نود أن نشكر مختبر Hadjantonakis A. (معهد سلون كيترينج) ومختبر Niswander L. (U - دنفر كولورادو) للحصول على المشورة المفيدة مع تقنيات التشريح والثقافة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل NRSA NS059562 لJDG وRO1NS05897 لمير بالتعاون مع Niswander لام وياء نادو (معهد بيولوجيا الأنظمة).

1. يتم سرد كافة الكواشف في الجدول رقم 1 -- إعداد وسائل الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصل الفئران الذكور ذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة تعطيل مصل الفئران لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في مصل الفئران لمدة 5 دقائق 10K في درجة حرارة الغرفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 50:50 طاف والاختلاط مع الفينول الحمراء ث DMEM الحرة / الجلوكوز السامية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم وسائل الإعلام باستخدام حقنة أم تصفية 0.45 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تكون مستعدة على الأقل من وسائل الإعلام 1ml / جنين </li></ol> 2. عزل الرحم من السد حامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الإجراءات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) ، والسد حامل تخدير الأولى والتضحية ثم خلع عنق الرحم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم البطن مع EtOH 70 ٪ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة مسار صغيرة من الجلد على طول خط الوسط ، تماما فوق خط الحلمة ، مع ملقط الكبيرة وفتح البطن تحت ملقط الخاص مع مقص كبير. يجب الحرص على عدم الاضرار بأي الهيكل الداخليق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص لقطع أفقيا الخاص من فتح أولية تجاه كل جانب من الماوس بحيث البطن كلها مفتوحة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الامعاء ومنصات الدهون الزائدة غالبا ما يحجب الرحم ويجب أن يتم نقل هذه جانبا بحيث يمكن ملاحظتها الجزء العلوي من الرحم والمبايض على كل جانب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة الجزء العلوي من الرحم دون المبيض واستخدام المقص الخاص لفصل الرحم من الدهون ، وقطع من طرف واحد من المبيض إلى الرحم أخرى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج الرحم بالملقط الخاص ووضع في طبق بتري مع المالحة </li></ol> 3. إزالة الأجنة من الرحم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الرحم مع المياه المالحة لإزالة أي فائض في الدم وتقليم أي الدهون الزائدة من الخارج </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى طبق نظيف مع درجة حرارة الغرفة. المالحة لتحسين التصور Tyrodes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام stereomicroscope منفصلة لكل جنين باستخدام مقص صغير أو الغرامة إذا كان من الضروري (# 5) ملقط بعناية قشر الرحم إربا. </li> &lt;لى&gt; إدراج ملقط غرامة في الفضاء بين جدار الرحم والساقط وقشر الظهر جدار الرحم ، والحرص على عدم اختراق الجنين </li></ol> 4. إزالة الساقط من أجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه الساقط بحيث قتامة جزء (المشيمة) تواجه بعيدا عنك </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق بالملقط الخاص على طول الخط الفاصل بين الجزء المظلم من الساقط من أخف وزنا جزء ، والحرص على عدم قطع عميق جدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكمال فصل المشيمة من الجزء العلوي من كيس المح ، والحرص على عدم تمزيق مخروط المشيمة الظاهر (EPC). عند هذه النقطة يجب أن تكون قادرا على تصور الغشاء Reicherts على كيس المح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل لإزالة الساقط بأكمله (أخف وزنا جزء) والحرص على عدم اختراق كيس الصفار في </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة بلطف وإزالة Reicherts بواسطة تقشير بعيدا عن EPC. في حالة تلف EPC أو فصلها عن كيس المح ، وسوف تفشل لتحويل الأجنة عادة من E9.5 - E8.5 </li><li&gt; ومع Reicherts إزالة الجنين يجب أن تكون مرئية بسهولة من خلال كيس المح ويمكن قام بها somities العد. </li></ol> 5. إعداد نظام الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهاية ماصة نقل من البلاستيك مع مقص لزيادة القطر لفتح بحيث يمكن pipetted الجنين دون الاضرار كيس المح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعبئة الزجاجات الأسطوانة نظيفة مع 1 مل من وسائل الإعلام في جنين. ويمكن تبعا لنوع من الزجاجات الدوارة المستخدمة بحد أقصى 3-6 أجنة يتم تحميلها في كل زجاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة باستخدام ماصة الخاص لخفض الزجاجة الدوارة وسائل الإعلام مليئة ، كما تحمل اكثر من Tyrodes أقل قدر ممكن حتى لا تضعف وسائل الإعلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق المكونات المطاطية (كدر) إلى الجزء العلوي من زجاجة الأسطوانة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف إلى الزجاجات الأسطوانة الأسطوانة أسطوانة الثقافة بحيث يتم تشكيل ختم محكم بين المكونات والطبلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يتم إرفاق جميع الزجاجات ، وانه تم اغلاق أي فتحات فارغة في طبلة ثالسدادات المطاطية إيث ، وتفعيل الأسطوانة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح CO 2 و O 2 الدبابات وتكييفها مع ما يقرب من 2 رطل ، بحيث صمام مأخذ هو الافراج عن واحد فقاعة في الثانية الواحدة. لE8.5 - E10 الأجنة ، ينبغي أن تستخدم 20 ٪ O 2 و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان أن يتم تعيين الحاضنة إلى 37 درجة مئوية ، وتغطي وثيقة أو الحاضنة بحيث يتم الأجنة محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب فحص الأجنة دوريا لتقييم تنميتها من خلال إضافة somities ، تطور وتحول ، ومدى إغلاق الأنبوب العصبي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2-3 ساعات في الثقافة ، يمكن إضافة مثبطات الدوائية أو العلاجات الأخرى إلى وسائل الإعلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن تشمل الدراسة تصميم الضوابط ، مثل السيارة أو نظائرها نشط من كاشف الدراسة. </li></ol> 6. تقييم وضع الجنين بعد ثقافة بأكملها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف الغاز ، ووقف الدوارة ، وإزالة زجاجات من الحاضنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة مرة أخرى إلى Tyrodeق أو برنامج تلفزيوني في طبق بيتري للتقييم بموجب stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يظهر كيس المح تشبه البالون ، ونبضات القلب وينبغي أن تكون واضحة ومعدل ضربات القلب وينبغي&gt; 120 نبضة في الدقيقة ، وتداولها وينبغي أن يكون واضحا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصوير الأجنة قبل إزالة كيس المح إذا لزم الأمر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الكيس المحي من الجنين عن طريق خفض حفرة بالقرب من EPC والتقليب كيس المح والسلى على رأسه والردف من الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن قطع الحبل السري لفصل صفار كيس من الجنين ، ويمكن استخدام كيس المح عن التنميط الجيني للجنين إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الجنين لعدد الجسيدة وعيوب الأنبوب العصبي ، مثل فتح الجمجمة طيات ، وإغلاق كاملة للوجه و / أو العصبي فتح الذيلية. ويمكن أجنة نظموا وفقا لتصنيف تايلر من التغييرات تخلقية متعددة ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ EMAP / home.html</a> ) مرة أخرى ، وهو رقم قياسي من الصور الفوتوغرافيةتطور الجنين هو مفيد. </li></ol> 7. تلاحظ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتشريح عالية الجودة أمر ضروري ، لأن أي نك أو الدموع في الكيس المحي سيمنع تحول ناجحة وتمنع التطور الطبيعي. يمكن أيضا أن يكون معطوبا EPC خلال ازالة غشاء رايخرت (RM) ، وإذا تم فصل ولو جزئيا EPC من الكيس المحي والأجنة لن تتطور بشكل طبيعي. ومع ذلك ، يمكن إزالة كاملة للقضية الأجنة RM الى توحيد صفوفهم و / أو الخلايا قد اكتسى RM في الثقافة وانقباض الكيس المحي التوسع ، وكلاهما من شأنه أن يمنع النمو الطبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط نظيفة وحادة هي سر الحصول على تشريح جيد ، لأن ملقط مملة أو عازمة جعل الداخلي أكثر صعوبة بكثير. ودائع البروتين في الصكوك تؤدي إلى تلف الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة والزجاجات معقمة ضرورية أيضا لمنع الأجنة من الالتصاق على الجدار الجانبية وتضررت الراهن. قبل بدء التجربة ، يجب أن تكون زجاجات SCRubbed بالصابون والماء ، وتشطف في DH 2 O ، والمايكرويف مع كمية صغيرة من الماء في كل زجاجة حتى يغلي الماء. ثم يتم شطف الزجاجات EtOH مع 70 ٪ والسماح للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في أسرع وقت ممكن ، لأن عاجلا يمكن نقل الجنين إلى وسائل الإعلام والثقافة ، وتحسنت مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية وأفضل البقاء على قيد الحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح كامل القمامة بالكامل قبل نقل الأجنة إلى أي زجاجات الأسطوانة بحيث أن كل جنين هو في درجة حرارة الغرفة لنفس المقدار من الوقت لتجنب خلق أي تباينات في نمو الجنين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على بيئة معقمة لمنع التلوث الجرثومي من الثقافات. وقد أجريت تجارب ثقافتنا دون المضادات الحيوية ، ولكن العديد من المعامل إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام لمنع نمو البكتيريا. وينبغي أن تظهر واضحة على المديين المتوسط ​​كما في نهاية التجربة كما كان في بداية التجربة. إذا أصبحت وسائل الإعلام غائما أو هناك يعجل مرئية ، من المحتمل أن يكون هناك يخدعtamination التي أصابت ثقافتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تبادل الغاز غير فعالة أيضا تأخير تنمية الأجنة ، لذلك يجب التأكد من أن منظم موثوق بها من شأنها أن تضمن تسليم المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة تطوير ما يقرب من 50 ٪ أبطأ في الثقافة فيفو السابقين ، ولذلك فمن الضروري أن نعتمد somites لضمان أنك وصلت إلى مرحلة مناسبة للتنمية لاستكمال التجربة. </li></ol> 8. ممثل النتائج : ظهور الأجنة قبل وثقافة ما بعد الدوارة هو موضح في الشكل 1. في وقت التشريح ، وينبغي أن تكون الأجنة في تكوين جهدا (الشكل 1A ، D) حيث الذيل وراء طيات الرأس. بعد 36 ساعة في الثقافة ، كان ينبغي أن أكملت تحول الأجنة بحيث تكون في موقف ، C - منحني الجنين ، حيث الذيل في مقدمة الرأس (الشكل 1B ، C ، E ، F). الدوائية التلاعب مع RhoA كيناز المانع (Y - 27632) ، مثبط معروفة من خلال تمديد المتقاربةneurulation (Ybot - غونزاليس ، 2007) ، والنتائج في تقصير من الأجنة على طول محور منقاري - الذيلية لهم (الشكل 1E ، F) ويمنع إغلاق الجمجمة أضعاف العصبية. البيانات المتوفرة لدينا تبين أن جرعات متزايدة من Y - 27632 يضعف تدريجيا اغلاق أضعاف الجمجمة (الشكل 2A) ، ويقصر محور الجسم (الشكل 2B) ، بما يتسق مع دور المصب RhoA يشير في الجمجمة والإرشاد neurulation المتقاربة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> الشكل 1. المظهر الأجنة الثقافات والتلاعب مع مثبط الدوائية Y - 27632. (أ ، د ،) في تشريح الأجنة E8.5 الجنين قبل ثقافة بأكملها (B ، E) أجنة في E10 مع الكيس لا تزال سليمة صفار ، بعد 36hrs الثقافة الدوارة. (C ، F) تمت إزالة كيس المح لتوضيح تحول ناجح وإغلاق الأنبوب العصبي. فشل الأجنة التي كانت تعامل مع مثبط كيناز رو Y - 27632 (E ، F) للخضوع لتمديد المتقاربة السليم وتوضيحمحور الجسم تقصير. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> الشكل 2. تأثير مثبط كيناز RhoA على الجمجمة إغلاق الأنبوب العصبي واستطالة المحور. (أ) تتم مقارنة النسبة المئوية للأجنة التي كانت قادرة على إغلاق بنجاح طيات هذه الجمجمة (NTC ٪ = النسبة المئوية إغلاق الأنبوب العصبي) إلى جرعة من Y - 27632 إضافة إلى وسائل الإعلام الثقافة. (ب) وخفضت بشكل كبير المسافة بين الحويصلة الأذنية وforelimb بجرعات متزايدة من Y - 27632 (ع &lt;0.05).

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

القدرة على فصل الأمهات ، وعوامل داخل الرحم من تلك التي هي متأصلة في جنين خلال عملية وضعه هو أداة هامة لدراسة جميع مراحل تكوين الجنين. هنا قمنا بتحليل آثار مثبط جزيء صغير من كيناز RhoA على الجمجمة neurulation الرحم السابقين ، من شأنه أن يزيل متغير من الأمهات استقلاب الدواء. هذا التلاعب الدوائي له تأثير عميق على neurulation الجمجمة والإرشاد المتقاربة. ويمكن مقارنة الحساسية لهذا المركب بين مختلف المسوخ الماوس الوراثية. ويمكن أيضا أسلوب المعروضة هنا يمكن تطبيقها على دراسات المسارات الجزيئية الأخرى في مجال التنمية ، والسماح للتلاعب مباشرة من وظيفة الخلايا في الأجنة باستخدام مجموعة متنوعة من الكواشف.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> Stereomicroscope للتشريح </td><td> لايكا </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> الدقة حاضنة </td><td> BTC الهندسة (المملكة المتحدة) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> وحدة الدورية زجاجة الثقافة </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> قناني زجاجية للتدوير وحدة </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> سيليكون المطاط بونغ </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> سيليكون المطاط كورك </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> مدخل الغاز عوامات </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> مدخل الغاز فخ عوامات </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> المخرج الغاز عوامات </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> اسطوانة الغاز </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2 </td></tr><tr><td> منظم الغاز </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ذكر الجرذ المصل </td><td> هارلان مختبرات </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM ث / س أحمر الفينول </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> الحقنة 10 مل </td><td> دينار بحريني </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> حقنة تصفية </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> مقصات كبيرة تشريح (نصيحة بلنت) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> بون اضافية الجميلة مقص </td><td> أدوات العلمية الدقيقة (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><tد&gt; Dumot # 5 ملقط </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode والمالحة </td><td></td><td></td><td> كما هو موضح في كوكروفت 1990 </td></tr><tr><td> 10 سم صحن بيتري يعاد </td><td> دينار بحريني </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

نماذج الماوس الوراثية هي أداة هامة في دراسة الثدييات إغلاق الأنبوب العصبي (غراي وروس ، 2009 ؛ روس ، 2010). ومع ذلك ، يقتصر على دراسة الأجنة في الرحم بواسطة الفأرة عدم قدرتنا على التعامل مباشرة عقاقيري الأجنة في معزل عن تأثيرات الأيض الأمهات على كاشف للاهتمام. وسواء باستخدام جزيء صغير من البروتين المؤتلف ، أو سيرنا ، وتسليم هذه المواد إلى الأم ، من خلال النظام الغذائي أو عن طريق الحقن تخضع هذه المركبات غير مستقرة لمجموعة متنوعة من دفاعات الجسم التي يمكن منعهم من الوصول إلى الجنين. ويمكن استخدام التحقيقات في الثقافات كلها من الأجنة لفصل الأمهات من آثار على التنمية الذاتية الجنين. هنا ، نقدم طريقة لزرع أجنة الفئران باستخدام وسائل التخصيب في جهاز حاضنة الدوارة التي تسمح لإغلاق الأنبوب العصبي الطبيعي بعد تشريح (كروكيت ، 1990). مرة واحدة في الثقافة ، ويمكن للأجنةيمكن معالجته باستخدام التقنيات التقليدية في المختبر أنه لن يكون الأمر خلاف ذلك ممكن اذا كانت لا تزال على الأجنة في الرحم. ويمكن جمع الأشقاء الجنين في نقاط زمنية مختلفة لدراسة جوانب مختلفة من neurulation ، والتي تحدث من 7.5 - E7 (العصبية تشكيل لوحة ، وقبيل بدء neurulation) لE9.5 - 10 (في ختام الجمجمة العصبي أضعاف ، والذيلية الإغلاق ، كوفمان ، 1992). في هذا البروتوكول ، ونحن لدينا وسيلة لشرح تشريح أجنة في timepoints التي هي الأمثل لدراسة neurulation الجمجمة. وسيتم تشريح أجنة في E8.5 (حوالي 10-12 somities) ، وبعد الشروع في إغلاق الأنبوب العصبي ولكن قبل أن يتحول الجنين وإغلاق الجمجمة أضعاف العصبية ، والمحافظة في الثقافة حتى E10 (somities 26-28) ، عندما الجمجمة وينبغي أن تكون كاملة neurulation.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture at JoVE.com

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

يوصف أسلوب السماح للتلاعب الدوائية المباشرة للأجنة الفئران خلال neurulation ان يتجاوز التمثيل الغذائي للأمهات. ويمكن تكييف هذه التقنية لدراسة جوانب مختلفة من neurulation من خلال تغيير نقطة زمنية وكيل الدوائية.

اختتام العصبية أنبوب في الثقافة ماوس الأجنة الجامعة

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.5K Views.  Weill Cornell Medical College. يوصف أسلوب السماح للتلاعب الدوائية المباشرة للأجنة الفئران خلال neurulation ان يتجاوز التمثيل الغذائي للأمهات. ويمكن تكييف هذه التقنية لدراسة جوانب مختلفة من neurulation من خلال تغيير نقطة زمنية وكيل الدوائية.

Video: Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

الجمع بين السلوكية الغدد الصماء والاقتصاد التجريبي : التيستوستيرون والاجتماعي اتخاذ القرار

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

إنتاج استخراج الجنين الفرخ لزراعة الخلايا الجذعية العصبية الفئران كريست

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

إضفاء الطابع المحلي على البروتين في 3D الجذعية العصبية خلية الثقافة : منهجية التصور الهجين

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

الدجاج الأجنة شريحة الحبل الشوكي الثقافة البروتوكول

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...