These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

<ol>
	<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li><li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatry's+age+of+enlightenment:+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders.">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li><li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors.">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li><li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings.">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li><li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron.">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li><li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety.">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li><li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004 (2012).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories.">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to report.

الليزر وصفت مجموعة عمليات الحالية واستراتيجيات الربط متوافقة مع مجموعة واسعة من الاختبارات السلوكية القوارض. في الواقع، لقد تم استخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات السلوكية التالية، أو المصاحبة، في الجسم الحي تحفيز optogenetic التي تشمل المهام الانفعالية السلوكية، تكييف السلوك والتعلم ونماذج الذاكرة، والنوم، والإثارة، والمهام مشهي على سبيل المثال لا الحصر (انظر نيه وآخرون. 6 لإجراء استعراض شامل). لقد تغير علم البصريات الوراثي ويمكن الآن الطريقة التي يتم بها إجراء الاختبارات السلوكية التقليدية في ذلك دراسات متعددة لمدة يوم وتكون مختصرة في جلسة واحدة حيث يتم مقارنة السلوك، داخل المواضيع، خلال حقب متميزة من الضوء &#39;على&#39; مقابل &#39;قبالة &quot;5. وتجدر الإشارة، أجهزة السلوكية التي تحتوي على المداخل، أغلقت مقصورات أو أي عوائق أخرى قد يكون من الضروري تعديلها لاستيعاب مرور الألياف المربوطة. ووصف استراتيجيات الربط تصريح سيالتحفيز multaneous من الفئران متعددة من ليزر واحد. وبالتالي لا يمكن أن يتحقق عالية الإنتاجية الاختبار السلوكي optogenetic من خلال استخدام أشعة الليزر متعددة ومعدات الاختبار. عدد الحيوانات التي يمكن حفز في وقت واحد، ومع ذلك، سوف تكون محدودة بسبب أقصى قدر من السلطة الخفيفة التي يمكن تحقيقها في كل غيض من الألياف. انتاج الطاقة القصوى في غيض من الألياف يعتمد على 1) السلطة بدءا من الليزر. 2) كفاءة اقتران و3) عدد من الانشقاقات شعاع. ليزر أزرق 100 ميغاواط مع ~ 80٪ كفاءة اقتران وتصل إلى 4 انشقاقات شعاع (كما هو مبين في الشكل 4C)، متوسط ​​القوة في غيض من الألياف يمكن أن تتراوح بين 5-10 ميغاواط عند استخدام 200 ميكرون الأساسية، 0.22 NA حبال من الألياف التصحيح (ملحوظة تتوقع خسارة الإرسال من مفاصل دوارة لتكون &lt;15٪). قياس ناتج الضوء على غيض من الألياف أمر ضروري لتحديد قوة الضوء الكافية لتفعيل أوبسين كما تختلف opsins في حساسيتها للضوء، وبالتالي فإن كثافة الطاقة الضوئية (ميغاواط/ مم 2) المطلوبة لتفعيل 11. على سبيل المثال، ومستقرة خطوة وظيفة أوبسين (SSFO) بمثابة تراكم الفوتون، وبالتالي يتطلب القليل جدا من كثافة الطاقة الخفيفة لتفعيل (&lt;8 μW / مم 2) 8. قارن هذا إلى رودوبسين قناة التقليدية (ChR2) الذي يتطلب حدا أدنى من 1 ميغاواط / مم 2 للضوء لانتزاع امكانات العمل 2. ويرد الجدول 1 كمرجع سريع لirradiances ضوء الحد الأدنى المعروف المطلوبة لتفعيل opsins الأكثر شيوعا حاليا في استخدام. وأخيرا، يجب على المرء أن نعتبر أن يفرق الضوء ويمتص لأنها تنتقل من خلال أنسجة المخ مثل ما هو مطلوب مزيد من السلطة الخفيفة لهياكل الدماغ أكثر عمقا 3. مورد مفيد على الانترنت هو متاح في <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> التي سوف حساب شدة الضوء في أعماق مختلفة من خلال أنسجة المخ مع الأخذ فيحساب حجم الألياف الأساسية، والفتحة العددية، والطول الموجي للضوء المستخدمة، وانطلاق القوة ضوء في غيض من الألياف. لمحة عامة ممتازة من المبادئ النظرية الكامنة وراء هذه الحسابات، انظر Foutz وآخرون. (2012) 12. وأظهر الأمثلة على كيفية تطبيق هذه المبادئ والعمليات الحسابية لتصميم تجريبي في Aravanis وآخرون (2007) (3) وTYE وآخرون (2012) 13. أداء هذه الحسابات قبل بداية التجربة أمر بالغ الأهمية لضمان الإشعاع الضوء الكافي لتفعيل أوبسين. ونظرا لهذه الاعتبارات، فإنه من المفيد لشراء أجهزة الليزر التي تعمل بالطاقة أعلى لضمان انتاج الطاقة الكافية. ليزر مع انتاج الطاقة بين 100-200 ميغاواط تكفي عادة للتعويض عن الألياف الأساسية الصغيرة، والألياف متعددة تقسيم، واقتران عدم الكفاءة ويفقد نقل 7. إذا باستخدام الليزر عالية الطاقة، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب الضرر العصبي أو الحرارة وخفيفة الزميلةالتحف د التي يمكن أن تحدث مع طويلة و / أو عالية تعمل بالطاقة ضوء إضاءة (7). وهناك مجموعة وآمن للتجارب في الجسم الحي هو ما يصل الى 75 ميغاواط / مم 2. 14 يمكن البت في نوع من الليزر لشراء تكون مسألة معقدة كما أن هناك العديد من العوامل في الاعتبار. على سبيل المثال، وأشعة الليزر الصمام الثنائي المباشرة توفر الانتاج نابض أكثر استقرارا وقابلة للتكرار من القيام الحالة الصلبة (DPSS) الليزر الصمام الثنائي ضخ، وأكثر موثوقية مع مرور الوقت في بيئة معملية. في بعض الحالات، ومع ذلك، وأشعة الليزر الصمام الثنائي المباشرة قد تنبعث قوة ضوء انخفاض، ~ 0.1 ميغاواط، حتى عندما يكون الجهد الأمر 0 V بسبب التحيز الحالي مستمر إرسالها إلى الصمام الثنائي التي كتبها الالكترونيات السيطرة الليزر. هذه الانبعاثات &quot;عفوية&quot; لديه طيف أوسع من يفعل انبعاث الليزر من نفس الليزر، لذلك يمكن تخفيض على وجه التحديد عن طريق تثبيت ضيق الفرقة تمرير (أو &quot;تنظيف&quot;) فلتر بين الليزر ومقرنة (انظر قائمة أجزاء). سيكون هذا المرشح أيضاتقليل انتاج الطاقة التي كتبها ~ 50٪ عند إحلال ل، وحتى شراء ليزر أعلى بالطاقة وفقا لذلك. وتجدر الإشارة إلى أن أشعة الليزر DPSS الصفراء حساسة للغاية ويمكن أن تتصرف بطريقة متقطعة، وقد خفضت عمر إذا التضمين بسرعة عن طريق مولد النبض. وينبغي أن يتم تعديل الصفراء قوة الليزر من خلال الخارجية عجلات مرشح الكثافة وضعها في مسار الشعاع (القسم 1.7)، في حين تعمل الليزر في TTL + واسطة. بدلا من ذلك، شراء الأخضر 532 نانومتر DPSS الليزر هو بديل فعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن بتنشيط كل halorhodopsins وarchaerhodopsins. الفتحة العددية (NA) من الألياف مهمة في الاعتبار عند تصميم وشراء مكونات الألياف لتجميع الليزر انشاء. وNA من الألياف البصرية يحدد زوايا أشعة الضوء التي يمكن أن تكون مقبولة والمنبعثة في غيض من الألياف. إذا تزاوج الألياف أعلى-NA إلى الألياف أقل-NA، سوف تحدث خسائر كبيرة في تلك الواجهة، ولذلك فمن المهم أن تكون واي ثابت<html> ال الألياف NA ضمن الإعداد واحد (أو لضمان أن NA يزيد على طول مسار الضوء). تأثير الألياف NA على حجم أنسجة المخ مضيئة أقل أهمية، لأن أنسجة المخ هي نثر للغاية، ومنذ ضوء جانب من مصدر الليزر سوف تميل إلى &#39;underfill &quot;الفائقة NA الألياف. وتستخدم الألياف البصرية ولكن مع NA من 0.22 و0.37 شائع. وبالمثل، اقتران من النواة أكبر إلى الألياف النواة أصغر سوف يؤدي أيضا إلى خسائر كبيرة، لذلك دائما تأكد من استخدام زيادة أو تساوي أقطار الأساسية عندما تتقدم من مصدر الليزر لزرع حيوان. على مذكرة عامة، ينبغي دائما أن توج نهايات الألياف عندما لا تكون قيد الاستعمال لمنع الغبار والجسيمات تراكم. انها فكرة جيدة لبانتظام نهايات الألياف نظيفة والموصلات (70٪ ايزوبروبيل يعمل بشكل جيد) لضمان أقصى انتاج الطاقة ضوء، واختبار انتاج الطاقة الضوء من خلال &quot;زرع وهمية&quot; قبل البدء في تجارب كل يوم. &quot;&gt; وخلال الاختبارات السلوكية، لا بد من اتخاذ خطوات للسيطرة على آثار عدوى فيروسية، خارجي التعبير البروتين، الضوء المرئي، والآثار المحتملة التدفئة النسيج والتحف على سلوك الحيوان. لذلك، يجب أن تتكون المجموعة الضابطة السليمة للحيوانات transduced مع فيروس السيطرة (على سبيل المثال، GFP، EYFP، mCherry) التي تتلقى متطابقة المعلمات التحفيز الضوء. التحقق التجريبي هو الخطوة النهائية الحاسمة كما يتضح من البيانات السلوكية المستخدمة في التحليل تعتمد كليا على أوبسين السليم ووضع الألياف البصرية في المنطقة ذات الاهتمام وعلى وجه التحديد، في الحيوانات حيث يتم الكشف عن أي إشارة المناعى، أو حيث وضع إشارة أو الألياف ليس في المنطقة من الفائدة، ويجب إزالة البيانات ثم السلوكية لتلك الحيوانات من التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري لاختبار ناتج الضوء على غيض من الألياف سواء قبل الزرع الجراحي، ومرة ​​أخرى بعد الوفاة لضمان قوة الضوء الكافية لتفعيل أوبسين. وفي أنيماليرة سورية حيث حدث خسارة ضوء شديدة من خلال الألياف بعد التجريب (&gt; 30٪) 9، ينبغي النظر في البيانات لهذا الحيوان من أجل إزالة. وينبغي وضع معايير لإزالة بداهة. وأخيرا، لا بد من النظر في وتيرة النبض المطلوبة لتعديل اطلاق العصبية، والتي سوف تعتمد على بنية الدماغ والخلايا العصبية أنواع فرعية استهدافهم. توجد نشرت المعلمات optogenetic التحفيز الخفيفة لعدة أنواع فرعية العصبية، ومع ذلك، فإن القدرة على تعديل اطلاق العصبية ينبغي تأكيد مستقل في الجسم الحي أو من خلال شريحة الدماغ التسجيلات الكهربية. كما يصبح واحدا بارعون في استخدام الليزر وتعديل ليزر مجموعة عمليات، مزيج من أطوال موجية مختلفة يمكن المربوطة لألياف متعددة على حيوان واحد أو تسليمها أسفل نفس الألياف لعلم البصريات الوراثي اندماجي 8. سوف التحفيز متعدد الطول الموجي أصبحت ذات أهمية متزايدة نظرا للتطور السريع للأحمر التحولإد channelrhodopsins 8، هندسة opsins hyperpolarizing الأزرق تحول 15، واستخدام ثنائي وضع الاستقرار opsins خطوة وظيفة 8،16،17، وقائمة توسيع العامة للopsins مع تفعيل متميزة الأطياف 11. وهذا التوسع في الأدوات optogenetic تسمح لسيطرة غير مسبوقة من عدة أنواع فرعية العصبية داخل وعبر مناطق الدماغ على حد سواء لتحديد دورهم في حكم الدول السلوكية المعقدة.

علم البصريات الوراثي قد أحدثت ثورة على مستوى النظم علم الأعصاب في بحثها عن عناصر الدارة العصبية المحركة الدول السلوكية الطبيعية والأمراض ذات الصلة. قدم اكتشاف أن opsins الميكروبية حساسة للضوء 1 يمكن التعبير عن وظيفيا في خلايا الثدييات منصة لاستخدام الضوء لسيطرة غير مسبوقة من النشاط العصبي مع درجة عالية من الدقة المكانية والزمانية 2. على عكس النهج الكهربية أو الدوائية التقليدية إلى التلاعب في النشاط العصبي، علم البصريات الوراثي يسمح للتحكم في أنواع معينة من الخلايا (على أساس وراثي أو تحديد المكاني الإسقاط) ضمن السكان غير متجانسة وعلى فترات زمنية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. قدم مقدمة لاحق من واجهة العصبية البصرية أداة عملية لإيصال الضوء إلى تتصرف الحيوانات 3. وقد سمح هذا في الوقت الحقيقي للتعديل الدوائر العصبية المحددة في القوارض التصرف مستيقظا من أجل اختبار سببيا لدور هذه الدوائر العصبية في الحكم من الدول السلوكية ذات الصلة للأمراض العصبية والنفسية 4-6. علم البصريات الوراثي، وبالتالي، يمثل أداة قوية لتقديم داخل أي مختبر مهتمة في التحقيق في العلاقة الوظيفية بين نشاط الدماغ والتدابير السلوكية أو الفسيولوجية في النماذج الحيوانية. تصميم ناجح والانتهاء من تجربة optogenetic ينطوي على الخطوات والاعتبارات المختلفة (انظر الشكل 1). والهدف من هذا البروتوكول الحالي هو تزويد الأفراد بالأدوات والمكونات، جنبا إلى جنب مع المعرفة النظرية والعملية، اللازمة لأداء التحفيز optogenetic في القوارض التصرف مستيقظا. حاليا، هناك نوعان من نطاقات الطول الموجي السائدة المستخدمة لتنشيط قنوات أوبسين الميكروبية: في أطياف الأزرق (عادة 473 نانومتر) والأخضر والأصفر الأطياف (عادة 532 أو 591 نانومتر). كل من الليزر والتي ينبعث منها ضوء الثنائيات (المصابيح) ويمكن استخدام مصادر الضوء لدeliver موجات محددة من الضوء لأنسجة المخ. ضوء غير متماسك المنبعث من المصابيح، ومع ذلك، يجعل انتقال الفعال للضوء صعوبة عندما اقتران في الألياف الأساسية الصغيرة اللازمة لفي الجسم الحي القوارض التحفيز. البت في التجمع الليزر المناسب هو الخطوة الأولى الحاسمة وسوف تعتمد على الاستخدام المقصود من علم البصريات الوراثي في ​​المختبر. يصف البروتوكول الحالي طرازين الأساسية التي تختلف في سهولة بهم التجمع والاستخدام: الليزر إلى جانب ما قبل واحد وأنظمة ليزر مزدوج (انظر الشكل 2). أنظمة ليزر واحدة أن تقترن مسبقا من قبل الشركة المصنعة جاهزة للذهاب أساسا لدى وصوله مع قليل من دون مجموعة المتابعة المطلوبة ولكن لديها عيب الحد الأدنى من التخصيص للمستخدم النهائي. وهناك نظام ليزر مزدوج يتيح تسليم اثنين من أطوال موجية مختلفة أسفل نفس الألياف. هذا وسوف تصبح ذات أهمية متزايدة مع ظهور علم البصريات الوراثي اندماجي حيث يمكن أن تستخدم أطوال موجية مختلفة لتفعيل / تمنع distincأنواع الخلايا التائية التي هي مكانيا شارك المترجمة. وهذا أمر ضروري للاستخدام مع ثنائية مستقرة opsins وظيفة الخطوة حيث يتم البدء photocurrents وإنهاء بواسطة الضوء الأزرق والأصفر، على التوالي 7،8 أيضا. أنظمة ليزر المزدوجة هي أيضا قابلة للتخصيص كما يمكن للمستخدم إضافة أو إزالة مكونات (على سبيل المثال، مصاريع الخارجية، والمرشحات شعاع، لقياس الطاقة مضمنة) من مسار الشعاع كما هو مطلوب. نظرا لتنوعها، فمن المستحسن ليزر مزدوج انشاء إذا علم البصريات الوراثي سيكون أداة استمرار المستخدمة في المختبر. اقتران من الليزر، ومع ذلك، يمكن أن يمثل تحديا وحتى يتم توفير آلية اقتران سريعة وسهلة، ويمكن الاعتماد عليها في هذا البروتوكول. ملاحظة، هذا البروتوكول تفاصيل تجميع المكونات البصرية ويستخدم التصحيح بالحبال والمكونات التي هي الأمثل للألياف خطوة مؤشر المتعدد مع 200 ميكرون الأساسية والفتحة العددية (NA) من 0.22. أحجام الأساسية المختلفة وNA متاحة للشراء، ولكن جميع مكونات يجب أن تتطابق بشكل مثالي من حيث الأساسيةحجم وNA لتجنب فقدان الخفيفة في نقاط اتصال الألياف. بدلا من ذلك، في اتصال الألياف، يمكن أن الضوء يمر من أصغر إلى حجم الأساسية أكبر؛ و / أو من-NA السفلي إلى أعلى-NA الألياف دون خسارة إضافية. وتقدم استراتيجيات الربط التي تسمح لتحفيز وقت واحد من الفئران متعددة للالإنتاجية العالية اختبار السلوكي. تفترض البروتوكولات المقدمة استخدام الألياف القابلة للزرع المزمنة للاختبار السلوكي ولكن يمكن تعديلها لبروتوكولات التحفيز الحادة. الألياف مزروع تماما هي مفيدة للجمع بين تحفيز optogenetic مع التلاعب الدوائية، منذ نفس قنية يمكن أن تستخدم لتوصيل الأدوية وغيض من الألياف البصرية إلى نفس الموقع. و، ومع ذلك، ينصح بشدة استخدام الألياف مزروع مزمنة لعدة أيام الاختبارات السلوكية كما أنه يقلل من تلف الأنسجة المرتبطة الإدراج المتكررة وإزالة الألياف ويزيد من دقة من حيث وضع ثابت من الألياف لالإضاءة الأنسجة 3. عندما يقترن مع تكوينات الربط الموصوفة هنا، يمكن تسجيل السلوك موثوق عبر أيام متعددة. أشهر وبالفعل، تم الإبلاغ عن انتقال الضوء يمكن الاعتماد عليها بعد الألياف زرع 9 بحيث التحفيز المزمن ونماذج الاختبارات السلوكية يمكن، نظريا، أن تنفذ عبر الأيام والأسابيع متعددة. تم إضافة ملاحظات إضافية على مكونات الأجهزة إلى بروتوكول للسماح للاختيار القارئ في أفضل المنتجات التي تناسب احتياجاتهم الفردية، بما في ذلك بدائل فعالة من حيث التكلفة والمنتجات التي يمكن أن يتم في المنزل. وتقدم أيضا النصائح الهامة التي هي مفيدة أثناء الإعداد والتنفيذ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System at JoVE.com

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

in-vivo-optogenetic-stimulation-of-the-rodent-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

58.9K Views.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Video: In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

النظامية والمحلية تسليم المخدرات لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي في المجموعات القوارض

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

العصب البصري Transection : نموذج من موت الخلايا المبرمج الخلية العصبية الكبار في الجهاز العصبي المركزي

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...