Nous tenons à remercier le Dr Scott Henderson pour aider à la microscopie confocale. Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health 1RO1CA127501 à WAB ainsi que le financement du projet pilote du Centre du cancer Massey et Ecole de Médecine (ECV) à la microscopie WAB a été réalisée à l&#39;ECV-Dept. de neurobiologie et de microscopie anatomie, pris en charge, en partie, grâce au financement du Centre NIHNINDS coeur 5P30NS047463 subvention.

Le protocole comprend trois étapes principales. La première, le clonage étape de votre gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;expression mammifère aminés terminale aux versions monomères de PCP et / ou YFP ne sera discuté brièvement. Les deuxième et troisième étapes; transfection d&#39;ADN vecteur dans EA.hy926 cellules endothéliales, et l&#39;imagerie confocale avec FRET, sont décrits plus en détail ci-dessous. 1. La construction de récepteurs chimériques CFP et YFP Récepteurs d&#39;intérêt devrait être cloné aminés terminale à monomérique des versions améliorées de CFP et YFP. Détermination de FRET est empirique et dépend essentiellement de la longueur de liaison entre le transmembranaire couvrant la région et le début du fluorophore 1. Par conséquent, différentes longueurs de linker doivent être explorées pour chaque paire de récepteurs de nouveau sous enquête. <ol><li> Dans le R pcDNA3.1 hygro ou néo R vecteur contenant monomère C ou YFP (ce vecteur peut être obtenu à partir de notre laboratoire), clone de votre récepteur d&#39;intérêt dans les sites Nhel / EcoRI. * Remarque: si nécessaire, Nhel est compatible plusieurs autres enzymes, y compris Spel et Xbal. </li><li> Transformez votre réaction de ligature dans une ligne appropriée endA1 recA cellule compétente (Nous utilisons régulièrement Mach1). Colonies d&#39;écran pour la présence de l&#39;insert suivi par séquençage de l&#39;ADN pour vérifier l&#39;absence de mutations. </li><li> Dès l&#39;obtention de conformation de clonage moléculaire de succès, de préparer l&#39;ADN du vecteur de transfection de qualité dans de l&#39;eau stérilisée ou TE utilisant Qiagen, ou similaire kits ADN,. Évaluer la concentration et la pureté en utilisant la spectroscopie UV. Les rendements typiques de l&#39;ADN devrait être de l&#39;ordre de 100-200 mg, qui est habituellement diluée à un stock de travail de 1 ug / uL. </li></ol> 2. La transfection de cellules 926 EA.hy <ol><li> Fractionner EA.hy 926 cellules 4, cultivé en complète-DMEM (DMEM 10% sérum de veau fœtal + pen. / Strep.) Dans MatTek lamelle (n ° 0) 35 plats mm avec 2 ml de milieu. Vous pouvez obtenir des conservatrice ~ 15 plats (~ 90% de confluence le jour suivant) d&#39;un plat de 15 cm confluentes. Préparer un plat pour évaluer l&#39;expression de chacun des récepteurs individuels, ainsi que d&#39;un plat pour chaque paire de récepteur. </li><li> Laisser les cellules à incuber pendant la nuit dans atmosphère de CO 2 de 5% à 37 ° C. Le jour suivant, les cultures doivent être confluentes ~ 70-90%. </li><li> Le jour de la transfection, de préparer les complexes nucléolipidiques en mélangeant 2 ug de l&#39;ADN du vecteur récepteur chimérique (2 ul) avec 8 uL d&#39;FuGENE6 dans 200 ul de pré-chauffé OptiMEM. Pour les couples récepteur, transfecter avec 1 pg de chaque récepteur, pour un total de 2 pg (Voir aussi la discussion ci-dessous). </li><li> Mélanger doucement par inversion. </li><li> Continuer à incuber à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Pendant la période d&#39;incubation, préparer les cellules pour la transfection. Aspirer des milieux frais et laver chaque assiette doucement et brièvement avec du PBS tiède avant l&#39;ajout de 2 mL préchauffé complète-DMEM sans antibiotiques (DMEM + FBS). Il est important d&#39;éviter la présence de pénicilline et de streptomycine, car ils sont beaucoup plus toxiques pour les cellules pendant le traitement avec FuGENE6. </li><li> Ajouter la baisse complexes sage de cellules et incuber pendant une heure supplémentaire de 20 à 24 à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5%. </li><li> Après 24 heures, aspirer délicatement les médias à partir des cellules et la pipette fraîche complète-DMEM avec des antibiotiques. Après transfection, la viabilité cellulaire devrait rester relativement élevé, c&#39;est à dire peu ou pas de cellules flottantes doivent être observées. </li><li> L&#39;expression des gènes est généralement maximale après une heure supplémentaire de 48 à 60 après la transfection. Cependant, l&#39;imagerie est généralement possible dans le plus court de 24 heures. Expériences bien sûr du temps pour l&#39;expression des gènes optimale doit être effectuée. </li></ol> 3. Imagerie confocale et analyse FRET Imagerie des cellules vivantes est effectuée sur un Leica TCS-SP2 microscope confocal à balayage laser AOBS équipé de diodes bleues (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm). verte HeNe (543 nm), orange HeNe (594 nm) et rouge HeNe (633 nm) des lasers, une HCX PI Apo 63x/1.3 lentilles na objectif de glycérine immersion, un motorisé XY (Märzhäuser), et un environnement contrôlé ( température, l&#39;humidité et le CO 2) stade de l&#39;incubateur (PeCon). Contrôles expérimentaux sont essentielles pour éliminer fluorophore diaphonie entre les canaux d&#39;émission ainsi que d&#39;évaluer les problèmes d&#39;expression et de multimérisation fluorophore non spécifiques. En tant que tel, transfections fluorophore unique sont utilisés pour la mise en place chaque session de l&#39;image. Negative FRET contrôles (en utilisant des récepteurs connus non interagissant) devront être effectués, afin de déterminer l&#39;arrière-plan FRET qui se produit en raison de l&#39;expression plus. <ol><li> Pour éliminer la diaphonie entre les canaux d&#39;émission pour les CFP et YFP, placer le contrôle d&#39;expression de la PCP dans l&#39;incubateur scène. Utilisation de la lumière blanche, ajuster le Z-plaque pour se concentrer surpour les cellules. </li><li> Réglez les paramètres de fenêtre SP pour la détection des émissions de PCP à 465-505 nm et 525-600 nm pour la YFP. </li><li> Bien que la surveillance des deux canaux d&#39;émission, excitent la PCP à 458 nm. Utilisation de la AOTF, réglez la puissance du laser pour éliminer saignent plus appréciables de la PCP dans le canal d&#39;émission YFP. Enregistrer ce paramètre. </li><li> Effectuer le même contrôle pour YFP diaphonie (en utilisant le contrôle d&#39;expression YFP) dans le canal PCP en ajustant la puissance d&#39;excitation à 514 nm pour les cellules exprimant la YFP seulement. Enregistrer ce paramètre. </li><li> Cellules de lieu Suivant co-exprimant CFP et YFP dans l&#39;incubateur scène. Utilisation de la mise en séquence pour le logiciel Leica confocale, de localiser les cellules exprimant des niveaux similaires de CFP et YFP avec localisation membrane propre. </li><li> En utilisant l&#39;accepteur logiciel Leica photo-décoloration programme, définir les paramètres de donneur et accepteur de votre PCP sauvé et les paramètres de la YFP, respectable. </li><li> Zoom sur la cellule, sélectionnez un ROI (région d&#39;intérêt) dans lequel la photo-destruction de la YFP est de se produire sur la membrane cellulaire et de commencer le programme. </li><li> Pour la photo-destruction de l&#39;accepteur, ajuster la AOTF à 100% à 514 nm et de permettre au laser de blanchiment de continuer jusqu&#39;à 70% de l&#39;émission YFP a été épuisé. Pour accélérer le blanchiment, ROIs sont généralement choisis dans l&#39;axe trame du laser (axe X). </li><li> Lors de photo-blanchiment, de surveiller le mouvement cellulaire et de rejeter les mesures obtenues avec le mouvement appréciable dans le plan XY, que ces mesures peuvent faux rapport FRET efficacité. </li><li> Des images pré-et post-blanchiment sont enregistrées à la fois pour les donateurs (PCP) et accepteur (YFP) et l&#39;efficacité de FRET est calculé comme suit: FRET Eff = (D après-D pré) / D post pour tous les poste D&gt; D où D pré pré et D est l&#39;intensité après donneur avant et après photoblanchiment respectivement. </li><li> JMP Software (SAS) est utilisé pour déterminer l&#39;étendue de la variabilité expérimentale. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Efficacités de transfection sont généralement entre 30 à 40%. Malgré les conclusions précédentes par d&#39;autres, nous n&#39;avons pas vu que la transfection et l&#39;expression d&#39;un vecteur favorise celle de l&#39;autre. En effet, nous observons fréquemment l&#39;expression exclusive d&#39;un fluorophore chimère ou de l&#39;autre. Typiques FRET efficacités varient entre les systèmes récepteurs. Pour que le système récepteur Tie, les valeurs typiques sont 20-28% pour les cellules épithéliales et 19-23% dans les cellules endothéliales. Pour les contrôles négatifs, les rendements typiques sont inférieurs à 2-3%. L&#39;étendue de la variabilité diminue considérablement avec l&#39;expérience. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Des images représentatives de transfectées EA.hy 926 cellules. Une image) DIC de monocouche cellulaire EA.hy 926. B) image de fluorescence des cellules affichées dans (A). C) Superposition de (A) et (B) ~ démontrant l&#39;efficacité de transfection de 20-30%. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Accepteur Représentant photo-décoloration analyse de FRET survenant entre CFP et YFP dans une cellule EA.hy926. La PCP émission de canal (haut) et d&#39;émission de canal YFP (en bas deux panneaux) ont été évalués séparément, avant et après l&#39;accepteur photoblanchiment. Expériences de photoblanchiment ont été limités à, et FRET valeurs calculées à partir, dans la région au sein de la boîte verte. FRET efficacité est affichée comme une plage absolue de haute (rouge-1.0) à faible (violet-0.0) sur une superposition agrandie d&#39;une CFP / YFP a fusionné l&#39;image à des fins d&#39;orientation uniquement.

<ol>
	<li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins.">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands.">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li></ol>

Il ya plusieurs étapes qui sont essentiels à la réussite. Les plus éminents d&#39;entre eux est le niveau relatif d&#39;expression entre les deux récepteurs chimériques. Pour contourner ce problème, on peut faire des lignées cellulaires stables exprimant à la fois des protéines d&#39;intérêt, ou d&#39;identifier des ratios optimaux de l&#39;ADN de vecteur pour permettre l&#39;expression équivalente. De même, pour cause de non-uniforme de transfection dans un plat, les taux de protéines seront rarement équivalentes entre les cellules. Par conséquent, il faut faire attention de distinguer «élevé» expresseurs de «faible». Ceux que les niveaux «moyen» d&#39;affichage de protéines généralement le rendement fiables et reproductibles FRET efficacité. Une méthode de notre laboratoire a poursuivi pour soulager ce problème est l&#39;utilisation des adénovirus et des virus à lenti-expression du gène &#39;pair&#39;. Par ailleurs, une méthode alternative à la photo-blanchiment d&#39;accepteur pour déterminer l&#39;efficacité de FRET est l&#39;émission sensibilisés. Bien que, malgré le potentiel d&#39;émission sensibilisés à surveiller les cellules individuelles en temps réel, nous avons trouvé de photo-blanchiment d&#39;accepteur d&#39;être plus sensible et plus fiable. Enfin, en utilisant le FRET pour surveiller les interactions entre protéines peut être difficile, et nécessite une sélection rigoureuse des longueurs de liaison pour les récepteurs membranaires liées. Par ailleurs, l&#39;ajout de C / YFP souvent une grande influence sur les niveaux d&#39;expression des protéines et des résultats de l&#39;agrégation dans le réticulum endoplasmique et l&#39;appareil de Golgi. Toutefois, pour des interactions transitoires, ou instable, FRET est la méthode idéale à utiliser.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11960-069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin- Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15070-063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11058-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FUGENE 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslip Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G014C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pcDNA3.1(+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>V790&#x2010;20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mach 1 Competent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C862003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

imaging protein-protein interactions in vivo

Interactions protéine-protéine sont une caractéristique de tous les processus essentiels cellulaire. Cependant, beaucoup de ces interactions sont transitoires ou énergétiquement faibles, ce qui empêche leur identification et leur analyse par des méthodes traditionnelles biochimiques tels que la co-immunoprécipitation. À cet égard, les protéines génétiquement codable fluorescente (GFP, RFP, etc) et leurs associés se chevauchent spectre de fluorescence ont révolutionné notre capacité à surveiller les interactions faibles in vivo en utilisant le transfert d&#39;énergie par résonance Förster (FRET) 1-3. Ici, nous détaillons notre utilisation d&#39;un dosage de la proximité FRET pour la surveillance des interactions récepteur-récepteur à la surface des cellules endothéliales.

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Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Ce protocole décrit comment l&#39;image interactions protéine-protéine en utilisant un dosage de proximité basée sur le FRET.

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

21.2K vues.  Virginia Commonwealth University. Ce protocole décrit comment l'image interactions protéine-protéine en utilisant un dosage de proximité basée sur le FRET.

Vidéo: Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-ubiquitine membrane à base de levure double hybride (MYTH) Système: Un outil puissant pour identifier les interactions entre protéines

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Recherche

Biologie

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Développement d&#39;inhibiteurs de interactions protéine-protéine REMPLACER travers: Application à la conception et les inhibiteurs de CDK concurrentiel développement non-ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...