This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

ملاحظة: الإجراءات التالية التي تنطوي على أنسجة من حيوانات المختبر تتسق مع المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات عام 2013 وتمت الموافقة مسبقا من قبل جامعة ولاية ميشيغان IACUC. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان البحوث في غرفة تحتوي على 2.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين أو عن طريق وضع 3-5 مل من الأيزوفلورين السائل على مادة ماصة على أرضية الغرفة، وضمان أن حاجز مادي يمنع الحيوانات من الاتصال المباشر مع الأيزوفلورين. اختبار لمدى عمق التخدير بواسطة معسر قاطع الطريق. ملاحظة: ويعتبر عمق التخدير المناسب عندما لا يكون هناك رد فعل الانسحاب من أطرافهم هند. مرة واحدة تخدير مناسب، الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في موقف ضعيف وتنظيف جلد البطن مع الايثانول 70٪. استخدام ملقط لقرصة جلد البطن في خط الوسط واستخدام مقص جراحي لجعل وسائل الاعلام 6 سمل شق على طول الخط ألبا لفضح الجهاز الهضمي الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط حادة لتحديد مكان وفضح الدقاق داخل الصفاق. قطع مساريق لفائفي / القولون مع مقص والبدء في كشف الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد كشفا طول الأمعاء بشكل كاف، وقطع القاصي الأمعاء والمعدة والأقرب إلى الأعور لإعداد الدقاق. لإعداد الأمعاء الغليظة، وقطع القاصي القولون الأعور والأقرب إلى المستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة جزء الأمعاء ووضعه في كوب مع وسائل الاعلام DMEM / F12 تستكمل مع 3 ميكرومتر نيكارديبين هيدروكلوريد و 1 ميكرومتر سكوبولامين هيدروكلوريد (المشار إليها فيما يلي باسم &quot;وسائل الإعلام&quot;) على الجليد. إضافة هذه المثبطات تسهل تسليخ مجهري والتصوير لاحق عن طريق شل العضلات الملساء الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة قطع من الفائدة (على سبيل المثال، الصائم، اللفائفي والقولون البعيدة أو القريبة) على أساس علامات تشريحية المعمول بها. utiliz عادةالبريد الأنسجة من الدقاق البعيدة أو القولون البعيدة. ومع ذلك، استخدام نفس الإجراء الأساسي لعزل، تحميل والصورة الخلايا العصبية العضلية المعوية والدبقية في جميع المناطق المعوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شريحة صغيرة (4-6 سم) من شريحة الأمعاء المطلوب وضعها في طبق بتري Sylgard المغلفة مليئة سائل الإعلام المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين القريبة والبعيدة نهايات الجزء الأمعاء مع دبابيس الحشرات وفتح أنبوب الأمعاء عن طريق جعل على التوالي، وقطع بالطول على طول الحدود المساريقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الأنسجة مسطحة تحت التوتر الخفيف مع الجانب الغشاء المخاطي صعودا وبعناية تشريح بعيدا طبقة المخاطية باستخدام ملقط غرامة (رقم 5 و 5/45 عمل أفضل) ومقص الربيع الجميلة جدا. ملاحظة: إزالة الغشاء المخاطي يمكن أن تكون مؤلمة جدا لENS إذا لم تفعل بشكل صحيح. للتحضير الجودة، ورعاية للحد من إزالة مفاجئة من الغشاء المخاطي عن طريق تقشير أو كشط. أفضل الممارسات لرفع الغشاء المخاطي وقطع تحت مع مقص غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنسجة في إعداد أصغرالصورة (حوالي 0.5 سم 2) ودبوس في أطباق التصوير (4 زوايا مع طبقة العضلات الدائرية التي تواجه متابعة) وضعت على الجليد مع وسائل الإعلام الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح بعناية بعيدا عضلة الدائرية التي كتبها إغاظة بعيدا مع ملاقط غرامة لفضح الضفيرة العضلية المعوية. تجنب الإفراط في التمدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق التصوير مرة أخرى على الجليد والتغيير حل مع وسائل الإعلام الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 مل من مزيج انزيم في طبق [Dispase 1 U / مل (4.48 ملغ / 8 مل)، كولاجيناز النوع الثاني 150 U / مل (5.45 ملغ / 8 مل) في وسائل الإعلام]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أطباق من الجليد وإضافة مزيج انزيم من الخطوة 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأطباق في RT لمدة 15 دقيقة مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الاستعدادات الأنسجة مع وسائل الاعلام 3 مرات وزوايا إعادة دبوس. </li></ol> 2. تحميل فلوو-4 صبغ ملاحظة: تجنب photobleaching من خلال العمل مع ضوء محدود أثناء التعامل مع الأصباغ الفلورية والأنسجة محملة الأصباغ المؤشر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4 ميكرومتر فلوو-4 حل التحميل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل سائل الإعلام و 1.2 ميكرولتر من 250 ملي الأسهم البروبينسيد إلى قسامة 1.5 ميكرولتر من 4 مم فلوو-4 المخزون. ويتم إعداد 4 ملي فلوو-4 الأسهم عن طريق إضافة 11.4 ميكرولتر من pluronic F-127 (20٪ في DMSO، على أن تستكمل مع 0.25٪ cremaphor-EL) إلى 50 ميكروغرام من فلوو-4، AM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان محضرات في فلوو-4 الحل تحميل لمدة 45 دقيقة في حاضنة مظلمة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة من الحاضنة وغسل الاستعدادات مع وسائل الاعلام 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام مقابل وسائل الإعلام التي تحتوي على 200 ميكرومتر البروبينسيد واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل التصوير. ملاحظة: بالبروبنيسيد هو الدواء الذي يمنع النقل المقاومة للأدوية المتعددة في الخلايا العصبية. بالإضافة لهذا الدواء يمنع قدرة الخلايا العصبية لبثق الأصباغ ويعزز وضع العلامات العصبية. السائبة التحميل من الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر في غياب البروبينسيد تنتج أساسا الدبقية تحميل الخلية. إضافة البروبينسيد تسمح لرؤية الردود العصبية والدبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التعديل KREبكالوريوس العازلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل منطقة عازلة كريبس المعدلة مثل أن تركيزات النهائية (مم) من المكونات هي على النحو التالي: 121 كلوريد الصوديوم، و 5.9 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 1.2 ناه 2 PO 4، 10 HEPES، 21.2 NaHCO 3، 1 البيروفيك حمض و 8 الجلوكوز (درجة الحموضة تعديل إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم). إضافة 3 ميكرومتر نيكارديبين و1 ميكرومتر سكوبولامين لمنع تقلصات العضلات أثناء الكالسيوم 2+ التصوير وكله يشن تشريح. </li></ol></li></ol> 3. التصوير وتحليل ملاحظة: استخدام ما لا يقل عن تلاعب التصوير الأساسي مع مصدر ضوء الفلورسنت، المجهر، وكاميرا CCD الجودة وبرنامج الحصول المناسب. تختلف إضافة مكونات أخرى اعتمادا على مصدر الضوء وتطبيق معين. يجب استخدام عجلة تصفية ومصراع مع مصدر ضوء زينون التقليدي القوس. ومع ذلك، مصادر الضوء LED وأنظمة الإضاءة لا تتطلب هذه المكونات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع تفصيلأوردينج غرفة تحت المجهر وباستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية مع عدة خزانات حقنة ساخنة تحديد معدل نضح المستمر من 2-3 مل / دقيقة من 37 درجة مئوية كريبس العازلة. تأكد لمنع تشكيل فقاعة الهواء في كل من المدخلات وشفط خط متصل فخ الفراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب الضفيرة المطلوب في التركيز تحت إضاءة ساطعة المجال. تجنب تعريض الأنسجة، مما قد يؤدي إلى الصورة التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة تحميل فلوو-4 ضمن العقد وحدد العقد صحي للتصوير. وغير صحية العقد / التالفة تظهر تألق ذاتي أو منقط التشكل وينبغي ألا تستخدم للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحديد العقدة، تحويل مسار الضوء إلى الكاميرا والحصول على صورة حية مع برنامج الحصول على الصور. تأكد من أن العقدة هي في التركيز وتعيين صورة ومعدل اقتناء والتعرض مرات. ملاحظة: سوف معدلات اكتساب صورة والأوقات تختلف تبعا لأحداث المحققين ترغب في تسجيل. بالنسبة لمعظم التجارب، صوريتم الحصول على تقليديا في 0.5-1 هرتز للخلايا الدبقية وتصل إلى 2-10 هرتز لالخلايا العصبية بسبب ردود الدبقية الكالسيوم 2+ ليست سريعة مثل الكالسيوم 2+ العابرين في الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ التجربة وإقامة النشاط الأساسي لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق المخدرات قبل تحسنت ذات الأهمية مثل منبهات مستقبلات ومضادات باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية بمعدل 2-3 مل / دقيقة. اتبع تطبيق منبهات / الخصوم من خلال العودة إلى نضح من العازلة العادي والسماح لفترة الغسيل / استرداد 10 دقيقة على الأقل. ملاحظة: تختلف الأوقات تطبيق المخدرات تبعا لمجمع الفردي والتصميم التجريبي. بشكل عام، تطبيق 20-30 ثانية من ناهض كافية لتنشيط مستقبلات البروتين G-يقترن في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. ومع ذلك، القنوات الأيونية بوابات يجند (مثل مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية) تتطلب مرة تطبيق لا يزيد عن 5-10 ثانية. سوف التعرض مدة أخرى تسبب يجند بوابات القنوات الأيونية لDESE بسرعةnsitize. وينبغي تطبيق الخصوم لحوالي 3-15 دقائق لضمان الحصار الكامل لمسارات مستقبلات. ومع ذلك، وهذا هو التعميم الإجمالي، وينبغي أن المحققين دائما تحسين أي دواء التجريبية في نموذج بصفة خاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف التسجيل وعرض الوقت الفاصل بين الفيلم التجربة. مناطق مختارة بعناية من الفائدة (ROI ل) باستخدام المناسب برنامج تحليل الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات لتطبيع ومقارنة العائد على الاستثمار كثافة الفلورسنت ضد القيمة الأولية الفلورسنت خط الأساس. التغيرات في مضان تطبيع ويتناسب طرديا مع التغيرات في [كا 2+]. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تعديل طريقة التي سبق وصفها باستخدام 26 ΔF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) الخلفية، حيث F1 هو مضان في أي يعطى نقطة وF0 هي مضان خط الأساس، لتحسين دقة التقييم. يساعد هذا التعديلفي الحد من الضوضاء من التغييرات مضان في الاستعدادات الأنسجة التي تظهر حركة طبقة العضلات الكامنة وراء الضفيرة العضلية المعوية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+of+origin+of+neurons+in+the+murine+enteric+nervous+system:+sequence+in+relation+to+phenotype.">Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).</li><li>Nasser, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+enteric+glia+in+intestinal+physiology:+effects+of+the+gliotoxin+fluorocitrate+on+motor+and+secretory+function.">Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+in+the+gut.">Glial cells in the gut.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 17 (6), 777-790 (2005).</li><li>Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++transients+in+myenteric+glial+cells+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> J. Physiol. 590, 335-350 (2012).</li><li>Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+targets+of+the+sympathetic+innervation+of+the+myenteric+plexus+in+the+guinea+pig+distal+colon.">Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon.</a> J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).</li><li>McClain, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Responses+in+Enteric+Glia+Are+Mediated+by+Connexin-43+Hemichannels+and+Modulate+Colonic+Transit+in+Mice.">Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li><li>Chandrasekharan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motor+dysfunction+in+human+diabetes+is+associated+with+enteric+neuronal+loss+and+increased+oxidative+stress.">Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55, 630-637 (2006).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+P2X7+receptor-pannexin-1+mediates+death+of+enteric+neurons+during+colitis.">Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis.</a> Nat Med. 18, 600-604 (2012).</li><li>Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+activity+in+different+classes+of+myenteric+neurons+underlying+the+migrating+motor+complex+in+the+murine+colon.">Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon.</a> J Physiol. 588, 399-421 (2010).</li><li>Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+transients+in+submucous+neurons+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).</li><li>Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soma+and+neurites+of+primary+afferent+neurons+in+the+guinea-pig+intestine+respond+differentially+to+deformation.">The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation.</a> J Physiol. 526, 375-385 (2000).</li><li>Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+the+gastrointestinal+tract:+mapping+the+human+enteric+nervous+system.">Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system.</a> Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spread+of+pacemaker+activity+in+through+ICC+in+guinea-pig+antrum.">Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum.</a> Neurogastro Motil. 14, 575 (2001).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+organization+of+Ca2++waves+by+enteric+neural+reflexes.">Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes.</a> Nature. 399, 62-66 (1999).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+neural+regulation+of+calcium+waves+in+longitudinal+and+circular+muscle+layers+of+guinea-pig+small+intestine.">Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine.</a> Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).</li><li>Jessen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-like+glia+in+the+peripheral+nervous+system:+an+immunohistochemical+study+of+enteric+glia.">Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia.</a> Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).</li><li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-dependent+paracrine+communication+between+enteric+neurons+and+glia+in+a+primary+cell+culture+derived+from+embryonic+mice.">ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+neuron-to-glia+signaling+in+the+enteric+nervous+system.">Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).</li><li>Ren, J., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+and+synaptic+transmission+in+enteric+neurons.">Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons.</a> Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Dongcheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+regionalisation+for+enteric+nervous+system+formation:+implications+for+Hirschsprung's+disease+and+stem+cell+therapy.">Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy.</a> Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+an+enteric+neuron+there+may+lie+a+glial+cell.">Behind an enteric neuron there may lie a glial cell.</a> J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).</li><li>Boesmans, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuron-glia+interactions+in+the+enteric+nervous+system.">Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

وينظم الجهاز العصبي المعوي (ENS) إلى قسمين الضفائر عقدي جزءا لا يتجزأ من داخل جدار الجهاز الهضمي 1. هذه الدوائر العصبية في العضل، الضفيرة العضلية المعوية (MP) والضفيرة تحت المخاطية (SMP)، وتتكون من الخلايا العصبية والدبقية المعوية (الشكل 1) (2). النائب وSMP تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظائف مثل حركية الأمعاء وامتصاص الظهارية وإفراز، على التوالي 3. وتقع الدبقية المعوية على مقربة من الخلايا العصبية في العقد ولكن سكان الدبقية المعوية موجودة أيضا في ربط مساحات الألياف وأجزاء خارج العقدية من جدار الأمعاء 3،4. ويعتقد الدبقية المعوية في الأصل لتقديم الدعم المغذي فقط إلى الخلايا العصبية. ومع ذلك، الدراسات الحديثة تشير بقوة إلى أن التفاعلات العصبية، الدبقية ضرورية لENS يعمل 5،6. على سبيل المثال، تشير البيانات إلى أن الدبقية المعوية &quot;الاستماع&quot; إلى نشاط الخلايا العصبية 7وتعدل الدوائر العصبية 6،8، وحماية الخلايا العصبية المعوية من الاكسدة 9 وتكون قادرة على توليد الخلايا العصبية المعوية جديدة استجابة للإصابة 10،11. بروتوكول الواردة في هذا الاستعراض التقني يوفر طريقة بسيطة وقوية لدراسة تفاعل معقد بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية باستخدام في الموقع الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التصوير. كاليفورنيا 2+ هو جزيء إشارة في كل مكان في الخلايا منفعل ويلعب دورا أساسيا في الأحداث يشير متشابك في الجهاز العصبي 12. الإثارة من الخلايا العصبية أو الدبقية المعوية يتسبب إرتفاع في هيولي تركيز الكالسيوم 2+ إما عن طريق تدفق الكالسيوم من خلال قنوات 2+ -permeable أو الكالسيوم 2+ إطلاق سراح من مخازن الكالسيوم داخل الخلايا. التصوير كاليفورنيا 2+ العابرين في الخلايا العصبية والدبقية مع الأصباغ الفلورية وثابتة والتقنية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة التنظيم الوظيفي وديناميكيةفي 13-17 ENS. وقد تبين التصوير كاليفورنيا 2+ أن تكون أداة هامة في دراسة سليمة شرائح الأنسجة GI لتوضيح انتشار استثارة من خلال شبكات تنظيم ضربات القلب المحكمة الجنائية الدولية 18 والأمعاء العضلات الملساء 19،20. وهي تمكن الباحثين للتحقيق في طيف واسع من المعلمات الفسيولوجية ويقدم معلومات عن كل من توزيعها المكاني والزماني ديناميات. الخلايا يمكن أن تكون ملطخة بكفاءة بطريقة الغازية الحد الأدنى باستخدام مؤشرات الفلورسنت نفاذية الغشاء والبروتوكولات تلطيخ الأمثل 21. هذا يتيح الفرصة لمراقبة عدد كبير من الخلايا العصبية والدبقية المعوية في الأعمال التحضيرية الحفاظ عليها وظيفيا 14-16،22، وكذلك في الجسم الحي 23. جبل كامل الاستعدادات الأنسجة هي الأكبر محملة عالية تقارب الكالسيوم 2+ مؤشر صبغ مثل فلوو-4 الذي يزيد مضان لها عندما بد أن الكالسيوم 2+. يتم تسجيل التغيرات في مضان بواسطة كاميرا CCD وآناlyzed رقميا 6. قدم ظهور الكالسيوم 2+ الفرصة لمراقبة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية التفاعلات، والاستجابة لمختلف المحفزات، وإشراك أنواع الخلايا هذه في عمليات الجهاز الهضمي في الوقت الحقيقي. في الموقع قد حقق التصوير الكالسيوم 2+ بصيرة آليات الإشارات من الخلايا العصبية المعوية والدبقية وتمتلك عدة مزايا واضحة على نماذج ثقافة الخلية 6،24. أولا، في الموقع استعدادات المحافظة على البيئة مصفوفة الأم من الخلايا العصبية والدبقية وترك الجزء الأكبر من صلاتهم لاستهداف الأنسجة سليمة. وثانيا، فإن علم الوراثة ومورفولوجية الدبقية المعوية مثقف وبشكل ملحوظ مقارنة اختلف في الجسم الحي 6،24. ثالثا، يتم فقدان كثير من التفاعلات غيروي في زراعة الخلايا الأولية وهذه حدود تقييم التفاعلات خلية خلية. على الرغم من أن الخلايا المستزرعة هي مناسبة تماما للتحقيق في الخصائص الأساسية، usefulne بهمSS لدراسة التفاعلات المعقدة بين الدبقية المعوية والخلايا العصبية محدودة. التحقيق تفاعل الخلايا العصبية، الدبقية باستخدام نهج في الموقع أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة كما تبقى مسارات متشابك سليمة 25. بالمقارنة مع النهج ثقافة الخلية، وهو نهج الموقعي في تقدم وتحسن الظروف لفهم منهجي التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية. وعلاوة على ذلك، فإن المنظمة مستو من الضفيرة عقدي في الاستعدادات الكاملة جبل مثالية للتصوير الفلورسنت من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرين ويوفر هذا الأسلوب نهجا واضحة لتقييم نشاط الخلايا العصبية الدبقية في ENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Syringe Heater&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-stage microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

الاستخدام السليم لهذه التقنية تسمح للمحققين تقيس بدقة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ [كا 2+] ط العابرين في الخلايا العصبية المعوية والدبقية في جبل لالجامع الاستعدادات الأنسجة. ويرد مثال ممثل ل-أثار ناهض الكالسيوم 2+ الردود في الدبقية ضمن العقدة العضلية المعوية من القولون الماوس في فيديو 1. وتهدف النتائج التالية لتوضيح بعض النتائج التمثيلية التي حصلنا عليها باستخدام هذا الأسلوب. أولا، يوضح الشكل (2) ونتائج تجربة قياس الدبقية المعوية [كا 2+] ط التغييرات ردا على التحفيز عن طريق ATP داخل خنزير غينيا القولون طولية الضفيرة العضلية المعوية العضلات (LMMP) الاستعدادات. على وجه التحديد، ويظهر هذا الرقم أسلوب التحليل السليم للبروتوكول تجريبي المذكورة أعلاه بما في ذلك الخطوط العريضة للالعقدة، والنجمة تدل على مكان الخلايا العصبية العضلية المعوية المعوية تحليلها. هذه النتائج أيضا طllustrate الجرعة المثلى من مائة ATP مكرومولي على تعبئة [كا 2+] i في خنزير غينيا الدبقية العضلية المعوية. هذا الرد يمكن أن تستخدم لمعايرة التحفيز الدبقية المعوي وتطبيع الردود على اختبار المحفزات. وبعد ذلك، بالتعريف الشكل (3) كيفية تحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية بشكل صحيح، كما هو موضح مع توضيح الدوائر الصفراء. تظهر هذه النتائج أيضا التغييرات مضان المطلوب في ظل الظروف القاعدية واستجابة للمؤثرات الدوائية. وأخيرا، يوضح الشكل 4 الاعتبارات المكانية لاختيار الدبقية المعوية والخلايا العصبية ل[كا 2+] ط الردود في الاستعدادات الكاملة جبل. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> الشكل 1. منظمة ENS. وتتضمن ENS اثنين من الضفائر عقدي الرئيسية. يقع الضفيرة العضلية المعوية بين لطبقات العضلات ongitudinal ودائرية. يقع الضفيرة تحت المخاطية بين الغشاء المخاطي وطبقة العضلات الدائرية. وتتألف ENS فقط من الخلايا العصبية والدبقية المعوية. مساحات الألياف العصبية تربط العقد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> الشكل 2. المعوية الدبقية في خنزير غينيا القولون الضفيرة العضلية المعوية الاستجابة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) فلوو-4 مضان في العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع) في ظل الظروف القاعدية. وتشير الأسهم لمساحات سميكة من الألياف بين العقد. (ب) عند التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية، ولكن ليس الخلايا العصبية، وزيادة بسرعة فلوو-4 مضان مما يشير إلى زيادة في [كا 2+] <sUB&gt; ط. لاحظ أن خلايا الاستجابة صغيرة وتحيط الخلايا العصبية أكبر من ذلك بكثير (الأماكن المظلمة تميزت العلامات النجمية). (C) الدبقية المعوية تستجيب لATP بطريقة تعتمد على الجرعة مع 1 مليمول / L مثيرة لاستجابات القصوى 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> الشكل 3. الفئران S-100-GFP + الخلايا في القولون العضلي المعوي الاستجابة الضفيرة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) S-100-GFP + الخلايا الدبقية (الأخضر) في الماوس القولون العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع). وتظهر ست مناطق من الفائدة (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية ضمن العقد كما الدوائر الصفراء. السهام تشير مساحات الألياف سميكة المؤدية إلى العقدة. النجمة دموقع enote من 2 الخلايا العصبية المعوية. (ب) نفس العقدة تظهر Rhod-2 مضان في ظل ظروف القاعدية. (C) وبعد التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية تستجيب مع زيادة [كا 2+] أنا كما يتضح من زيادة Rhod- 2 مضان. (D) آثار المقابلة لكل ROI هو مبين في A-C. (E) بلغ متوسط ​​استجابة (يعني ± SEM) من 6 رويس هو مبين في D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> الشكل 4. في مجال التصوير الموقع من المعوي الاتصالات العصبية إلى الدبقية. (A) صور الممثل (pseudocolored) من تجربة التصوير الكالسيوم 2+ حيث كله جبلوطعن إعداد الضفيرة العضلية المعوية مع الخلايا العصبية P2X7 مستقبلات ناهض BzATP (100 ميكرومتر، 30 ثانية). لاحظ أن ناهض العصبية يسبب زيادة في Fluo4 مضان في الخلايا العصبية (A &#39;) قبل المحيطة بها الخلايا الدبقية المعوية (A &quot;). (ب) تحليل التغير في مضان على مر الزمن في الدبقية (الأزرق) والخلايا العصبية (الحمراء ) بعد تطبيق ناهض الخلايا العصبية، BzATP. (C) العصبية واستجابات الدبقية لBzATP في المخزن العادي (خطوط الصلبة) وفي العازلة التي تحتوي على الكالسيوم منخفض 2+ والمغنيسيوم 2+ (الخطوط المتقطعة) لتحفيز مستقبلات P2X7 العصبية (13). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> فيديو 1. أثار ناهض الكالسيوم 2+ رد في الدبقية المعوية فيالموقع. يظهر هذا الفيديو على العقدة العضلية المعوية من القولون البعيدة الماوس محملة كا 2+ صبغ المؤشر، فلوو-4. ناهض الخلايا الدبقية، ADP، يضاف إلى الحمام عند اللزوم. ADP يتسبب زيادة في الكالسيوم داخل الخلايا الدبقية في 2+ المعوية كما لوحظ من خلال الارتفاع عابر في فلوو-4 مضان. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System at JoVE.com

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K Views.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Video: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية في العقد الجذرية الظهرية السليمة

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

في الجسم الحي التصور من العقدة مثلث التوائم الفئران مع مؤشرات الكالسيوم

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف الآليات الطرفية لألم الأعصاب في إصابة العصب الثلاثي التوائم 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم للفئران

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

في الموقع الكالسيوم ²⁺ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية في العقد الجذرية الظهرية السليمة

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم للفئران

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم للفئران

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم للفئران

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli