1 و 2 بعد ساعات مشاركة الإدارة والتطوير التي أعدت لهبلك. التحليل ، وأنا مجمع الميتوكوندريا النشاط في الدماغ والعضلات عينات من الفئران التي عولجت 1.5 شهر. <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. روتينون تدار محليا يدفع ألفا synuclein الفسفرة ، وتراكم والتجميع مع دباق في العقد ENS (الحانات نطاق 20 ميكرون). A ، B ، C ، ومكافحة βIII - تويولين ألفا synuclein وتلوين دابي في العفج (B) والدقاق ( A ، C) المقاطع. السهم في باء ، 1.5 شهر يسببها العلاج منها زيادة ألفا synuclein نمط نقطي داخل الجهاز العصبي المعوي العقد بالمقارنة مع الضوابط 3 أشهر (A). السهم في C ، و 3 أشهر من تشكيل يسببها العلاج مشتملات أكبر ألفا synuclein (س&gt; 6 ميكرون). D ، تلوين المناعي استخدام الألغام المضادة للsynuclein ألفا ، S ثيوفلافين ودابي. السهم في التطوير ، فقط لمدة 3 أشهر وأظهرت الفئران التي عولجت هذه التراكمات تجميع أكبر ألفا synuclein. E ، E &#39;، E&#39;&#39; التحليل الكمي صورة الخطوات. E ، immunostained مثال الصورة المستخدمة في القياس الكمي مبديا العقدة ENS ضد synuclein ألفا تظهر مشتملات مختلفة. E &#39;، مثال على صورة تم الحصول عليها بعد بروتوكول تحليل الصور. E&#39;&#39; ، التداخل بين بعض الادراج الأصلي (الأخضر) ، والحصول على تمثيل بعد تنفيذ البروتوكول (الخطوط الصفراء). FG ، القياس الكمي لهذه التجربة هو مبين في وقدم ميلان باستخدام التجزئة التلقائية وطرق thresholding الكون مقرا لها. واحد النجمة ، P &lt;0.05 ، ومضاعفة النجمة ، P &lt;0.01. F ، كل عمود يمثل مجموع ألفا synuclein سطح / سطح العقدة. G ، كل عمود يمثل مجموع عدد ألفا synuclein مشتملات / سطح العقدة. كل الرسوم البيانية تظهر يعني ± SEM

<ol>
	<li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner's+and+Auerbach's+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson's+disease-related+brain+pathology.">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li><li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li><li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism.">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li><li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+lesions+in+dorsal+horn+layer+I,+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons.">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li><li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+in+the+development+of+Parkinson's+disease-related+pathology.">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li><li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+risk+of+Parkinson's+disease+with+exposure+to+pesticides,+farming,+well+water,+and+rural+living.">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li><li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals.">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li><li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson's+disease.">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li><li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+Parkinson's+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice.">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li><li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson's+disease.">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li><li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-induced+models+of+Parkinson's+disease.">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li><li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate,+a+chemical+chaperone.">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li></ol>

فرانسيسكو عموم Montojo لديه طلب البراءة في انتظار لهذا النموذج الحيواني (رقم الطلب معاهدة التعاون بشأن البراءات / EP 2009/005688).

وقد تم داخل المعدة الادارة تؤديها سابقا 12. ومع ذلك ، وفقا لمخطوطة Inden ، وكانت تدار روتينون المذابة في 0.5 ٪ كربوكسي ميثيل سلولوز ملح الصوديوم (نظم إدارة المحتوى) وحدها. روتينون هو مادة عالية liphophylic. لذا ، لا يمكن أن يتم حله في روتينون نظم إدارة المحتوى وحدها 0.5 ٪ ، وس?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rotenone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA-Aldrich</td>
<td>R8875</td>
<td>Germany</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Roth</td>
<td>3313.1</td>
<td>Germany</td>
</tr>
<tr>
<td>Carboxymethylcellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA-Aldrich</td>
<td>C5678</td>
<td>Germany</td>
</tr>
<tr>
<td>Gavage 1,2 mm x 60 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Switzerland</td>
</tr>
<tr>
<td>LSM 510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss Microscopes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FIJI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://pacific.mpi-cbg.de</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

oral administration of rotenone using a gavage and image analysis of alpha-synuclein inclusions in the enteric nervous system

في مرضى باركنسون (PD) المرض ، وعلم الأمراض المرتبطة يتبع نمطا مميزة تشمل في جملة أمور على الجهاز العصبي المعوي (ENS) 1،2 ، والبصلة الشمية (OB) ، النواة الحركية الظهرية من 3 (DMV) المبهم ، والمتوسطي 4 نواة الحبل الشوكي ، والمادة السوداء ، وتوفير الأساس لانطلاق neuropathological من المرض 4،5. وENS وOB هم الأكثر تعرضا للهياكل العصبي ومنها أول من يتأثر. ومن المثير للاهتمام ، وقد ارتبط التعرض للمبيدات لPD 6-8. هنا نعرض بالتفصيل طريقتين المستخدمة في دراستنا السابقة 9. من أجل تحليل آثار روتينون تعمل محليا على ENS ، ونحن يديرها روتينون باستخدام أنبوب تغذية لمدة عام واحد الفئران C57/BL6 القديمة. روتينون هو المبيدات المستخدمة على نطاق واسع أن يكبح بقوة مجمع الميتوكوندريا أنا 10. فمن lipophylic للغاية ، واستوعبت ضعيفا في الجهاز الهضمي 11. وأظهرت نتائجنا ان الادارة من 5 ملغم / كغم من روتينون لم تمنع مجمع الميتوكوندريا أنا النشاط في العضلات أو الدماغ. وهكذا ، مما يشير إلى أن استخدام أسلوب الإدارة لدينا روتينون لم يعبر النظام كبدي بوابي وكان يتصرف فقط على ENS. هنا نعرض طريقة لإدارة مبيدات الآفات باستخدام بالتزقيم وبروتوكول تحليل الصور المستخدمة لتحليل آثار المبيدات في تراكم synuclein ألفا في ENS. الجزء الأول يوضح طريقة تسمح إدارة المبيدات داخل المعدة (روتينون) في تركيز دقيق المطلوب. الأسلوب الثاني يظهر تحليل الصور شبه التلقائي لتحليل بروتوكول ألفا synuclein تراكم في ENS باستخدام برمجيات تحليل الصور.

Watch this Scientific Journal Video about Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System at JoVE.com

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

وقد ارتبط مرض باركنسون إلى التعرض للمبيدات الحشرية. هنا نعرض طريقة لتقديم المبيدات الحشرية باستخدام أنبوب إلى المعدة في التركيز المطلوب وطريقة لتحليل أثرها في تراكم synuclein ألفا في الجهاز العصبي المعوي.

الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

oral-administration-rotenone-using-gavage-image-analysis-alpha

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.9K Views.  Technische Universität Dresden. وقد ارتبط مرض باركنسون إلى التعرض للمبيدات الحشرية. هنا نعرض طريقة لتقديم المبيدات الحشرية باستخدام أنبوب إلى المعدة في التركيز المطلوب وطريقة لتحليل أثرها في تراكم synuclein ألفا في الجهاز العصبي المعوي.

Video: Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

إدارة خارجية من المجاميع المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين إلى الخلايا العصبية الأولية كنموذج خلية قوية لتشكيل ييفات

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model Parkinson&#39;s disease synucleinopathy and nigrostriatal degeneration. The standardization of &#945;-syn PFF generation and in vivo application is critical in order to ensure consistent, robust &#945;-syn pathology. Here, we present a detailed protocol for the generation of fibrils from monomeric &#945;-syn, post-fibrilization quality control steps, and suggested parameters for successful neurosurgical injection of &#945;-syn PFFs into rats or mice. Starting with monomeric &#945;-syn, fibrilization occurs over a 7-day incubation period while shaking at optimal buffer conditions, concentration, and temperature. Post-fibrilization quality control is assessed by the presence of pelletable fibrils via sedimentation assay, the formation of amyloid conformation in the fibrils with a thioflavin T assay, and electron microscopic visualization of the fibrils. Whereas successful validation using these assays is necessary for success, they are not sufficient to guarantee PFFs will seed &#945;-syn inclusions in neurons, as such aggregation activity of each PFF batch should be tested in cell culture or in pilot animal cohorts. Prior to use, PFFs must be sonicated under precisely standardized conditions, followed by examination using electron microscopy or dynamic light scattering to confirm fibril lengths are within optimal size range, with an average length of 50 nm. PFFs can then be added to cell culture media or used in animals. Pathology detectable by immunostaining for phosphorylated &#945;-syn (psyn; serine 129) is apparent days or weeks later in cell culture and rodent models, respectively.&#160;

The goal of this article is to outline the steps required for the generation of fibrils from monomeric alpha-synuclein, subsequent quality control, and use of the preformed fibrils in vivo.

جيل من الورم الليفي الفا Synuclein المكونة مسبقا من مونومرات واستخدامها في فيفو

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...