O Pedro Barrie de la Maza Fundação apoiaram este trabalho.

1) Administração Intragástrico de rotenona <ol><li> Pesar o animal. </li><li> Calcular o volume total de rotenona / veículo solução necessária. Neste caso 0,01 ml por grama do peso do animal. </li><li> Cobrar uma seringa de 1 mL com o volume calculado anteriormente de solução de rotenona (0,625 rotenona mg / mL, carboximetilcelulose 4% e 1,25% clorofórmio) ou solução veículo (carboximetilcelulose 4% e 1,25% clorofórmio). Neste caso, corresponde a uma dose rotenona 5 mg / kg. </li><li> Pegue o mouse e, segurando o rabo do rato com uma mão, esticar a pele do pescoço, puxando-a com os dois primeiros dedos da outra mão. </li><li> Uma vez que a cabeça é fixa entre os dois dedos, magra contra a palma da mão e transformá-lo de cabeça para baixo. Fixar a cauda usando o quarto e quinto dedos. </li><li> Mantendo a cabeça para trás, pressione o palato a se abrirem a boca do rato. Suavemente introduzir a sonda na boca. É importante usar uma agulha gavagem e não uma agulha regular. Lentamente, mova o gavage na direção do estômago longe o suficiente. Isso irá evitar o material ficar nos pulmões. </li><li> Administrar a solução rotenona ou veículo pressionando suavemente o êmbolo. Quando concluído, lentamente extrair o gavage. </li><li> Coloque o animal em volta outra gaiola até que todos os animais de uma gaiola é feito. </li></ol> 2) Procedimentos imunocoloração <ol><li> Após o tratamento, os ratos são anestesiados com cetamina 100 mg / kg ip und Xylasina 10 mg / kg e intracardially perfundidos com paraformaldeído 4% em PBS. </li><li> A coragem são, então, extraídos por dissecção, e colocados em sacarose 15% durante a noite. No dia seguinte, o tecido é transferido para 30% de sacarose e incubadas novamente durante a noite a 4 ° C. </li><li> O tecido é então colocado em Tissue-tek e armazenados em um freezer -80 ° C até o uso. </li><li> Utilizando um criostato, 20 micron intestino seções transversais são transferidos para slides Superfrost. </li><li> Bloqueio e imunocoloração procedimentos usando anticorpos anti-tubulina βIII e anti-alfa-sinucleína são então realizados como descrito anteriormente 9. </li></ol> 3) Análise de Imagem alfa-sinucleína Inclusão Recomenda-se que uma pessoa externa inconscientes de origem images &#39;executa a análise. Portanto, os dados deve ser codificada. Análise de imagens foi realizada utilizando software FIJI. <ol><li> Abra o arquivo de imagem confocal. Então, dividir os canais de modo que é possível trabalhar em cada canal independentemente. </li><li> Feche os canais que não vai ser usado e selecione Análise&gt; Definir Escala e definir o tamanho do pixel a 1. Definir a distância conhecida a 0,13 (isso vai depender do objetivo e da resolução utilizada) e clique em global. O tamanho da imagem será mostrada em microns. </li><li> Selecione alfa-sinucleína canal e selecione gânglio, certifique-se que a seleção inclui o gânglio em todas as fatias. </li><li> Image Press&gt; Duplicar para duplicar a imagem. Com o gânglio selecionado, apenas uma imagem do tamanho do gânglio será duplicada. </li><li> Prima Editar&gt; Limpar Fora. A parte da imagem fora da região selecionada se tornará preto. </li><li> Duplique a imagem novamente para determinar em etapas posteriores quão bem o procedimento foi. Imagens que tenham um sinal de alta relação ao ruído de fundo não deve ser usado para análise de imagem. </li><li> Selecione Image&gt; Adjust&gt; Limiar e selecione MaxEntropy. Em seguida, passar as fatias na imagem cortada e original para garantir que o processo correu bem. O limite entrópico seleciona um nível de intensidade de sinal baseado no histograma da imagem e somente aqueles pixels com intensidades superiores a este limite será exibido em uma imagem branca sobre preto. </li><li> Selecione Processar, em seguida, clique em Smooth. Esta etapa transforma as bordas pixeled das imagens em bordas lisas. </li><li> Selecione Processar, em seguida, clique em binário, e escolha a opção Make Binary. A imagem será exibida como um negro sobre a imagem branca. </li><li> Duplicate imagem para realizar o próximo passo na imagem duplicada. </li><li> Clique em Analisar&gt; Analisar partículas. Em seguida, selecione Show: Esboços e clique em Resumir. O resto das configurações deve ser em folhas padrão. Esta função reconhece o número total de pixels com um sinal e aqueles que são agrupados. A superfície total de pixels com sinal mais o número de grupos de pixels eo tamanho médio são relatados. </li><li> Comparar e selecionar a maior fatia que se ajusta bem. A fatia será marcada. </li><li> Cópia da tabela de dados com a superfície alfa-sinucleína total, o número de inclusões e do tamanho médio de partícula. Colar os dados em uma planilha excel ou anotado em outro lugar. </li><li> Retornar para FIJI e encontrar a fatia selecionada anteriormente no canal β-tubulina, e selecioná-lo. </li><li> Selecione área de gânglio e clique em Analisar em seguida, selecione Medida. Outra tabela é exibida com osuperfície total do gânglio. </li><li> Extrair os dados da tabela para a folha de excel perto da medição alfa-sinucleína ou copiá-lo para baixo em outro lugar. </li><li> Usando excel, divide os diferentes parâmetros obtidos na medição alfa-sinucleína pela superfície gânglio para obter total de alfa-sinucleína número superfície e inclusão normalizado pelo tamanho do gânglio. </li></ol> 4) Resultados Representante Quando o protocolo de administração gavage é realizado corretamente os inconvenientes para o animal são mínimas. Tratamento com esta concentração de rotenona permite um efeito local da rotenona na ENS, sem níveis de rotenona em sangue e sem inibição dos músculos e cérebro complexo mitocondrial que, mesmo após 1,5 meses de tratamento (ver Figura 1). Se a análise de imagem é realizado corretamente uma análise rigorosa da alfa-sinucleína padrão deve ser possível. Dá dados confiáveis ​​sobre a quantidade total de alfa-sinucleína (superfície total), alfa-sinucleína padrão no celular (número de inclusões) ea presença de alfa-sinucleína inclusões (tamanho inclusão) (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Disfunção motora em camundongos tratados com rotenona sem detecção de rotenona no sangue ou no CNS. Um padrão, (50 ng / mL) e cromatograma a partir de amostras do cérebro de 20, 10 e 5 mg / kg camundongos tratados. B e C, quantificação dos níveis de rotenona no sangue (B) e sistema nervoso central (C). B, os níveis sanguíneos 1 , 2 e 3 horas após o tratamento. Camundongos foram divididos em três grupos (n = 3) e tratados com 2,5, 5, 10 e 20 mg / kg rotenona (n = 3), 300 mL de sangue foi extraído horas 1, 2 e 3 após a administração de rotenona e agrupados para HPLC análise. C, os ratos foram tratados durante uma semana uma vez por dia com 5 (n = 3), 10 (n = 3) e 20 (n = 1) mg / kg rotenona cérebro e tronco cerebral foram extraídos 1 e 2 horas depois última administração e preparados para análise por HPLC. D, Complexo I mitocondrial atividade muscular e cerebral amostras de 1,5 meses camundongos tratados. <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rotenona administrado localmente induz fosforilação alfa-sinucleína, acumulação e agregação com gliose nos gânglios ENS. (Barras de escala de 20 mm). A, B, C, anti-tubulina βIII, alfa-sinucleína ea coloração DAPI no duodeno (B) e íleo ( A, C) seções. Seta na B, 1,5 meses de tratamento induziu um padrão de aumento da alfa-sinucleína punctate dentro gânglios do sistema nervoso entérico, quando comparado a 3 meses controles (A). Seta no C, 3 meses de tratamento formação induzida de maior alfa-sinucleína inclusões (ø&gt; 6 mm). D, imunofluorescência usando anti-alfa-sinucleína, Thioflavine S e DAPI. Seta no D, apenas três meses camundongos tratados mostraram maior agregação desses alfa-sinucleína acumulações. E, E &#39;, E&#39;&#39;, imagem passos análise e quantificação. E, exemplo de imagem usada na quantificação mostrando um gânglio ENS imunocoradas contra alfa-sinucleína mostrando inclusões diferentes. E &#39;, exemplo de imagem obtida após o protocolo de análise de imagem. E&#39;&#39;, sobreposição entre algumas das inclusões original (verde) e da representação obtida após a realização do protocolo (linhas amarelas). FG, a quantificação do experimento mostrado na AC foi feito usando a segmentação automática e métodos baseados em entropia thresholding. Um único asterisco, F P &lt;0,05, e dê um duplo asterisco, P &lt;0,01., Cada coluna representa total de alfa-sinucleína superfície superfície / ganglionares. G, cada coluna representa o número total de alfa-sinucleína inclusões / superfície ganglionares. Todos os gráficos mostram média ± EPM

<ol>
	<li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner's+and+Auerbach's+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson's+disease-related+brain+pathology.">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li><li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li><li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism.">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li><li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+lesions+in+dorsal+horn+layer+I,+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons.">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li><li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+in+the+development+of+Parkinson's+disease-related+pathology.">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li><li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+risk+of+Parkinson's+disease+with+exposure+to+pesticides,+farming,+well+water,+and+rural+living.">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li><li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals.">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li><li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson's+disease.">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li><li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+Parkinson's+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice.">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li><li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson's+disease.">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li><li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-induced+models+of+Parkinson's+disease.">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li><li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate,+a+chemical+chaperone.">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li></ol>

Francisco Pan-Montojo tem um pedido de patente pendente para este modelo animal (número de aplicativos PCT / PE 2009/005688).

Administração intragástrica foi previamente realizado 12. No entanto, segundo manuscrito Inden, a rotenona foi administrada de sal dissolvido em 0,5% de carboximetilcelulose de sódio (CMSS) sozinho. Rotenona é uma substância de alto liphophylic. Portanto, rotenona não pode ser dissolvido em CMSS 0,5% sozinho e se irá precipitar feito. O uso de clorofórmio cria uma suspensão rotenona distribuída uniformemente evitando a precipitação. Além disso, devido às concentrações mais elevadas do pestici...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rotenone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA-Aldrich</td>
<td>R8875</td>
<td>Germany</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Roth</td>
<td>3313.1</td>
<td>Germany</td>
</tr>
<tr>
<td>Carboxymethylcellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA-Aldrich</td>
<td>C5678</td>
<td>Germany</td>
</tr>
<tr>
<td>Gavage 1,2 mm x 60 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Switzerland</td>
</tr>
<tr>
<td>LSM 510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss Microscopes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FIJI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://pacific.mpi-cbg.de</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

oral administration of rotenone using a gavage and image analysis of alpha-synuclein inclusions in the enteric nervous system

Na doença de Parkinson (DP), a patologia associada segue um padrão característico, envolvendo, nomeadamente, o sistema nervoso entérico 1,2 (ENS), o bulbo olfativo (OB), o núcleo motor dorsal do vago (DMV) 3, o intermediolaterais núcleo da 4 medula espinhal e substância negra, fornecendo a base para a realização neuropatológicas da doença 4,5. A ENS e os OB são as estruturas mais expostas nervoso e os primeiros a ser afetados. Curiosamente, PD tem sido relacionada à exposição a pesticidas 6-8. Aqui nós mostramos em detalhe dois métodos usados ​​em nosso estudo anterior 9. Para analisar os efeitos da rotenona agindo localmente no ENS, nós administrados rotenona usando uma sonda de um ano de idade C57/BL6 camundongos. Rotenona é um pesticida amplamente utilizado que inibe fortemente Complexo mitocondrial I 10. É altamente lipofílica e mal absorvido no trato gastrointestinal 11. Nossos resultados mostraram que a administração de 5 mg / kg de rotenona não inibiu o complexo I mitocondrial atividade no músculo ou no cérebro. Assim, o que sugere que isso usar nosso rotenona método de administração não atravessar o sistema hepatoportal e estava atuando apenas na ENS. Aqui nós mostramos um método para administrar pesticidas usando uma sonda e do protocolo de análise de imagem utilizada para analisar os efeitos do pesticida em alfa-sinucleína acumulação na ENS. A primeira parte mostra um método que permite a administração intragástrica de pesticidas (rotenona) a uma concentração desejada preciso. O segundo método apresenta uma semi-automática de protocolo de análise de imagem para analisar acumulação de alfa-sinucleína na ENS usando um software de análise de imagem.

Watch this Scientific Journal Video about Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System at JoVE.com

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

A doença de Parkinson tem sido relacionada à exposição a pesticidas. Aqui nós mostramos um método para entregar pesticidas usando uma sonda gástrica, na concentração desejada e um método para analisar seu efeito em alfa-sinucleína acumulação no sistema nervoso entérico.

Administração oral de rotenona usando um Gavage e Análise de Imagem de Alpha-sinucleína Inclusões no sistema nervoso entérico

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

oral-administration-rotenone-using-gavage-image-analysis-alpha

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K visualizações.  Technische Universität Dresden. A doença de Parkinson tem sido relacionada à exposição a pesticidas. Aqui nós mostramos um método para entregar pesticidas usando uma sonda gástrica, na concentração desejada e um método para analisar seu efeito em alfa-sinucleína acumulação no sistema nervoso entérico.