نشكر السيد هاجيمي Ichijo النصائح لتسجيل الفيديو ومفيدة لتحرير الفيديو. ونحن نشكر أيضا Drs.Yuji Tsunekawa وYoshizaki Kaichi لمساعد النوع لتسجيل الفيديو. ويدعم هذا العمل KAKENHI على B والعلماء الشباب على العلوم الأولوية مناطق الدماغ الجزيئية من وزارة التربية في اليابان. نعترف دعم البرنامج العالمي لمجلس أوروبا &quot;مركز البحوث الأساسية وبالحركة العالمية للعلوم الدماغ&quot; من وزارة التربية واليابان للأبحاث الأساسية للعلوم والتكنولوجيا تطوري (كريست) من العلوم اليابانية وشركة التكنولوجيا اليابانية من علوم والتكنولوجيا وكالة (JST) .

1. إعداد نظام WEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشترك غشاء 0.22 ميكرون تصفية لمدخل أنبوب السيليكون داخل النظام WEC أ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صمام اسطوانة الغاز التي تحتوي على O 2 (95 ٪) وثاني أكسيد الكربون 2 (5 ٪). تدفق خليط الغاز في طبلة عن طريق زجاجة تحتوي على فقاعات الماء تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حجم تدفق خليط الغاز إلى 50 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف إلى ترك أنبوب السيليكون في زجاجة المياه وفحص تدفق خليط الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير أسطوانة بسرعة 20 دورة في الدقيقة / دقيقة. </li></ol> 2. إعداد مستنبت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران ذوبان الجليد على الفور ، طرد (IC) في مصل الدم 37.0 درجة مئوية ب). إضافة D - غلوكوز (2 ملغ / مل) في المصل مذوبة في الدورق 100 مل تعقيمها. وينبغي إعداد المتوسطة الثقافة على مستوى الثقافة الأساسية (على سبيل المثال ، وذلك باستخدام غطاء محرك السيارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مضاد فطري للمضادات الحيوية (100X) السائل إلى المصل مع 1 : 400 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبخير isoflurane المتبقية (بسبب تخدير الفئران خلال جمع الدم) من المصل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم مستنبت باستخدام الغشاء 0.45 ميكرون التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 3.0 مل من المتوسط ​​في كل زجاجة الثقافة وختم أعلى كل زجاجة مع المكونات السيليكون ، مع تغطية احباط الالومنيوم (أنظر المرجع 14) د). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثلاثة أو أربعة أطباق بتري تحتوي على التخلص من المياه المالحة Tyrode ه). </li></ol> 3. التخدير من الفئران والعزلة الرحم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران الحوامل توقيت - عميقا مع التخدير بالحقن أو الاستنشاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف منطقة البطن من الفئران الحوامل في تخدير مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلتقط الجلد مع ملقط وexteriorize جدار البطن عن طريق قطع الجلد مع و مقص كبير). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقط جدار البطن مع زوج من الملقط واجري على شكل حرف U شقوق طولية كبيرة على جدار البطن مع مقص كبير يصل إلى مستوى الصدر ز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدب بعيدا الأمعاء إلى الجانب الأيسر مع زوج من الملقط وفضح واحدة من نهاية الرحم متصلة المبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقط نهاية الرحم مع زوج من الملقط وقطع الموقف بين الرحم والمبيض مع مقص كبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج الرحم من الفئران الحوامل عن طريق خفض الدهون حول الرحم حتى نهاية أخرى من الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم على طبق بتري تحتوي على Tyrode المالحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفأر من قبل إدارة المفرط للمواد التخدير أو خلع عنق الرحم بعد إزالة الرحم. </li></ol> 4. إزالة الأجنة من الرحم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف لفترة وجيزة في الرحم Tyrode المالحة وتحويلها إلى طبق بيتري الثانية مع زوج من غرامة ملقط ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر مجهر ، والتقاط جدار الرحم مع زوج من غرامة وملقط قطع جدار الرحم في الجانب المعاكس للmesometrium التواصل مع الأوعية الدموية باستخدام مقص العيون على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج غيض من مقص العيون مباشرة الى المسافة بين جدار الرحم والساقط. قطع جدار الرحم طوليا على طول الجانب antimesometrial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتجمع في الساقط على الجانب mesometrial conceptuses ومنفصلة عن الرحم باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة ط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> conceptuses نقل إلى طبق بيتري الثالث برصيد ماصة زجاجية معقمة بقطر مناسب. </li></ol> 5. تشريح للأجنة الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج أحد غيض من microforceps في الساقط وإحداث شق عرضي على الساقط حول محصول الحمل مع اثنين من أزواج من الملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج نصائح من الملقط في الساقط على الجانب المشيمة وجعل اثنين من الشقوق الطولية على الساقط إلى الأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الساقط على الجانب المشيمة التي باقتلاع ذلك مع اثنين من أزواج من الملقط. إزالة الساقط المتبقية مع اثنين من أزواج من الملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلتقط غشاء رايخرت ، وجعل شق أفقي على ذلك ، وفصل الغشاء من الحمل المستكن في الجانب المعادي المشيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل ثقب صغير في كيس المح بالقرب من رأس الجنين مع اثنين من أزواج الملقط ، وقطع كيس المح مع زوج من مقص العيون منحنية. فمن المهم ألا يدمر الاوعية الدموية الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقط السلى في موقع حول الرأس الجنين مع اثنين من أزواج ملقط غرامة ، وبرفق خارج الجنين من كيس المح من قبل تمزيق ح سلى). ينبغي سحب جسم الجنين من كيس المح لزيادة المعروض من الاوكسجين للجنين في مرحلة midgestation. </li></ol> 6. ثقافة بأكملها الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من الأضرار على المشيمة ، كيس المح ، وحالة الضرب القلب والدورة الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يكون على علم لا تمتد الحبل السري ، ونقلالجنين الى زجاجة الثقافة مع ماصة الزجاج المعقمة. وينبغي أن تحمل أكثر من المياه المالحة Tyrode لزجاجات ثقافة يكون أقل قدر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المكونات غير السيليكون من ثقب طبلة المدورة. توصيل زجاجة الثقافة مع المكونات مع وجود ثقب في طبلة المدورة للنظام WEC عموديا. يجب الحرص على عدم وضع القوة على الطبل في اتجاهات غير مناسبة منذ طبل المدورة هي معدات دقيقة للغاية. يتم نقل الزجاجات التي تحتوي على الجنين تشريح للثقافة واحدا تلو الآخر ، وينبغي التقليل من فتح الباب أمام حاضنة لتجنب حرارة الحاضنة وانخفض ي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 ساعة من الثقافة ، وزيادة حجم تدفق خليط الغاز يصل الى 75 سم وحتى 100 سم مكعب بعد 24 ساعة (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي تغيير الثقافة المتوسطة نحو 24 ساعة عن طريق نقل الجنين مثقف في زجاجة جديدة مع الثقافة المتوسطة الطازجة. زيادة حجم تدفق ما يصل الى 125 سم مكعب بعد 34 ساعة وحتى 150 سم مكعب بعد 48 ساعة (الجدول 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار في بعض الأحيان حالة من أجنة مثقف عن طريق العد معدل ضربات القلب (أي 120-150/min هو الأمثل) ، ومراقبة الدورة الدموية. إذا كان المطلوب حساب عدد somites للحكم على نمو الأجنة في المياه المالحة في Tyrode. في التطور الطبيعي ، وأضيف الجسيدة في ساعتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من WEC ، ووقف إمدادات الغاز وخليط قطع أنبوب مدخل والغشاء تصفية لتجنب العودة الى تدفق أنبوب مدخل من الزجاجة محتدما. </li></ol> 7. تلاحظ <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الاحتفاظ باستمرار على درجة الحرارة داخل النظام في WEC 37،0-37،5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم بشكل روتيني 100 ٪ IC المصل في الفئران WEC لدينا أجنة الجرذان والفئران ، والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن شراء المصل IC الفئران ، والتي يتم جمعها من الفئران التي تم تخدير مع isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زجاجات يمكن التخلص منها وتتوفر أيضا من Ikemoto ريكا. يجب تعقيمها الزجاجات والمقابس السيليكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي إجراء تشريح للأجنة في RT لأن الحفاظ على الأجنة في درجة حرارة منخفضة أو مرتفعة خلال تشريح تؤثر على التطور اللاحق في WEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعقيم الأدوات اللازمة لتشريح بواسطة الحرارة الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تقطع الجلد وجدار البطن بشكل منفصل لتجنب التلوث من الشعر في صحن ممكن. نغير مقصا كبيرا وملقط مع زوج جديد من لهم عندما نقطع الجلد وعزل الرحم ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط الذي على ما يرام نصائح مهمة جدا لتشريح الأنسجة بالتأكيد. علينا شحذ يدويا نصائح من ملقط بحجر والنفط الآلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم جانب واحد من مثل سكين ملقط لتجنب الضغط الزائد على الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون درجة الحرارة داخل النظام WEC النقصان من خلال فتح الباب مرارا وتكرارا ، ما زلنا لتشغيل الضوء للحفاظ على درجة الحرارة داخل النظام. </li></ol> 8. ممثل النتائج الشكل 1 يبين إجراءات تشريح الجنين الجرذان والفئران مثقف الأجنة. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الجامع ثقافة الجنين الجنين E12.5 الفئران. (أ) من الحمل المستكن تشريح الرحم من الفئران الحوامل. (ب) إزالة الساقط على الجانب المشيمة. (ج) إزالة غشاء رايخرت. (د) فتح الكيس المحي. (E) وزراعة الأجنة الفئران في زجاجة لمدة 6 ساعة بعد بداية WEC. (F) وجنين فأر تربيتها لمدة 42 ساعة. د ، الساقط ؛ R ؛ غشاء رايخرت ، P ، المشيمة ؛ YS ، الكيس المحي ، البريد ، الجنين. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 0 ساعة </td><td> 12 ساعة </td><td> 24 ساعة </td><td> 36 ساعة </td><td> 48 ساعة </td></tr><tr><td> E12.5 جنين فأر </td><td> 95 ٪ 50 سم </td><td> 95 ٪ 75 سم (10 ساعة) </td><td> 95 ٪ 100 سم مكعب </td><td> 95 ٪ 125 سم مكعب (34 ساعة) </td><td> 95 ٪ 150 سم مكعب </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الشرط الأمثل الأوكسجين.

<ol>
	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoroduction.+In+mammalian+postimplantation+embryos.">Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).</li><li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mammalian+embryos.">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).</li><li>Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+rodent+embryos+during+the+early+postimplantation+period.">In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period.</a> Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro.">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li><li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate.">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li><li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5.">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li><li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6::EGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization.">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في WEC القوارض للنجاح. أولا ، ينبغي إجراء تشريح لا تكون دقيقة إلى الأجنة الضرر ، لا سيما الأوعية الدموية. ثانيا ، ينبغي أن يكون الإجراء في أسرع وقت ممكن لأن الاوكسجين والمغذيات لم تعد الموردة عبر المشيمة بعد العزلة من الرحم. هذا أمر بالغ ال?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> نوع </td><td> شركة </td><td> رقم كتالوج </td><td> تعليق </td></tr><tr><td colspan="5"> إعداد WEC </td></tr><tr><td> WEC النظام (10-0310) </td><td> أداة </td><td> Ikemoto ريكا </td><td> 010-0310 </td><td> نموذج آخر صغير هو متاح أيضا. </td></tr><tr><td> السيليكون المكونات بدون حفرة </td><td> أداة </td><td> Ikemoto ريكا </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> اسطوانة الغاز المخلوط </td><td> أداة </td><td> نيكو Sanso </td><td> -- </td><td> تحتوي على 95 ٪ أكسجين و 5 ٪ من ثاني اكسيد الكربون. عرف النظام. </td></tr><tr><td> منظم الغاز </td><td> أداة </td><td> أونو Seisakusho </td><td> WR - 11 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 ميكرون تصفية Millex GS </td><td> أداة </td><td> ميليبور </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> التخدير والعزلة الرحم </td></tr><tr><td> مقص كبير </td><td> أداة </td><td> Napox </td><td> B - 7H </td><td></td></tr><tr><td> ملقط </td><td> أداة </td><td> Napox </td><td> A - 3-2 </td><td></td></tr><tr><td> التخلص طبق بتري (90 ملم × 15 ملم) </td><td> أداة </td><td> Iwaki </td><td> SH90 - 15 </td><td> العميق من نوع الطبق هو أفضل لتشريح. </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> الكاشف </td><td> ابوت </td><td> B506 </td><td> للتخدير </td></tr><tr><td> بنتوباربيتال الصوديوم </td><td> الكاشف </td><td> شيرينغ بلاو صحة الحيوان </td><td> -- </td><td> للتخدير </td></tr><tr><td> Tyrode في المياه المالحة </td><td> الكاشف </td><td> -- </td><td> -- </td><td> وفقا للبروتوكول كما في المرجع. 2. حفظ في 4 درجات مئوية. </td></tr><tr><td> توقيت الحامل ، سبراغ داولي </td><td> حيوان </td><td> تشارلز ريفرز مختبرات اليابان </td><td> -- </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> إعداد مستنبت </td></tr><tr><td> ثقافة زجاجة </td><td> أداة </td><td> Ikemoto ريكا </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> التخلص من ثقافة زجاجة </td><td> أداة </td><td> Ikemoto ريكا </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> السيليكون المكونات مع ثقب </td><td> أداة </td><td> Ikemoto ريكا </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> رقائق الالومنيوم </td><td> أداة </td><td> أي شركة </td><td> -- </td><td></td></tr><tr><td> التعقيم الحقيبة </td><td> أداة </td><td> Hogy </td><td> HM - 26 </td><td> الزجاجات الثقافة </td></tr><tr><td> التعقيم الحقيبة </td><td> أداة </td><td> Hogy </td><td> HM - 14A </td><td> لسدادات السيليكون </td></tr><tr><td> 0.45 ميكرون تصفية Millex HA </td><td> أداة </td><td> ميليبور </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 مل أنبوب مخروطي </td><td> أداة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 100 مل دورق </td><td> أداة </td><td> Iwaki </td><td> TE - 32 </td><td></td></tr><tr><td> IC مصل الجرذان </td><td> الكاشف </td><td> تشارلز ريفرز مختبرات اليابان </td><td> -- </td><td> الرجوع إلى : السيد كونيهيكو Morisaki ، هاتف : +81- (0) 45-474-9336 ؛ فاكس : +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+) - الجلوكوز </td><td> الكاشف </td><td> واكو </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> المضادات الحيوية السائلة antimyotic </td><td> الكاشف </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> تشريح للأجنة </td></tr><tr><td> مقص العينية على التوالي </td><td> أداة </td><td> Napox </td><td> MB50 - 7 </td><td> لقطع جدار الرحم </td></tr><tr><td> مقص منحني البصريات </td><td> أداة </td><td> Napox </td><td> MB54 - 2 </td><td> لقطع الكيس المحي </td></tr><tr><td> ملقط # 5 </td&gt; <td> أداة </td><td> قوة </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط # 5F </td><td> أداة </td><td> ريجين </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> ماصة الزجاج </td><td> أداة </td><td> -- </td><td> -- </td><td> مصنوعة يدويا باستخدام ماصة باستور. </td></tr><tr><td> التعقيم الحقيبة </td><td> أداة </td><td> Hogy </td><td> HM - 4 </td><td> ماصات للزجاج </td></tr><tr><td> مجهر مجهر </td><td> أداة </td><td> لايكا </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> ضوء </td><td> أداة </td><td> لايكا </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> النفط حجر </td><td> أداة </td><td> أوشيدا يوكو </td><td> 833-2000 </td><td> لشحذ ملقط </td></tr><tr><td> آلة النفط </td><td> أداة </td><td> أوشيدا يوكو </td><td> 835-0000 </td><td> لشحذ ملقط </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

وقد وضعت كلها الجنين الثقافة (WEC) في عام 1950 أسلوب جديد من قبل وزملائه ، وقدم طلبا للعلم الأحياء التطوري 1. على الرغم من تطور ونمو أجنة من الثدييات التي تعتمد بشكل حاسم على وظيفة المشيمة ، WEC تقنية تسمح لنا الماوس الثقافة وأجنة الفئران السابقين شرط المجراة خلال فترات محدودة الموافق المراحل الجنينية midgestation خلال اليوم (E) 6.5 في E12.5 الماوس أو E8.5 - E14.5 في الفئران 2 ، 3 ، 4. في WEC ، يمكننا مباشرة الهدف المنشود مجالات الاجنة باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاج لأنه لا يمكن التلاعب بها أجنة تحت المجهر. لذلك ، WEC القوارض هو تقنية مفيدة جدا عندما نريد دراسة العمليات التنموية الحيوية للأجنة الثدييات postimplanted. حتى الآن ، وقد تم تطوير عدة أنواع من النظم WEC 1. من بين هؤلاء ، زجاجة الثقافة المدورة من نوع النظام هو الأكثر شعبية ومناسبة على المدى الطويل ثقافة أجنة في midgestation ، أي بعد وE9.5 E11.5 في الفأر والجرذان ، على التوالي 1. في هذا البروتوكول الفيديو ، ونظهر بمستوى إجراءاتنا WEC الفئران بعد E12.5 باستخدام نموذج راق في النظام المدورة الأصلي ، الذي صممه كوكروفت جديدة و 5 و 6 ، وإدخال مختلف تطبيقات تقنية WEC للدراسات الإنمائية في الثدييات البيولوجيا.

Watch this Scientific Journal Video about The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System at JoVE.com

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

ثقافة بأكملها تقنية الجنين يسمح لنا الماوس الثقافة وأجنة الفئران<em&gt; خارج الحي</em&gt; حالة فترات محدودة خلال المقابلة الى مراحل midgestation. في هذا البروتوكول الفيديو ، ونظهر إجراءاتنا القياسية للثقافة الفئران الجنين كله بعد E12.5 باستخدام زجاجة الثقافة المدورة من نوع النظام.

الطريقة الثقافة القوارض باستخدام الأجنة الجامع للثقافة الدوار زجاجة من نوع النظام

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Views.  Tohoku University Graduate School of Medicine. ثقافة بأكملها تقنية الجنين يسمح لنا الماوس الثقافة وأجنة الفئران خارج الحي حالة فترات محدودة خلال المقابلة الى مراحل midgestation. في هذا البروتوكول الفيديو ، ونظهر إجراءاتنا القياسية للثقافة الفئران الجنين كله بعد E12.5 باستخدام زجاجة الثقافة المدورة من نوع ?...

Video: The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

الفأر الجنينية الثقافة الرئة ، وهو نظام لتقييم الآليات الجزيئية من التفرع

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

و السابقين البيضة الثقافة الأجنة النظام الدجاج مناسبة للتطبيقات التصوير والجراحة المجهرية

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

أسلوب الثقافة شريحة لوبعد تطور الجراثيم الأسنان في يزدرع الثقافة

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

إعداد الجرذ مصل مناسب للالثدييات الجامع الثقافة الأجنة

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

تقييم الخصائص الوعائية الوراثية للخلايا الشبيهة بسرطان المبيض باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثي الأبعاد ، NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.