This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

ملاحظة: الإجراءات التالية التي تنطوي على أنسجة من حيوانات المختبر تتسق مع المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات عام 2013 وتمت الموافقة مسبقا من قبل جامعة ولاية ميشيغان IACUC. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان البحوث في غرفة تحتوي على 2.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين أو عن طريق وضع 3-5 مل من الأيزوفلورين السائل على مادة ماصة على أرضية الغرفة، وضمان أن حاجز مادي يمنع الحيوانات من الاتصال المباشر مع الأيزوفلورين. اختبار لمدى عمق التخدير بواسطة معسر قاطع الطريق. ملاحظة: ويعتبر عمق التخدير المناسب عندما لا يكون هناك رد فعل الانسحاب من أطرافهم هند. مرة واحدة تخدير مناسب، الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في موقف ضعيف وتنظيف جلد البطن مع الايثانول 70٪. استخدام ملقط لقرصة جلد البطن في خط الوسط واستخدام مقص جراحي لجعل وسائل الاعلام 6 سمل شق على طول الخط ألبا لفضح الجهاز الهضمي الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط حادة لتحديد مكان وفضح الدقاق داخل الصفاق. قطع مساريق لفائفي / القولون مع مقص والبدء في كشف الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد كشفا طول الأمعاء بشكل كاف، وقطع القاصي الأمعاء والمعدة والأقرب إلى الأعور لإعداد الدقاق. لإعداد الأمعاء الغليظة، وقطع القاصي القولون الأعور والأقرب إلى المستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة جزء الأمعاء ووضعه في كوب مع وسائل الاعلام DMEM / F12 تستكمل مع 3 ميكرومتر نيكارديبين هيدروكلوريد و 1 ميكرومتر سكوبولامين هيدروكلوريد (المشار إليها فيما يلي باسم &quot;وسائل الإعلام&quot;) على الجليد. إضافة هذه المثبطات تسهل تسليخ مجهري والتصوير لاحق عن طريق شل العضلات الملساء الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة قطع من الفائدة (على سبيل المثال، الصائم، اللفائفي والقولون البعيدة أو القريبة) على أساس علامات تشريحية المعمول بها. utiliz عادةالبريد الأنسجة من الدقاق البعيدة أو القولون البعيدة. ومع ذلك، استخدام نفس الإجراء الأساسي لعزل، تحميل والصورة الخلايا العصبية العضلية المعوية والدبقية في جميع المناطق المعوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شريحة صغيرة (4-6 سم) من شريحة الأمعاء المطلوب وضعها في طبق بتري Sylgard المغلفة مليئة سائل الإعلام المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين القريبة والبعيدة نهايات الجزء الأمعاء مع دبابيس الحشرات وفتح أنبوب الأمعاء عن طريق جعل على التوالي، وقطع بالطول على طول الحدود المساريقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الأنسجة مسطحة تحت التوتر الخفيف مع الجانب الغشاء المخاطي صعودا وبعناية تشريح بعيدا طبقة المخاطية باستخدام ملقط غرامة (رقم 5 و 5/45 عمل أفضل) ومقص الربيع الجميلة جدا. ملاحظة: إزالة الغشاء المخاطي يمكن أن تكون مؤلمة جدا لENS إذا لم تفعل بشكل صحيح. للتحضير الجودة، ورعاية للحد من إزالة مفاجئة من الغشاء المخاطي عن طريق تقشير أو كشط. أفضل الممارسات لرفع الغشاء المخاطي وقطع تحت مع مقص غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنسجة في إعداد أصغرالصورة (حوالي 0.5 سم 2) ودبوس في أطباق التصوير (4 زوايا مع طبقة العضلات الدائرية التي تواجه متابعة) وضعت على الجليد مع وسائل الإعلام الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح بعناية بعيدا عضلة الدائرية التي كتبها إغاظة بعيدا مع ملاقط غرامة لفضح الضفيرة العضلية المعوية. تجنب الإفراط في التمدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق التصوير مرة أخرى على الجليد والتغيير حل مع وسائل الإعلام الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 مل من مزيج انزيم في طبق [Dispase 1 U / مل (4.48 ملغ / 8 مل)، كولاجيناز النوع الثاني 150 U / مل (5.45 ملغ / 8 مل) في وسائل الإعلام]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أطباق من الجليد وإضافة مزيج انزيم من الخطوة 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأطباق في RT لمدة 15 دقيقة مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الاستعدادات الأنسجة مع وسائل الاعلام 3 مرات وزوايا إعادة دبوس. </li></ol> 2. تحميل فلوو-4 صبغ ملاحظة: تجنب photobleaching من خلال العمل مع ضوء محدود أثناء التعامل مع الأصباغ الفلورية والأنسجة محملة الأصباغ المؤشر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4 ميكرومتر فلوو-4 حل التحميل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل سائل الإعلام و 1.2 ميكرولتر من 250 ملي الأسهم البروبينسيد إلى قسامة 1.5 ميكرولتر من 4 مم فلوو-4 المخزون. ويتم إعداد 4 ملي فلوو-4 الأسهم عن طريق إضافة 11.4 ميكرولتر من pluronic F-127 (20٪ في DMSO، على أن تستكمل مع 0.25٪ cremaphor-EL) إلى 50 ميكروغرام من فلوو-4، AM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان محضرات في فلوو-4 الحل تحميل لمدة 45 دقيقة في حاضنة مظلمة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة من الحاضنة وغسل الاستعدادات مع وسائل الاعلام 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام مقابل وسائل الإعلام التي تحتوي على 200 ميكرومتر البروبينسيد واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل التصوير. ملاحظة: بالبروبنيسيد هو الدواء الذي يمنع النقل المقاومة للأدوية المتعددة في الخلايا العصبية. بالإضافة لهذا الدواء يمنع قدرة الخلايا العصبية لبثق الأصباغ ويعزز وضع العلامات العصبية. السائبة التحميل من الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر في غياب البروبينسيد تنتج أساسا الدبقية تحميل الخلية. إضافة البروبينسيد تسمح لرؤية الردود العصبية والدبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التعديل KREبكالوريوس العازلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل منطقة عازلة كريبس المعدلة مثل أن تركيزات النهائية (مم) من المكونات هي على النحو التالي: 121 كلوريد الصوديوم، و 5.9 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 1.2 ناه 2 PO 4، 10 HEPES، 21.2 NaHCO 3، 1 البيروفيك حمض و 8 الجلوكوز (درجة الحموضة تعديل إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم). إضافة 3 ميكرومتر نيكارديبين و1 ميكرومتر سكوبولامين لمنع تقلصات العضلات أثناء الكالسيوم 2+ التصوير وكله يشن تشريح. </li></ol></li></ol> 3. التصوير وتحليل ملاحظة: استخدام ما لا يقل عن تلاعب التصوير الأساسي مع مصدر ضوء الفلورسنت، المجهر، وكاميرا CCD الجودة وبرنامج الحصول المناسب. تختلف إضافة مكونات أخرى اعتمادا على مصدر الضوء وتطبيق معين. يجب استخدام عجلة تصفية ومصراع مع مصدر ضوء زينون التقليدي القوس. ومع ذلك، مصادر الضوء LED وأنظمة الإضاءة لا تتطلب هذه المكونات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع تفصيلأوردينج غرفة تحت المجهر وباستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية مع عدة خزانات حقنة ساخنة تحديد معدل نضح المستمر من 2-3 مل / دقيقة من 37 درجة مئوية كريبس العازلة. تأكد لمنع تشكيل فقاعة الهواء في كل من المدخلات وشفط خط متصل فخ الفراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب الضفيرة المطلوب في التركيز تحت إضاءة ساطعة المجال. تجنب تعريض الأنسجة، مما قد يؤدي إلى الصورة التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة تحميل فلوو-4 ضمن العقد وحدد العقد صحي للتصوير. وغير صحية العقد / التالفة تظهر تألق ذاتي أو منقط التشكل وينبغي ألا تستخدم للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحديد العقدة، تحويل مسار الضوء إلى الكاميرا والحصول على صورة حية مع برنامج الحصول على الصور. تأكد من أن العقدة هي في التركيز وتعيين صورة ومعدل اقتناء والتعرض مرات. ملاحظة: سوف معدلات اكتساب صورة والأوقات تختلف تبعا لأحداث المحققين ترغب في تسجيل. بالنسبة لمعظم التجارب، صوريتم الحصول على تقليديا في 0.5-1 هرتز للخلايا الدبقية وتصل إلى 2-10 هرتز لالخلايا العصبية بسبب ردود الدبقية الكالسيوم 2+ ليست سريعة مثل الكالسيوم 2+ العابرين في الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ التجربة وإقامة النشاط الأساسي لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق المخدرات قبل تحسنت ذات الأهمية مثل منبهات مستقبلات ومضادات باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية بمعدل 2-3 مل / دقيقة. اتبع تطبيق منبهات / الخصوم من خلال العودة إلى نضح من العازلة العادي والسماح لفترة الغسيل / استرداد 10 دقيقة على الأقل. ملاحظة: تختلف الأوقات تطبيق المخدرات تبعا لمجمع الفردي والتصميم التجريبي. بشكل عام، تطبيق 20-30 ثانية من ناهض كافية لتنشيط مستقبلات البروتين G-يقترن في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. ومع ذلك، القنوات الأيونية بوابات يجند (مثل مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية) تتطلب مرة تطبيق لا يزيد عن 5-10 ثانية. سوف التعرض مدة أخرى تسبب يجند بوابات القنوات الأيونية لDESE بسرعةnsitize. وينبغي تطبيق الخصوم لحوالي 3-15 دقائق لضمان الحصار الكامل لمسارات مستقبلات. ومع ذلك، وهذا هو التعميم الإجمالي، وينبغي أن المحققين دائما تحسين أي دواء التجريبية في نموذج بصفة خاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف التسجيل وعرض الوقت الفاصل بين الفيلم التجربة. مناطق مختارة بعناية من الفائدة (ROI ل) باستخدام المناسب برنامج تحليل الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات لتطبيع ومقارنة العائد على الاستثمار كثافة الفلورسنت ضد القيمة الأولية الفلورسنت خط الأساس. التغيرات في مضان تطبيع ويتناسب طرديا مع التغيرات في [كا 2+]. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تعديل طريقة التي سبق وصفها باستخدام 26 ΔF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) الخلفية، حيث F1 هو مضان في أي يعطى نقطة وF0 هي مضان خط الأساس، لتحسين دقة التقييم. يساعد هذا التعديلفي الحد من الضوضاء من التغييرات مضان في الاستعدادات الأنسجة التي تظهر حركة طبقة العضلات الكامنة وراء الضفيرة العضلية المعوية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+of+origin+of+neurons+in+the+murine+enteric+nervous+system:+sequence+in+relation+to+phenotype.">Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).</li><li>Nasser, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+enteric+glia+in+intestinal+physiology:+effects+of+the+gliotoxin+fluorocitrate+on+motor+and+secretory+function.">Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+in+the+gut.">Glial cells in the gut.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 17 (6), 777-790 (2005).</li><li>Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++transients+in+myenteric+glial+cells+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> J. Physiol. 590, 335-350 (2012).</li><li>Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+targets+of+the+sympathetic+innervation+of+the+myenteric+plexus+in+the+guinea+pig+distal+colon.">Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon.</a> J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).</li><li>McClain, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Responses+in+Enteric+Glia+Are+Mediated+by+Connexin-43+Hemichannels+and+Modulate+Colonic+Transit+in+Mice.">Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li><li>Chandrasekharan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+motor+dysfunction+in+human+diabetes+is+associated+with+enteric+neuronal+loss+and+increased+oxidative+stress.">Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55, 630-637 (2006).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+neuronal+P2X7+receptor-pannexin-1+mediates+death+of+enteric+neurons+during+colitis.">Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis.</a> Nat Med. 18, 600-604 (2012).</li><li>Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+activity+in+different+classes+of+myenteric+neurons+underlying+the+migrating+motor+complex+in+the+murine+colon.">Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon.</a> J Physiol. 588, 399-421 (2010).</li><li>Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+transients+in+submucous+neurons+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine.">Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).</li><li>Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soma+and+neurites+of+primary+afferent+neurons+in+the+guinea-pig+intestine+respond+differentially+to+deformation.">The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation.</a> J Physiol. 526, 375-385 (2000).</li><li>Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+the+gastrointestinal+tract:+mapping+the+human+enteric+nervous+system.">Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system.</a> Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spread+of+pacemaker+activity+in+through+ICC+in+guinea-pig+antrum.">Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum.</a> Neurogastro Motil. 14, 575 (2001).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+organization+of+Ca2++waves+by+enteric+neural+reflexes.">Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes.</a> Nature. 399, 62-66 (1999).</li><li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+neural+regulation+of+calcium+waves+in+longitudinal+and+circular+muscle+layers+of+guinea-pig+small+intestine.">Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine.</a> Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).</li><li>Jessen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-like+glia+in+the+peripheral+nervous+system:+an+immunohistochemical+study+of+enteric+glia.">Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia.</a> Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).</li><li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-dependent+paracrine+communication+between+enteric+neurons+and+glia+in+a+primary+cell+culture+derived+from+embryonic+mice.">ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+neuron-to-glia+signaling+in+the+enteric+nervous+system.">Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).</li><li>Ren, J., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+and+synaptic+transmission+in+enteric+neurons.">Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons.</a> Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Dongcheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+regionalisation+for+enteric+nervous+system+formation:+implications+for+Hirschsprung's+disease+and+stem+cell+therapy.">Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy.</a> Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+an+enteric+neuron+there+may+lie+a+glial+cell.">Behind an enteric neuron there may lie a glial cell.</a> J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).</li><li>Boesmans, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuron-glia+interactions+in+the+enteric+nervous+system.">Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

وينظم الجهاز العصبي المعوي (ENS) إلى قسمين الضفائر عقدي جزءا لا يتجزأ من داخل جدار الجهاز الهضمي 1. هذه الدوائر العصبية في العضل، الضفيرة العضلية المعوية (MP) والضفيرة تحت المخاطية (SMP)، وتتكون من الخلايا العصبية والدبقية المعوية (الشكل 1) (2). النائب وSMP تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظائف مثل حركية الأمعاء وامتصاص الظهارية وإفراز، على التوالي 3. وتقع الدبقية المعوية على مقربة من الخلايا العصبية في العقد ولكن سكان الدبقية المعوية موجودة أيضا في ربط مساحات الألياف وأجزاء خارج العقدية من جدار الأمعاء 3،4. ويعتقد الدبقية المعوية في الأصل لتقديم الدعم المغذي فقط إلى الخلايا العصبية. ومع ذلك، الدراسات الحديثة تشير بقوة إلى أن التفاعلات العصبية، الدبقية ضرورية لENS يعمل 5،6. على سبيل المثال، تشير البيانات إلى أن الدبقية المعوية &quot;الاستماع&quot; إلى نشاط الخلايا العصبية 7وتعدل الدوائر العصبية 6،8، وحماية الخلايا العصبية المعوية من الاكسدة 9 وتكون قادرة على توليد الخلايا العصبية المعوية جديدة استجابة للإصابة 10،11. بروتوكول الواردة في هذا الاستعراض التقني يوفر طريقة بسيطة وقوية لدراسة تفاعل معقد بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية باستخدام في الموقع الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التصوير. كاليفورنيا 2+ هو جزيء إشارة في كل مكان في الخلايا منفعل ويلعب دورا أساسيا في الأحداث يشير متشابك في الجهاز العصبي 12. الإثارة من الخلايا العصبية أو الدبقية المعوية يتسبب إرتفاع في هيولي تركيز الكالسيوم 2+ إما عن طريق تدفق الكالسيوم من خلال قنوات 2+ -permeable أو الكالسيوم 2+ إطلاق سراح من مخازن الكالسيوم داخل الخلايا. التصوير كاليفورنيا 2+ العابرين في الخلايا العصبية والدبقية مع الأصباغ الفلورية وثابتة والتقنية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة التنظيم الوظيفي وديناميكيةفي 13-17 ENS. وقد تبين التصوير كاليفورنيا 2+ أن تكون أداة هامة في دراسة سليمة شرائح الأنسجة GI لتوضيح انتشار استثارة من خلال شبكات تنظيم ضربات القلب المحكمة الجنائية الدولية 18 والأمعاء العضلات الملساء 19،20. وهي تمكن الباحثين للتحقيق في طيف واسع من المعلمات الفسيولوجية ويقدم معلومات عن كل من توزيعها المكاني والزماني ديناميات. الخلايا يمكن أن تكون ملطخة بكفاءة بطريقة الغازية الحد الأدنى باستخدام مؤشرات الفلورسنت نفاذية الغشاء والبروتوكولات تلطيخ الأمثل 21. هذا يتيح الفرصة لمراقبة عدد كبير من الخلايا العصبية والدبقية المعوية في الأعمال التحضيرية الحفاظ عليها وظيفيا 14-16،22، وكذلك في الجسم الحي 23. جبل كامل الاستعدادات الأنسجة هي الأكبر محملة عالية تقارب الكالسيوم 2+ مؤشر صبغ مثل فلوو-4 الذي يزيد مضان لها عندما بد أن الكالسيوم 2+. يتم تسجيل التغيرات في مضان بواسطة كاميرا CCD وآناlyzed رقميا 6. قدم ظهور الكالسيوم 2+ الفرصة لمراقبة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية التفاعلات، والاستجابة لمختلف المحفزات، وإشراك أنواع الخلايا هذه في عمليات الجهاز الهضمي في الوقت الحقيقي. في الموقع قد حقق التصوير الكالسيوم 2+ بصيرة آليات الإشارات من الخلايا العصبية المعوية والدبقية وتمتلك عدة مزايا واضحة على نماذج ثقافة الخلية 6،24. أولا، في الموقع استعدادات المحافظة على البيئة مصفوفة الأم من الخلايا العصبية والدبقية وترك الجزء الأكبر من صلاتهم لاستهداف الأنسجة سليمة. وثانيا، فإن علم الوراثة ومورفولوجية الدبقية المعوية مثقف وبشكل ملحوظ مقارنة اختلف في الجسم الحي 6،24. ثالثا، يتم فقدان كثير من التفاعلات غيروي في زراعة الخلايا الأولية وهذه حدود تقييم التفاعلات خلية خلية. على الرغم من أن الخلايا المستزرعة هي مناسبة تماما للتحقيق في الخصائص الأساسية، usefulne بهمSS لدراسة التفاعلات المعقدة بين الدبقية المعوية والخلايا العصبية محدودة. التحقيق تفاعل الخلايا العصبية، الدبقية باستخدام نهج في الموقع أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة كما تبقى مسارات متشابك سليمة 25. بالمقارنة مع النهج ثقافة الخلية، وهو نهج الموقعي في تقدم وتحسن الظروف لفهم منهجي التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية. وعلاوة على ذلك، فإن المنظمة مستو من الضفيرة عقدي في الاستعدادات الكاملة جبل مثالية للتصوير الفلورسنت من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرين ويوفر هذا الأسلوب نهجا واضحة لتقييم نشاط الخلايا العصبية الدبقية في ENS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="764">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:391px;">Name</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">BubbleStop Syringe Heater&#160;</td>
			<td style="width:245px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10-4-35-G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">CaCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">C3306</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:245px;">Gibco</td>
			<td style="width:128px;">17101-015</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dispase</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">42613-33-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:245px;">Roboz&#160;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">DMSO</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">D5879</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fixed-stage microscope</td>
			<td style="width:245px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BX51WI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fluo-4 AM dye</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">F-14201</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Glucose</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">G8270</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Insect pins</td>
			<td style="width:245px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:128px;">Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Andor iQ3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">KCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">P3911</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">MgCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M9272</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S8282</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Neo sCMOS camera</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Neo 5.5 sCMOS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Nicardipine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">N7510</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Perfusion chamber</td>
			<td style="width:245px;">Custom</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:128px;">Model 720</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Pluronic F-127&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">P3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Probenecid</td>
			<td style="width:245px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:128px;">P36400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Scopolamine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S1013&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sutter Lambda DG-4</td>
			<td style="width:245px;">Sutter</td>
			<td style="width:128px;">DG-4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sylgard&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:128px;">184</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Temperature Controller</td>
			<td style="width:245px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:128px;">TC-344C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

الاستخدام السليم لهذه التقنية تسمح للمحققين تقيس بدقة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ [كا 2+] ط العابرين في الخلايا العصبية المعوية والدبقية في جبل لالجامع الاستعدادات الأنسجة. ويرد مثال ممثل ل-أثار ناهض الكالسيوم 2+ الردود في الدبقية ضمن العقدة العضلية المعوية من القولون الماوس في فيديو 1. وتهدف النتائج التالية لتوضيح بعض النتائج التمثيلية التي حصلنا عليها باستخدام هذا الأسلوب. أولا، يوضح الشكل (2) ونتائج تجربة قياس الدبقية المعوية [كا 2+] ط التغييرات ردا على التحفيز عن طريق ATP داخل خنزير غينيا القولون طولية الضفيرة العضلية المعوية العضلات (LMMP) الاستعدادات. على وجه التحديد، ويظهر هذا الرقم أسلوب التحليل السليم للبروتوكول تجريبي المذكورة أعلاه بما في ذلك الخطوط العريضة للالعقدة، والنجمة تدل على مكان الخلايا العصبية العضلية المعوية المعوية تحليلها. هذه النتائج أيضا طllustrate الجرعة المثلى من مائة ATP مكرومولي على تعبئة [كا 2+] i في خنزير غينيا الدبقية العضلية المعوية. هذا الرد يمكن أن تستخدم لمعايرة التحفيز الدبقية المعوي وتطبيع الردود على اختبار المحفزات. وبعد ذلك، بالتعريف الشكل (3) كيفية تحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية بشكل صحيح، كما هو موضح مع توضيح الدوائر الصفراء. تظهر هذه النتائج أيضا التغييرات مضان المطلوب في ظل الظروف القاعدية واستجابة للمؤثرات الدوائية. وأخيرا، يوضح الشكل 4 الاعتبارات المكانية لاختيار الدبقية المعوية والخلايا العصبية ل[كا 2+] ط الردود في الاستعدادات الكاملة جبل. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> الشكل 1. منظمة ENS. وتتضمن ENS اثنين من الضفائر عقدي الرئيسية. يقع الضفيرة العضلية المعوية بين لطبقات العضلات ongitudinal ودائرية. يقع الضفيرة تحت المخاطية بين الغشاء المخاطي وطبقة العضلات الدائرية. وتتألف ENS فقط من الخلايا العصبية والدبقية المعوية. مساحات الألياف العصبية تربط العقد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> الشكل 2. المعوية الدبقية في خنزير غينيا القولون الضفيرة العضلية المعوية الاستجابة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) فلوو-4 مضان في العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع) في ظل الظروف القاعدية. وتشير الأسهم لمساحات سميكة من الألياف بين العقد. (ب) عند التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية، ولكن ليس الخلايا العصبية، وزيادة بسرعة فلوو-4 مضان مما يشير إلى زيادة في [كا 2+] <sUB&gt; ط. لاحظ أن خلايا الاستجابة صغيرة وتحيط الخلايا العصبية أكبر من ذلك بكثير (الأماكن المظلمة تميزت العلامات النجمية). (C) الدبقية المعوية تستجيب لATP بطريقة تعتمد على الجرعة مع 1 مليمول / L مثيرة لاستجابات القصوى 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> الشكل 3. الفئران S-100-GFP + الخلايا في القولون العضلي المعوي الاستجابة الضفيرة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) S-100-GFP + الخلايا الدبقية (الأخضر) في الماوس القولون العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع). وتظهر ست مناطق من الفائدة (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية ضمن العقد كما الدوائر الصفراء. السهام تشير مساحات الألياف سميكة المؤدية إلى العقدة. النجمة دموقع enote من 2 الخلايا العصبية المعوية. (ب) نفس العقدة تظهر Rhod-2 مضان في ظل ظروف القاعدية. (C) وبعد التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية تستجيب مع زيادة [كا 2+] أنا كما يتضح من زيادة Rhod- 2 مضان. (D) آثار المقابلة لكل ROI هو مبين في A-C. (E) بلغ متوسط ​​استجابة (يعني ± SEM) من 6 رويس هو مبين في D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> الشكل 4. في مجال التصوير الموقع من المعوي الاتصالات العصبية إلى الدبقية. (A) صور الممثل (pseudocolored) من تجربة التصوير الكالسيوم 2+ حيث كله جبلوطعن إعداد الضفيرة العضلية المعوية مع الخلايا العصبية P2X7 مستقبلات ناهض BzATP (100 ميكرومتر، 30 ثانية). لاحظ أن ناهض العصبية يسبب زيادة في Fluo4 مضان في الخلايا العصبية (A &#39;) قبل المحيطة بها الخلايا الدبقية المعوية (A &quot;). (ب) تحليل التغير في مضان على مر الزمن في الدبقية (الأزرق) والخلايا العصبية (الحمراء ) بعد تطبيق ناهض الخلايا العصبية، BzATP. (C) العصبية واستجابات الدبقية لBzATP في المخزن العادي (خطوط الصلبة) وفي العازلة التي تحتوي على الكالسيوم منخفض 2+ والمغنيسيوم 2+ (الخطوط المتقطعة) لتحفيز مستقبلات P2X7 العصبية (13). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> فيديو 1. أثار ناهض الكالسيوم 2+ رد في الدبقية المعوية فيالموقع. يظهر هذا الفيديو على العقدة العضلية المعوية من القولون البعيدة الماوس محملة كا 2+ صبغ المؤشر، فلوو-4. ناهض الخلايا الدبقية، ADP، يضاف إلى الحمام عند اللزوم. ADP يتسبب زيادة في الكالسيوم داخل الخلايا الدبقية في 2+ المعوية كما لوحظ من خلال الارتفاع عابر في فلوو-4 مضان. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System at JoVE.com

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.0K Views.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Video: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

توصيل البراز المضاد للندرة في الجهاز العصبي المركزي للفئران

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...