نود أن نشكر شارون المفخرة للمناقشات كثيرة وبصيرة Novitch B. هدية لنوع من الأجسام المضادة لFoxp1. هذا العمل الممول من منحة دراسية لمن ويلكوم ترست لKCT ومنحة المشروع من ويلكوم ترست لSRP (المنح إشارة 094399/B/10/Z رقم).

1. جعل الحلول المطلوبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 العازلة الفوسفات M: زن من 109،4 ز نا 2 HPO 4 و 32 ز ناه 2 PO 4 H 2 0، ومزيج تذوب في الماء إلى الحجم الكلي لل1 لتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت المالحة الفوسفات (PBS): إعداد العازلة الفوسفات 0،1 M، 0.15 M كلوريد الصوديوم. ينبغي 100 مل من برنامج تلفزيوني يكفي لتجهيز شرائح من 10 الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاغاروز: الحرارة PBS حل لحوالي 70 ° C درجة الحرارة وإضافة الصلبة انصهار منخفضة في حين الاغاروز ببطء مع التحريك باستمرار. جعل حل لتركيز النهائي من 4٪ (W / V) الاغاروز. جعل مخزون من 50 مل من هذا الحل. ترك هذا الحل في الاحتفاظ بالحمام المائي في 48 ° C حتى المطلوبة. ويمكن تخزين أي حل غير المستخدمة الاغاروز بعد التجربة في C ° 4 لعدة أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة كتلة الحل: إضافة العجل الجنين المصل وتريتون X-100 إلى concentr النهائيأوجه من 1٪ (V / V) العجل الجنين مصل، 0.1٪ (V / V) تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. و10 مل من محلول كتلة كافية للالمناعية من 5 شرائح من أقسام ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مثبت: تحضير هيدروكسيد الصوديوم 0.75 مم، بارافورمالدهيد 4٪ (W / V) (تنبيه). لإعداد كمية الحرارة اللازمة مثبت من المياه إلى 70 درجة مئوية، إضافة إلى تركيز هيدروكسيد الصوديوم المركزة النهائية المطلوبة، إضافة بارافورمالدهيد الصلبة وتخلط حتى يذوب. باردة على الجليد لC. ° 4 و10 مل من هذا الحل يكفي لمدة 20 بئرا من شرائح الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل السكروز: إعداد 10 مل من محلول السكروز 30٪ (W / V) التي تحتوي على الفوسفات عازلة 0،1 M. و10 مل من هذا الحل يكفي لمدة 10 بئرا من شرائح الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70٪ (V / V) الإيثانول. تمييع 70 مل من الإيثانول المطلق مع 30 مل من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة المتوسط: إعداد محلول 1٪ الدجاج استخراج الجنين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 0.35٪ الجلوتامين L-، 0.1٪ 2-mercaptoethأنول، 4٪ من مصل الدجاج، 2٪ B27 و 100 الملحق النمو ciliaryneurotrophic نانوغرام / مل عامل (CNTF) جميع مخففة في المتوسط ​​neurobasal؛ أعد على الجليد وتستخدم في نفس اليوم. مطلوب 10 مل من مستنبت لل20 بئرا من شرائح الجنين. </li></ol> 2. فرخ الأجنة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الدجاج الملقحة البيض مع الجانب الأطول أفقيا في مشروع حاضنة القسري في 38 ° C حتى تطوير لمرحلة 15 24. هذا وعادة ما يتطلب حوالي 4 أيام من الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم الثاني من الحضانة، تعقيم قشرة البيضة بواسطة المسح مع المناديل الورقية غارقة في الايثانول 70٪. بيرس بعناية نهاية المسطح من قشرة البيضة باستخدام إبرة قياس 21 تعلق على حقنة 5 مل وإزالة 5 مل من الألبومين. هذا يقلل من الجنين بعيدا عن قذيفة حتى لا تضرر الجنين عند فتح قذيفة. العودة إلى البيض الحاضنة واحتضان لهم لمزيد أيام 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أضعفت دومون # 5 ملقط جبيرس arefully منتصف أعلى شل وإزالة حوالي 9 سم 2 من قذيفة. قطع حول الجنين ورفع بعناية الجنين ومكان في HBSS خلال تشريح. وينبغي الأجنة وفقا لنظم وهمبرغر هاميلتون (1992) 15. ينبغي لجميع الأجنة المستخدمة تكون على مقربة من المرحلة 24. يجب التخلص من أي الأجنة التي تظهر أي علامات على الشذوذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغشاء السلى، الغشاء السقائي المشيماء، رأس، والسقاء باستخدام اثنين من دومون # 5 ملقط. سلب الجنين لإزالة كافة الأعضاء الداخلية. للقيام بذلك، وقطع خط الوسط بطني فتح للجنين مع مقص تشريح الصغرى، وعقد الجنين في جميع أنحاء المنطقة منقاري الجذع مع زوج واحد من الملقط، والاستيلاء على جزء منقاري للامعاء والقلب وسحب نحو caudally. من المهم أن يتم ذلك بوضوح. يجب أن تكون قادرا على رؤية الجنين بشكل واضح somites. قطع الجنين إلى النصف، بشكل مستعرض بين buds.Now أطرافهم العليا والسفلى تقليم الجسم الصدريباستخدام مقص تسليخ مجهري الجدار. </li></ol> 3. الجنين شريحة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل الاغاروز من حمام الماء. قطع 5 سم من الجزء السفلي من البلاستيك القابل للتصرف 3 مل ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف النصف القطني للجنين باستخدام اثنين من تشريح ملقط الجنين لمهد للخروج من حل تشريح ومكان في صحن بيتري الجافة. باستخدام ماصة باستور، وإزالة حوالي 2 مل من الاغاروز، حوالي 0.5 مل ماصة على رأس الجنين ومن ثم تمتص شريحة الجنين في ماصة. نقل الجنين والاغاروز إلى قشر بعيدا قالب من البلاستيك الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في الاغاروز. خفض بلطف الجنين إلى أسفل الاغاروز في قالب من البلاستيك مع قسم الصدر إلى أسفل. وينبغي وضع الجنين مباشرة إلى استخدام إبرة قياس 21. وسوف تحتوي أيضا على شرائح جزء من أطرافهم النامية وأنه من المهم أن توجه الجنين في أجارسوف OSE يسمح بذلك. وضع القارب على الجليد لضبط الاغاروز. الحرص على أن الجنين لا يغير التوجه خلال هذه الفترة (حوالي 2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب تعيين VT1000S ايكا vibratome (سرعة 3، 4 التردد، 400 ميكرون شرائح سميكة) مع غرفة تشريح مليئة HBSS وتحيط بها المياه الباردة الجليد. عالق ثم كتلة الاغاروز إلى منصة vibratome مع الغراء عظمى. يتم قطع كتلة الاغاروز مع شفرة حلاقة لمغادرة قطعة الجنين مع مم 1-3 من الاغاروز المحيطة به. يتم تحديد الشرائح التي تشمل أقسام برعم الطرف مع rigde الأدمة قمية واضحة وثم توضع الشرائح في هذه HBSS. عموما، هناك احدة فقط لمدة شرائح مناسبة في الجنين. إزالة بلطف الاغاروز حول شرائح الأنسجة باستخدام اثنين من الإبر. من الضروري أن يتم ذلك بشكل شامل ودقيق. </li></ol> 4. زراعة الأجنة شرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 مل من محلول الثقافة (المذكورة أعلاه) إلى اشتراطاتإد عدد من الآبار من 24 بئر منخفضة جدا مرفق المعالجة الأنسجة لوحة الثقافة. نقل شرائح بعناية من الحل HBSS في البئر. بشكل عام، ونحن نحاول أن يكون 2-3 شرائح في كل بئر. وضع لوحة 24 أيضا في الأنسجة حاضنة الثقافة في C ° 37 مع 5٪ CO 2 ل24 ساعة. </li></ol> 5. باجتزاء لشرائح المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة والثقافة، وإضافة 500 ميكرولتر من الإصلاح غير مصقول إلى كل بئر من شرائح الجنين وترك على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم تتم إزالة الحل الكلي بعناية ويتم القيام بثلاث يغسل PBS بها، مع 5 مين فترات. يتم ترك ثم الشرائح في حل السكروز في C ° 4، حتى الحوض شرائح، حوالي 6 ساعة ولكن يمكن أن تترك لفترة أطول (بين عشية وضحاها على سبيل المثال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شرائح وربت قبالة حل السكروز اضافية وتتوازن في جميع أنحاء أكتوبر 1 مل لحوالي 5 دقائق عند درجة حرارة 20 º تحميل كل شقة شريحة في قالب OCT-ملء قشر بعيدا من البلاستيك.بعد تصاعد مستمر، ووضع قوالب الثلج الجاف عموديا على لترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كتل في أكتوبر ناظم البرد ويوازن الكتل في C ° -24 لحوالي 20 دقيقة. قطع كل شريحة مع 15 مم الأقسام التي شنت على Superfrost زائد الشرائح. ويمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها. </li></ol> 6. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني على الشرائح الأفقية التي عقدت في غرفة مرطب مع الشرائح التي أثيرت من الجزء السفلي من الغرفة (التي نستخدمها 1 أو 2 مل ماصات بلاستيكية ثابتة مع شريط الأوتوكلاف). احتضان المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية لإزالة الزائدة أكتوبر إزالة الحل PBS من الشريحة وإضافة 500 مل من محلول كتلة على أقسام، احتضان لمدة 30 دقيقة عند 20 ° C. وأضاف إزالة كتلة الحل وإضافة على الفور 500 مل من الأجسام المضادة الأولية مخففة على الشرائح، احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 18-22 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الأولية حل وكان على الفورح الشرائح مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات في 20 ° C لإزالة الزائدة حل الأجسام المضادة الأولية. إضافة 500 مل من الأجسام المضادة الثانوية المخفف على أقسام. ثم تترك الشرائح في C ° 20 لمدة 30 دقيقة. ثم تتم إزالة الأجسام المضادة الثانوية الحل والشريحة تغسل 3 مرات في 5 دقائق PBS في C. ° 20 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذه يغسل، وإزالة النهائية PBS يغسل، الداب حافة الشريحة لإزالة الزائدة PBS، إضافة قطرتين من vectashield على الشرائح ووضع ساترة بلطف على الزجاج أقسام، وتجنب تكوين فقاعة. إزالة الزائد عن طريق النشاف Vectashield من على حافة الشرائح قبل التصوير. </li></ol> 7. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة المقاطع immunostained. نستخدم المجهر مضان نيكون الكسوف E80i مجهزة بكاميرا رقمية ORCA Hamammatsu ER و 10 X، 20X و 40 X العدسات الهدف. </li></ol>

<ol>
	<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+specification+in+the+spinal+cord:+Inductive+signals+and+transcriptional+codes.">Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes.</a> Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).</li><li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+Of+Motoneurons+Supplying+Chick+Hind+Limb+Muscles.">Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles.</a> Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).</li><li>Romanes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+motor+pools+of+the+spinal+cord.">The motor pools of the spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).</li><li>Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+repertoires+for+motor+neuron+diversity+and+connectivity+gated+by+a+single+accessory+factor,+FoxP1.">Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1.</a> Cell. 134 (2), 304-316 (2008).</li><li>Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+actions+of+the+forkhead+protein+Foxp1+and+Hox+proteins+in+the+columnar+organization+of+spinal+motor+neurons.">Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons.</a> Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor-neurons+defined+by+expression+of+limhomeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+roles+for+LIM+homeobox+genes+in+directing+the+dorsoventral+trajectory+of+motor+axons+in+the+vertebrate+limb.">Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb.</a> Cell. 102 (2), 161-173 (2000).</li><li>Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins.">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109 (2), 205-216 (2002).</li><li>Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Neuron+Position+and+Topographic+Order+Imposed+by+&#946;-+and+&#947;-Catenin+Activities.">Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by &#946;- and &#947;-Catenin Activities.</a> Cell. 147 (3), 641-652 (2011).</li><li>Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catenin-Dependent+Cadherin+Function+Drives+Divisional+Segregation+of+Spinal+Motor+Neurons.">Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).</li><li>Haase, G., Dessaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+acts+through+PEA3+to+regulate+cell+body+positioning+and+muscle+innervation+of+specific+motor+neuron+pools.">GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).</li><li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+slices.">Embryo slices.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).</li><li>Hotary, K. B., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+that+guide+sensory+and+motor+neurites+identified+in+an+embryo+slice+preparation.">Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation.</a> Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).</li><li>Krull, C. E., Tosney, K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+slices+and+strips:+Guidance+and+adhesion+assays+in+the+avian+embryo.">Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo.</a> Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. 87, 97-113 (2008).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+(Reprinted+From+Journal+Of+Morphology,+Vol.+88,+1951).">A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951).</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+progress+in+corticoneurogenesis:+From+silver+impregnation+to+genetic+engineering.">A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering.</a> Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).</li><li>Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+mediate+motor+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).</li><li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse.">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).</li><li>Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Live+Imaging+of+Cell+Behavior+in+the+Developing+Neuroepithelium.">High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium.</a> J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).</li><li>Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-7+and+cadherin-6B+differentially+regulate+the+growth,+branching+and+guidance+of+cranial+motor+axons.">Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons.</a> Development. 137 (5), 805-814 (2010).</li></ol>

أي من الكتاب وتتنافس المصالح أو تضارب المصالح.

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح حضنت الأجنة شريحة الدجاج لأكثر من يوم واحد مع إبقاء الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة والاستمرار في ترحيل خلال الفترة الثقافة. في توضيح الظروف للحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة، لقد حددنا عدة الملامح الرئيسية المطلوبة. يبدو أن ما يصل إلى 4٪ فرخ المصل أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلايا العصبية الحركية والاستعاضة عنها مصل من الأنواع المختلفة والتسامح لا. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن وجود تركيزات أعلى من المصل لها أثر ضار على شرائح كما روجت فرط نمو الأنسجة مما يؤدي إلى تشوهات جسيمة في شكل شريحة. والأهم من ذلك وجود عامل التغذية العصبية cilliary ثبت أيضا حرجة. يبقى احتمالا واضحا أن شرائح قد تكون قادرة على أن تكون مثقف لفترات أطول بكثير من مجرد 24 ساعة، وربما السماح حتى التصور للمدخلات الحسية وارد إلى الحبل الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، طريق مسدودالشروط والأحكام قد تلح هنا يكون مفيدا أيضا لشريحة الثقافات من الدماغ النامية والمخ الأوسط / المخيخ. ولعل أكبر فائدة محتملة في استخدام هذه الشروط ثقافة شريحة هي أنها تسهل إمكانية للتلاعب الدوائية للوظيفة البروتين في حين التقليل من احتمال حدوث آثار سلبية على بقية الجنين، مثل القلب. ويمكن استخدام عدد كبير من مثبطات ومنبهات مختلفة من مسارات إشارات لتقييم هجرة الخلايا العصبية في العمود الفقري مختلفة الأنواع الفرعية، وربما تأثيرها في تشكيل الدوائر المحلية الشوكي خلال التنمية. بالإضافة إلى ذلك، بعض الاضطرابات الوراثية التعبير البروتين، مثل تلك التي تستخدم siRNAs وأليغنوكليوتيد] morpholino، يعانون من حقيقة أنه لا يمكن أن تكون أدخلت في وقت مبكر من التنمية (بسبب القيود في الإجراءات الصعق الكهربائي في البيضة) وآثار الماضي فقط ل فترة قصيرة من تيمه (عادة يوم واحد). بدء ثقافتنا شريحة في مراحل لاحقة ويتيح إمكانية استخدام هذه التكنولوجيا في وقت لاحق في التنمية في مرحلة تشريح لعرض آثارها خلال الفترة من ثقافة شريحة. يمكن للبروتوكول ثقافة شريحة تسمح أيضا تصور كل من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الظهري وكذلك الهجرة عصبون في الوقت الحقيقي عن طريق الفحص المجهري الفيديو في الوقت الفاصل بين. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام المجهر النقيض من المرحلة تحت الضوء الأبيض أو من خلال استخدام التصوير مضان. إذا كان الأسلوب الأخير كان من المقرر أن تستخدم بعد ذلك هناك حاجة إلى إدخال علامات الفلورسنت. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق إدخال الأصباغ الفلورية مثل مبادرة ديزرتك الصناعية أو إما عن طريق وضع العلامات ديو الوراء من الطرف أو وضع العلامات تقدمي من البطين أو الصعق الكهربائي في البيضة من يبني البروتينات الفلورية لدفع في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية.

خلال تطور الجنين الطبيعي، يتم إنشاء العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي يجب أن تهاجر من نقطة انطلاقها إلى حيث ستعمل في نهاية المطاف في الكائن الحي ناضجة. داخل الحبل الشوكي النامي، وتقع الخلايا الاصلية في منطقة البطين في خط الوسط وتوليد أنواع فرعية عديدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية تالية للتفتل التي يجب أن تهاجر إلى الاندماج في دوائر الخلايا العصبية الوظيفية اللازمة لمعالجة الحسية الحركية والمخرجات 1. وقد الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري التي تتحكم في انقباض عضلات الأطراف درس على نطاق واسع وكما هو معروف الكثير من الجزيئات والآليات التي تدفع تشكيل الفئات الفرعية المختلفة. ومع ذلك، فمن المعروف أقل بكثير من الآليات التي تهاجر الخلايا العصبية الحركية، وتلقي المدخلات فصل متشابك. ويكتسب هوية النوع الفرعي للسيارات خلال الخلايا العصبية التنمية بطريقة هرمية. ويمكن للسيارات فرعية تصنف الخلايا العصبية على نطاق واسع طn لأعمدة متميزة، والانقسامات التي تعرف تجمعات من محور عصبي التوقعات الخاصة بهم. أعمدة المحرك محاور عصبية المشروع إما إلى العضلات، أو أطرافهم المحوري الحشوية. الانقسامات السيارات تقسيم الطرف إسقاط الخلايا العصبية الحركية في العمود الجانبي للسيارات (LMC) في تلك العضلات البطنية لإسقاط أو الظهرية 2. الانقسامات داخل، ووصف مجموعات من الخلايا العصبية الحركية موتور برك مشروع لعضلات الفرد في الطرف 2 و 3. وتعرف الخلايا العصبية الحركية من قبل الأطراف الاصطناعية إسقاط التعبير عنها من عامل النسخ Foxp1 4، 5، في حين يتميز هوية الشعب من التعبير عن عوامل النسخ homeodomain جزيرة-1 (إسقاط بطنيا) أو LHX 1-(إسقاط ظهريا) 6. في الواقع، هناك حاجة LHX-1 التعبير عن التوقعات في ظهري المناسب من الخلايا العصبية الحركية 7. كل من هذه الأنواع الفرعية يشغلون مناصب متميزة داخل الحبل الشوكي؛ بطني الخلايا العصبية الحركية إسقاط تأتي للإقامة الإنسي إلى projecti ظهريانانوغرام الخلايا العصبية الحركية. يتم فصل هذه النتائج في LMC في LMCmedial ما يسمى (LMCm) والانقسامات LMClateral (LMCl). ويكتسب الشعب وتنظيم تجمع السيارات على مرحلتين 8. في المرحلة الأولى، يتم تحقيق العزل الشعب عن طريق الهجرة من الخلايا العصبية الحركية في صفة الإنسي إلى الوحشي الأزياء. يتم إنشاء خلايا LMCl بعد ذلك الخلايا LMCm وLMCl يهاجر من خلال LMCm لتحقيق تسوية موقفها النهائي. المرحلة الثانية تستغرق الخلايا العصبية الحركية داخل الانقسام ومجموعات منهم إلى برك الخلايا العصبية الحركية، ويفترض من خلال الفرز الظهري البطني من الخلايا العصبية الحركية. وقد ثبت أفراد الأسرة catenin التي تعتمد على كادهيرين الكلاسيكية تكتسي أهمية بالغة لكلتا المرحلتين من 8-10 موتور تنظيم الخلايا العصبية. ولكن، كيف يتحكم في حركة كادهيرين ظيفة الخلية ما زال يجهل الكثير. الحصول على هويات عمودي، وتجمع الشعب يتطلب إشارات خارجي هذا النمط intrinsiج التعبير عن عوامل النسخ 11. بالإضافة إلى ذلك، حوالي 50٪ من جميع الخلايا العصبية الحركية عن طريق موت الخلايا المبرمج خلال يموت التطور الطبيعي في عملية تتطلب إشارات خارجي من أطرافه، إلى حد كبير من خلال تقديم الدعم للبقاء عصبية الخلايا العصبية الحركية. وهكذا، الخلايا العصبية الحركية التنمية يتطلب بيئة مناسبة ليتم الحفاظ على مدى timecourse طويلة نسبيا. لهذا السبب، فإن العملية لتوليد الشوكي الثقافات شريحة الحبل للحفاظ على بقاء الخلايا العصبية الحركية تتطلب الكشف عن ظروف التربية المناسبة. وقد استخدمت الثقافات السابقة شريحة الجنين لمتابعة سلوك وأضاف السكان خارجيا تنقية الخلايا العصبية 12-14. ومع ذلك، لدينا ظروف ثقافة المعرفة التي تسهل البقاء على قيد الحياة في الموقع الخلايا العصبية الحركية والهجرة داخل شريحة نفسها لم تنشر. نحن تعديل شرط القياسية التي تسهل الثقافة بقاء تنقيته، فصل الخلايا العصبية الحركية الجمجمة لتسهيل مأذني الخلايا العصبية التنمية داخل ثقافة النظام الجنين شريحة. ونحن أيضا رصد المواقع من الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة وإثبات أن يكتسب المواقف العادية إلى حد كبير من الشعب الخلايا العصبية الحركية خلال الفترة الثقافة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بيض </td><td> هنري ستيوارت مزارع، UK </td><td></td><td> البيض المخصب براون الدجاجة الذهبية في Bovan (هنري ستيوارت مزارع، UK) وتخزينها في 14 ° C حتى الحضانة </td></tr><tr><td> 21 إبرة قياس </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> حقنة 5 مل </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط دومون # 5 </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> مقص تشريح الصغيرة </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3.5 في مستقيم) </td></tr><tr><td> تضمين قوالب الجنين: التقشير بعيدا قوالب </td><td> أجار العلمية </td><td> G3764 </td><td> شكل هرمي 22 مم إلى 12 مم </td></tr><tr><td> سوبر الغراء </td><td></td><td></td><td> السلطة فليكس، LOCTITE </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> دي الصوديوم والهيدروجين الفوسفات، أحادية هيدرات </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> دي أحادية الصوديوم والهيدروجين الفوسفات </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> انخفاض درجة حرارة انصهار الاغاروز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> ماصات باستور البلاستيكية </td><td> ElKay الدقة مختبر المواد الاستهلاكية </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette حجم 3 مل </td></tr><tr><td> هانكس المتوازن محلول ملحي (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> الصوديوم كربونات الهيدروجين </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> الدجاج استخراج الأجنة </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين الحل </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> الجلوتامين L-الحل </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> الحصان مصل </td><td> المجموعة الجنوبية مختبرات </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 الملحق </td><td> إينفيتروجن </td><td> 17504-044 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Neurobasal المتوسطة </td><td> Gibco </td><td> القط ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic عامل (CNTF) </td><td> ونظم R D </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> فرخ المصل </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> الأجسام المضادة الأولية </td><td></td><td></td><td> تم شراؤها من البنك التنموي ورم هجين الدراسات، باستثناء المضادة للfoxP1 الأجسام المضادة، والتي كانت هدية من نوع Novitch بينيت من جامعة كاليفورنيا. كانت الأجسام المضادة الأولية التخفيفات أرنب المضادة للFoxP1 (1/32000)، المضادة للماوس Lhx1 / 2 (4F2) (1/50)، خنزير غينيا مكافحة FoxP1 (1/1000). تم تخزين جميع الأجسام المضادة في C. ° 4 </td></tr><tr><td> الأجسام المضادة الثانوية </td><td></td><td></td><td> حمار المضادة للخنزير غينيا (cy3) (1:1000) تم شراؤها من شركة Immunoreseach جاكسون حمار المختبرات المضادة للماوس (اليكسا فلور 488) (1:1000)، دونكإرنست و يونغ المضادة للأرنب (اليكسا فلور 594) (1:1000) تم شراؤها من إينفيتروجن تم تخزين جميع الأجسام المضادة في C. ° 4 </td></tr><tr><td> 24 لوحة جيدا </td><td> كورنينج COSTAR </td><td> 3473 </td><td> فائقة الانخفاض المرفقات 24 لوحة جيدا </td></tr><tr><td> أكتوبر </td><td> الأنسجة تيك، ساكورا </td><td> 4583 </td><td> درجة الحرارة المثلى للقطع </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H1000 </td><td> Vectashield المتوسطة الفلورسنت تصاعد </td></tr><tr><td> الشرائح </td><td> الحرارية العلمية </td><td></td><td> Superfrost زائد الشرائح المشحون إيجابيا، 25 × 75 × 1.0 ملم </td></tr><tr><td> تغطية زجاج </td><td> VWR الدولية </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 ملم </td></tr><tr><td> مشروع حاضنة القسري: </td><td> شركة كهرباء ليون </td><td></td><td> أبقى الرطبة من خلال ضمان مستويات المياه كافية دائما، حافظ في 38 ° C </td></tr><tr><td> ناظم البرد </td><td> برايت، هانتينغدون، UK </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> نسيج الثقافة الحاضنة </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C CO، 5٪ 2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> لايكا </td><td></td><td> لايكا VT1000-S </td></tr><tr><td> مجهر </td><td> نيكون </td><td></td><td> نيكون الكسوف مضان المجهر E80i </td></tr><tr><td> كاميرا رقمية </td><td> نيكون </td><td></td><td> نيكون DS5M وHamammatsu ER ORCA </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice culture protocol

يمكن الثقافات شريحة تسهيل التلاعب تطور الجنين على حد سواء من خلال التلاعب عقاقيري والجينات. في هذا النظام انخفاض، يمكن التغلب على الآثار الجانبية المحتملة القاتلة بسبب المخدرات التطبيقات النظامية. ومع ذلك، يجب التأكد من أن الظروف الثقافة عائدات التطور الطبيعي ضمن بيئة مصغرة من شريحة. فقد ركزنا على تطوير الحبل الشوكي، وبخاصة أن الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري. نحن تباينت الظروف بصورة منهجية ثقافة شرائح الدجاج الجنين من النقطة التي ولدت معظم الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري. نحن يعاير عدد ونوع الخلايا العصبية الحركية التي نجت خلال الفترة الثقافة والموقف من تلك الخلايا العصبية الحركية مقارنة بما كان عليه في الجسم الحي. وجدنا أن هناك حاجة إلى نوع المصل وعوامل عصبية خلال الفترة الثقافة وكانت قادرة على الحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة لمدة لا تقل عن 24 ساعة والسماح تلك الخلايا العصبية الحركية للهجرة إلى المواقف المناسبة فيالحبل الشوكي. نقدم هذه الظروف الثقافة ومنهجية إعداد الثقافات شريحة الجنين باستخدام أجنة الدجاج ينتزع منه جزءا لا يتجزأ من الاغاروز وشرائح باستخدام vibratome.

وكان استخدام شرائح مثقف لمتابعة تطور الخلايا العصبية عصبون والإسقاط مؤثر في تقدم فهمنا لجيل من منظمة داخل القشرة 16. في النخاع الشوكي، وقد تم اتباع العصبون الحركي التنمية باستخدام الأجنة الزرد ثقافات كله 17. ومع ذلك، الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري في منظمة الزرد بسيط نسبيا (نظرا لعدم وجود عضلات الأطراف الكبيرة في الأسماك). وحاليا الآليات الجزيئية التي تدفع التسلسل الهرمي للتنظيم الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري خلال تطوير الفقاريات العليا غير مفهومة. ويلزم بالتالي الظروف التي تسهل بقاء الثقافة الخلايا العصبية والخلايا الهجرة الجسم في الثقافات شريحة الجنين من الفقاريات العليا. حاليا، وقد استخدمت الثقافات الشوكي الحبل شريحة من الفقاريات العليا لفصل الخلايا العصبية البذور على أعلى من شرائح 12-14، تحقيق محاور عصبية fluorescently المسمى في محيط شريحة18، أو من سلوك الخلية السلف في وقت مبكر التنمية الحبل الشوكي 19. شريحة الظروف لثقافة النخاع الشوكي في وقت لاحق، لا سيما تلك التي تحافظ على الخلايا العصبية الحركية التنمية تفتقر حاليا. في محاولة لمتابعة تطوير الخلايا العصبية في العمود الفقري، وخصوصا ان الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري، ونحن التحقيق الظروف المختلفة التي قد الثقافة تعزيز بقاء الخلايا العصبية الحركية واكتساب أجل الأولية في المؤسسة الحركية من خلال الهجرة الجانبي للخلايا العصبية. أثبتت التجارب الأولية باستخدام مرحلة 18 إلى 20 مرحلة الجنين الفرخ شرائح الحبل الشوكي غير مثمرة، ونحن لم تكن قادرة على الحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة لفترة أطول من بضع ساعات، وعجزوا عن إثبات توليد أعداد كبيرة من الخلايا LMCl خلال الفترة الثقافة (البيانات لا تظهر). نحن التحقيق وبالتالي الثقافات شريحة من مرحلة الأجنة 24، وtimepoint عندما تم إنشاء معظم الخلايا العصبية وLMCl LMCm، ولكن عندما LMCl الخلايا العصبية لا تزال في الهجرة أنا لهاnfancy (الشكل 1A-C). هذه الهجرة من الخلايا العصبية الجانبية LMCl اكتمال المرحلة إلى حد كبير 27، 24 حتي 36 حول الموارد البشرية في وقت لاحق (الشكل 1 DF). وبالتالي يمكن أن تكون مبسطة مقايسة لدينا لتكون قادرة على الحفاظ على الخلايا العصبية على قيد الحياة، وتسهيل هجرتهم أفقيا في القرن البطني. بدأنا تجاربنا مع ظروف ثقافة بسيطة نسبيا تحتوي فقط هانك حل متوازن الملح مع أو بدون مصل الدجاج أو الدجاج استخراج الجنين. في جميع الحالات، على الرغم من أننا كنا قادرين على الحفاظ على الخلايا العصبية LMC في شريحة، وجدنا أدلة تذكر على أن الحفاظ على الخلايا العصبية LMCl (على الأقل من التعبير عن LHX-1). علاوة على ذلك، وجدنا التعبير غير لائق من الجينات مثل HB9 في النخاع الشوكي الظهري، وهي حالة لم تحدث في الجسم الحي (البيانات لا تظهر). وبالتالي، فإن هذه الظروف الثقافة بسيطة ليست مناسبة للتحقيق في الاستيلاء على تنظيم الخلايا العصبية الحركية. وبالتالي سعينا من conditio أكثر تعقيداNS وكقاعدة استخدام صيغة الذي تم نشره لتسهيل بقاء الخلايا العصبية فصل الدجاج السيارات الجمجمة الجنينية. هذا الشرط 20 (1٪ مستخلص الجنين الفرخ، 1٪ بكتيريا القلم، 0.35٪ الجلوتامين L-، 0.1٪ 2-المركابتويثانول، 2٪ من مصل الحصان، الملحق 2٪ B27 و 50 ciliaryneurotrophic النمو نانوغرام / مل عامل (CNTF) في المتوسط ​​neurobasal (هنا يسمى غوثري متوسطة) لم تبقي الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة أكثر من وسائل الإعلام أكثر بساطة. بالإضافة إلى ذلك، لم تسفر عن التعبير زائفة من عوامل النسخ في النخاع الشوكي الظهري، إلا أن بقاء الخلايا العصبية LMCl كان ضعيفا (الشكل 1 غي، ع)، ونحن بالتالي تفاوتت ما تعتبر عوامل رئيسية في غوثري المتوسطة، وهما من أصل حيواني من المصل، وتركيز المصل وتركيز CNTF في المتوسط. لقد وجدنا أن تغيير المصل من مصل الحصان لمصل الفرخ وزيادة في تركيز CNTF من 50 نانوغرام / مل إلى 100 نانوغرام / مل ر زيادة كبيرةانه البقاء للخلايا LMCl وLMCm ويسمح أيضا هجرتهم إلى القرن البطني على مدار 24 ساعة من الشروط الثقافة (الشكل 1 جى، ص). إجمالي عدد الخلايا العصبية الحركية، نسبة إلى LMCm LMCl، بل ويبدو أن هجرة الخلايا LMCl في القرن البطني مشابهة جدا لأجزاء من الأجنة التي كان قد سمح لتطوير في البيضة وليس في ثقافة شريحة (الشكل 1 كو ع). وبالتالي، فإننا نعتقد أن يعتمد على عدد النسخ التعبير عامل الخلية، وموقف الخلايا العصبية الحركية، وظروف ثقافتنا شريحة ألخص العادية الشوكي الخلايا العصبية الحركية التنمية على الأقل على مدى فترة على مدار 24 ساعة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> الشكل 1. أ - ج. مركز جيل من LMC (Foxp1 تلطيخ فيب) وLMCl (LHX-1 في تلطيخ) في المرحلة 24. ج هو دمج للقناتين. يظهر خط الوسط كخط منقط في وD، V يظهر اتجاه محور (D، V) ظهري بطني من الحبل الشوكي د - و. . حالة LMC (Foxp1 تلطيخ في د) وLMCl (LHX-1 في تلطيخ ه) تنظيم في مرحلة 27 واو هو دمج للقناتين ز - ط. LHX-1 (ز) وFoxp1 (ح) في التعبير أقسام شريحة مثقف في وسط الجمجمة التي تدعم بقاء الخلية العصبية المحركة (غوثري المتوسطة، لدينا &quot;المتوسط ​​الأولي&quot; انظر المرجع 20). لم يعد أعرب LHX-1 في الخلايا العصبية الحركية، على الرغم من وجود بعض الخلايا بقاء LMC يتضح من Foxp1 التعبير. D، V في (ز) يدل على اتجاه محور (D، V) ظهري بطني من الحبل الشوكي. ML يبين اتجاه محور (M، L) الناصف الوحشي من لياليبينال ي الحبل - لتر. ويمكن ملاحظة الخلايا LMCl (LHX-1 في القرن البطني في ي) وLMC بشكل عام (في Foxp1 ك) في شرائح المستزرعة في المتوسط ​​تحتوي على 4٪ فرخ المصل و 100 نانوغرام / مل CNTF. لاحظ أنه يتم العثور على بعض الخلايا LMCl في موقف الوحشي في القرن البطني. السهم في (ي) ويبين موقف الجانبية لبعض خلايا LMCl. (ل) هو دمج للقناتين م - س. حالة التعبير عن LHX-1 (م) وFoxp1 (ن) في أقسام الجنين في البيضة حافظ خلال ثقافة شريحة من الجنين هو مبين في ي - ل. (س) هو دمج للقناتين. ف. تحديد الكميات من نسبة LMCl (Foxp1 + هاء / Lhx1 + VE) مقابل الخلايا LMC (Foxp1 + هاء / هاء Lhx1) الخلايا الموجودة في الثقافات شريحة في ظروف مختلفة جompared للسيطرة على الأجنة يوضع في البيضة (التي تمثل 100٪). الطالب اختبار تي *** يمثل P &lt;0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol at JoVE.com

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

الثقافات شريحة تسهيل التلاعب تطور الجنين بواسطة الجينات والاضطرابات الدوائية. ومع ذلك، يجب التأكد من أن ظروف ثقافة التطور الطبيعي يمكن المضي قدما في خفض البيئة من شريحة. نحن توضيح البروتوكول الذي يسهل التطور الطبيعي الحبل الشوكي على المضي قدما لمدة لا تقل عن 24 ساعة.

الدجاج الأجنة شريحة الحبل الشوكي الثقافة البروتوكول

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.9K Views.  University College London. الثقافات شريحة تسهيل التلاعب تطور الجنين بواسطة الجينات والاضطرابات الدوائية. ومع ذلك، يجب التأكد من أن ظروف ثقافة التطور الطبيعي يمكن المضي قدما في خفض البيئة من شريحة. نحن توضيح البروتوكول الذي يسهل التطور الطبيعي الحبل الشوكي على المضي قدما لمدة لا تقل عن 24 ?...

Video: Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

وحدة للسيارات وظيفية في صحن الثقافة: شارك في ثقافة Explants النخاع الشوكي وخلايا العضلات

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

إصابة الحبل الشوكي الكامل وبروتوكول تشريح الدماغ لاحقا Wholemount<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في اليرقات البحر الجلكى

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique eliminates laminectomy by removing two spinous processes and lifting, then tilting the caudal vertebral arch. The surgical area opens up without the need for laminectomy. Lateral hemisection is then performed with direct visible control under a microscope. The trauma is minimized, requiring only a small bone wound. 
This technique has several advantages: it is faster and, therefore, less of a burden for the animal, and the bone wound is smaller. Because the laminectomy is eliminated, there is less chance for unwanted injury to the spinal cord, and there are no bone splinters that can cause problems (bone splinters embedded in the spinal cord can cause swelling and secondary damage). The vertebral canal remains intact. The main limitation is that the hemisection can only be performed in the intervertebral spaces. 
The results show that this technique can be performed much faster than the traditional surgical approach, using laminectomy (11 min vs. 35 min). This technique can be useful for researchers working with animal models of open spinal cord injury as it is widely adaptable and does not require any additional specialized instrumentation.

Here, we describe a new, fast technique modeling open spinal cord injury in rats that eliminates laminectomy. Lateral hemisection is performed while viewing through a microscope. The technique is versatile and can also be used in the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spinal cord of other animals.

تقنية تشريح جانبي للحبل الشوكي طفيفة التوغل وسريعة لنمذجة إصابات الحبل الشوكي المفتوحة في الفئران

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...