يتم دعم هذا العمل من قبل معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، المعاهد الوطنية للصحة (K25HD097288 ، R21HD112663).

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة واين ستيت.
1. التحضير التجريبي
<ol><li>استخدم محلول إيثانول بنسبة 70٪ لتنظيف وتعقيم المقص والملاقط. أيضا ، إعداد ماصات يمكن التخلص منها وحقنة.</li>
	<li>قم بإعداد وسط غسيل بإضافة 3.595 جم من كلوريد الصوديوم إلى 495 مل من الماء منزوع الأيونات. ثم أضف 5 مل من البنسلين والستربتومايسين (5 وحدة / مل) إلى الوسط. املأ طبق بتري 100 مم بوسط الغسيل وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإعداد أطباق الاستزراع وفقا للشكل 1 ، الذي يوضح التكوين العام.<ol><li>قم بإعداد قطعة من ورق الترشيح ، وقم بتقطيعها إلى شكل مستطيل يبلغ حوالي 17 مم × 20 مم ، وقم بإزالة الزوايا الأربع. قم بإنشاء مركز مجوف في ورق الترشيح ، بحجم 7 مم × 10 مم تقريبا لتأمين الجنين (الشكل 1 ، يسار). ملاحظة: يتم وصف جمع الأجنة في الخطوة 2.</li>
		<li>قم بتوصيل حلقة تجارية متاحة (Φ = 1 بوصة ، انظر جدول المواد) بطبقة فيلم مرنة (أي فيلم البارافين) ، مما يضمن أن الفيلم المرن يحتوي أيضا على مركز مجوف. سيتم استخدام هذه الحلقة مع الفيلم لتثبيت ورقة الترشيح مع الجنين.</li>
		<li>أخيرا ، ضع الحلقة المحضرة في طبق بتري 35 مم (الشكل 1 ، يمين). ملاحظة: ورق الترشيح مخصص لتأمين الجنين المستخرج وتثبيته عن طريق وضع ورق الترشيح على الغشاء وترك الجنين في المنطقة المجوفة المركزية (والتي سيتم تفصيلها في الخطوة 2). تم قطع الزوايا الأربع لتناسب حجم الحلقة الخارجية (ليس ضروريا إذا كانت مثبتة بالفعل). يتم استخدام طبق استزراع ذو قاع زجاجي 35 مم لتحسين انتشار شعاع الليزر. يحتوي الطبق على بئر داخلي (Φ = 23 مم) ، والذي يمكن ملؤه بالزلال لثقافة البيض السابقة . يجب أن يكون قطر الحلقة أكبر من قطر البئر الداخلي بحيث يمكن تغطية البئر بالفيلم المرن على الحلقة (الشكل 1 ، أقحم). حجم ورق الترشيح غير مقيد ويمكن تعديله وفقا لحجم الحلقة المختارة وطبق الاستزراع. بدلا من ذلك ، يمكن طلاء قاع الطبق مسبقا بطبقة من الأغاروز (سمك: ~ 1 مم). عن طريق إزالة الأغاروز من وسط الطبقة باستخدام شفرة ، يمكن إنشاء بئر ذو شكل مشابه للمركز المجوف للفيلم المرن لتحميل الزلال. إحدى النقاط الحرجة هي أن الجوانب الأربعة لورق الترشيح المجوف يجب أن يكون لها عرض كاف (> 5 مم) لضمان ارتباط الجنين.</li>
	</ol></li>
</ol>2. استخراج وزراعة البيض من جنين الدجاج
ملاحظة: تم تعديل هذه الخطوة من التقارير المنشورة مسبقا40,41.
<ol><li>بعد ما قبل الاستزراع ، استرجع البويضة من الحاضنة وضعها على محورها الطويل على صينية كرتون البيض. نظف قشر البيض بنسبة 70٪ من الإيثانول ، مع التأكد من تغطية السطح بالكامل ، ثم اتركه يرتاح لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>امسك البيضة على محورها القصير وكسرها في الأسفل. افتح البيضة على طبق بتري نظيف 100 مم لاستخراج محتوياتها ، كما هو موضح في الشكل 2. تأكد من عدم تدوير البيضة أثناء حملها وتكسيرها.</li>
	<li>باستخدام ماصة ، قم بنقل وجمع ما يقرب من 10 مل من الزلال الرقيق (أي الزلال السائل42) في أنبوب سعة 15 مل لاستخدام زراعة البويضات السابقة . املأ البئر المركزي لطبق الاستزراع بالزلال الرقيق الذي تم جمعه (حوالي 0.9 مل) ، كما هو موضح في الشكل 3. يجب أن تكون عملية التعبئة بطيئة ، وتجنب تكوين أي فقاعات داخل البئر. تأكد من تسخين طبق الاستزراع مع الزلال إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: سيتم استخدام هذا الطبق لزراعة الجنين خارج البيض. سيتم استخدام أطباق استزراع جديدة مملوءة بوسط الغسيل أثناء تصوير بريلوين (انظر الخطوة 3).</li>
	<li>باستخدام المناديل الورقية، أزل الزلال السميك (أي الزلال اللزج) المرتبط بالجنين برفق عن طريق فصل الزلال بعناية عن الغشاء اللاصق، كما هو موضح في الشكل 4. تجنب الاتصال المباشر مع غشاء vitelline.</li>
	<li>بعد إزالة كل الزلال السميك ، قم بتثبيت ورق الترشيح بعناية على غشاء vitelline. تأكد من محاذاة محور جسم الجنين مع المحور الطويل للمستطيل المركزي على ورق الترشيح. استخدم المقص لقطع الغشاء المحيط بورق الترشيح.</li>
	<li>باستخدام الملقط ، اسحب ورق الترشيح المعزول برفق بعيدا عن صفار البيض في اتجاه مائل. اقلب ورقة الترشيح رأسا على عقب لوضع الجنين مع جانبه الظهري لأسفل (لتكوين المجهر المقلوب). اغمر ورق الترشيح بالكامل بعناية من جانب واحد من المحور الطويل في طبق بتري مقاس 100 مم باستخدام وسيط الغسيل بطريقة مائلة.</li>
	<li>اغسل أي صفار متبقي عن طريق رش وسط الغسيل برفق مواز لورق الترشيح باستخدام ماصة نظيفة. تجنب رش وسيط الغسيل مباشرة على الغشاء.</li>
	<li>بعد إزالة كل صفار البيض ، قم بإزالة ورق الترشيح بعناية من وسط الغسيل واستخدم المناديل الورقية لامتصاص أي وسيط زائد من الحواف. بعد ذلك، ضع ورقة الترشيح مع الجنين على طبق المستزرع، مع التأكد من أن الجانب الظهري للجنين متجها لأسفل، كما هو موضح في الشكل 5. للحفاظ على الرطوبة ، ضع مناديل مبللة في الطبق.</li>
	<li>انقل طبق الثقافة إلى الحاضنة على خشبة المسرح لثقافة البيض السابقة .</li>
</ol>3. قياس بريلوين للجنين
<ol><li>تحضير مجموعة أخرى من أطباق الثقافة وملء لهم المتوسطة غسل. تأكد من تسخين وسط الغسيل إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>عندما يصل الجنين إلى مرحلة النمو المطلوبة ، انقل ورق الترشيح مع الجنين إلى طبق الاستزراع المملوء بوسط الغسيل. ضع طبق الاستزراع في حاضنة مجهر بريلوين على خشبة المسرح (انظر جدول المواد).<ol><li>قبل إجراء قياس Brillouin ، احفظ صورة المجال الساطع للجنين بأكمله كمرجع. تم وصف التكوين التفصيلي لمجهر بريلوين سابقا30 وتم تلخيصه في قسم النتائج (الشكل 6).</li>
	</ol></li>
	<li>قم بقياس إشارة Brillouin للماء والميثانول ، والتي سيتم استخدامها في الخطوة 4 لعملية المعايرة.</li>
	<li>اضبط وقت التعرض للكاميرا لطاقة الليزر الساقطة وجهاز اقتران الشحنة المضاعف للإلكترون (EMCCD، انظر جدول المواد) لتحقيق ما لا يقل عن 10000 عدد من إشارات Brillouin. باستخدام صورة المجال الساطع كدليل، قم بإعداد نطاق المسح الضوئي وحجم الخطوة. الحصول على صورة Brillouin للمنطقة محل الاهتمام عن طريق مسح الجنين باستخدام مرحلة الترجمة 2D. ملاحظة: يمكن تحديد نطاق المسح الأفقي بناء على صورة المجال الساطع ، ويمكن تحديد نطاق المسح الرأسي (أي العمق) بناء على قوة الإشارة التي تم الحصول عليها من المسح السريع والخشن. لمنع أي تلف ضوئي للجنين ، حدد طاقة الحادث إلى 25 ميجاوات ، واضبط وقت التعرض لكاميرا EMCCD على 50 مللي ثانية. اختر حجم خطوة 2 ميكرومتر في الاتجاه الأفقي و 1 ميكرومتر في الاتجاه الرأسي لتحقيق التوازن بين جودة التصوير ووقت الاستحواذ.</li>
	<li>بعد الانتهاء من الفحص ، قم بإزالة ورق الترشيح بعناية مع الجنين واستخدم المناديل الورقية لامتصاص أي وسيط غسيل زائد. بعد ذلك ، ضع ورق الترشيح مرة أخرى في طبق الاستزراع المملوء بالزلال الرقيق للزراعة المستمرة في الحاضنة على المسرح.</li>
	<li>كرر الخطوات 3.2-3.5 على فترات زمنية منتظمة (على سبيل المثال ، 1.5 ساعة) لالتقاط صور بريلوين ذات الفاصل الزمني أثناء نمو الجنين.</li>
	<li>أعد بناء صورة 2D Brillouin باتباع الخطوة 4.</li>
</ol>4. إعادة بناء صورة بريلوين
<ol><li>معايرة مطياف بريلوين باستخدام إشارات بريلوين للماء والميثانول لحساب النطاق الطيفي الحر (FSR) ونسبة تحويل البكسل إلى التردد (PR) لمقياس الطيف30. سيتم استخدام القيم المعايرة ل FSR و PR لحساب إزاحة Brillouin للجنين عند كل بكسل. ملاحظة: يعرض الشكل 7A طيف بريلوين الخام الذي تم التقاطه بواسطة كاميرا EMCCD. من خلال جمع الطيف عموديا ثم القيام بتركيب لورنتزيان ، يمكن الحصول على مسافة الذروة Δd للنقطتين (الشكل 7B). من خلال الحصول على مسافة الذروة من الماء Δdالماء والميثانول Δdالميثانول ، يمكن حساب FSR و PR بناء على المعادلات30: PR = 2 · (ωالميثانول - ωالماء) / (Δd الماء - Δdالميثانول) ، و FSR = 2 · ωالماء + PR ·Δd الماء ، مع تحول بريلوين المعروف للمياه ωالماء = 6.01 جيجا هرتز والميثانول ωالميثانول = 4.49 جيجا هرتز عند 660 نانومتر.</li>
	<li>احصل على مسافة الذروة لإشارة Brillouin عند كل بكسل من العينة. احسب إزاحة بريلوين بناء على FSR و PR المعارين:ω sample = 0.5 (FSR -PR x Δd sample) 30 ، حيث ωالعينة هي إزاحة بريلوين للعينة ،وعينة Δd هي مسافة الذروة لإشارة بريلوين.</li>
	<li>أعد بناء صورة 2D Brillouin بناء على إزاحات Brillouin لجميع وحدات البكسل. ملاحظة: لإجراء تحليل محلي ، يمكن للمرء اختيار منطقة الاهتمام (على سبيل المثال ، اللوحة العصبية) من صورة Brillouin المكتسبة وتحديد خصائصها الميكانيكية. النهج الشائع هو حساب متوسط تحول بريلوين للمنطقة المختارة.</li>
</ol>

المراقبة الطولية لميكانيكا الصفائح العصبية في تطور جنين الفرخ

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

يمكن أن يتأثر التطور المبكر للجنين بسهولة بالاضطرابات الخارجية. لذلك ، يجب توخي أقصى درجات الحذر أثناء استخراج العينة ونقلها. إحدى المشكلات المحتملة هي انفصال الجنين عن ورقة الترشيح ، مما قد يؤدي إلى تقلص غشاء vitelline ويؤدي إلى قطعة أثرية مائلة من اللوحة العصبية في تصوير Brillouin. علاوة على ذلك ...

عيوب الأنبوب العصبي (NTDs) هي عيوب خلقية شديدة في الجهاز العصبي المركزي ناتجة عن الفشل في إغلاق الأنبوب العصبي (NTC) أثناء التطور الجنيني1. مسببات أمراض المناطق المدارية المهملة معقدة. أظهرت الدراسات أن NTC ينطوي على سلسلة من العمليات المورفولوجية ، بما في ذلك التمديد المتقارب ، وثني الصفيحة العصبية (على سبيل المثال ، الانقباض القمي) ، ورفع الطية العصبية ، وأخيرا التصاق الطية العصبية. وتنظم هذه العمليات آليات جزيئية وجينية متعددة 2,3، وأي خلل في هذه العمليات قد يؤدي إلى أمراض المناطق المدارية المهملة 4,5,6. نظرا لأن الأدلة المتزايدة تشير إلى أن الإشارات الميكانيكية تلعب أيضا أدوارا حاسمة خلال NTC3،7،8،9،10،11 ، وقد تم العثور على علاقات بين الجينات والإشارات الميكانيكية12،13،14 ، يصبح من الضروري التحقيق في الميكانيكا الحيوية للأنسجة أثناء العصبية.
تم تطوير العديد من التقنيات لقياس الخواص الميكانيكية للأنسجة الجنينية ، بما في ذلك الاستئصال بالليزر (LA) 15 ، تشريح الأنسجة وانبساطها (TDR) 16،17 ، شفط الماصة الدقيقة (MA) 18 ، المسافة البادئة النانوية القائمة على مجهر القوة الذرية (AFM)19 ، microindenter (MI) والألواح الدقيقة (MP) 20 ، الريولوجيا الدقيقة (MR) مع ملاقط بصرية / مغناطيسية21،22،23، وأجهزة الاستشعار القائمة على القطيرات24. يمكن للطرق الحالية قياس الخواص الميكانيكية بدقة مكانية تتراوح من المقاييس تحت الخلوية إلى مقاييس الأنسجة. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق غازية لأنها تتطلب ملامسة العينة (على سبيل المثال ، MA و AFM و MI و MP) ، أو حقن المواد الخارجية (على سبيل المثال ، أجهزة الاستشعار القائمة على التصوير بالرنين المغناطيسي والقطرات) ، أو تشريح الأنسجة (على سبيل المثال ، LA و TDR). نتيجة لذلك ، من الصعب على الطرق الحالية مراقبة التطور الميكانيكي لأنسجة الصفيحة العصبية في الموقع25. في الآونة الأخيرة ، أظهر التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري الصدى وعدا لرسم الخرائط الميكانيكية غير الملامسة بدقة مكانية عالية26.
الفحص المجهري Brillouin Confocal هو طريقة بصرية ناشئة تتيح القياس الكمي غير المتصل للميكانيكا الحيوية للأنسجة بدقة تحت الخلوية27،28،29،30. يعتمد الفحص المجهري Brillouin على مبدأ تشتت ضوء Brillouin التلقائي ، وهو التفاعل بين ضوء الليزر الساقط والموجة الصوتية الناتجة عن التقلبات الحرارية داخل المادة. وبالتالي ، فإن الضوء المبعثر يتعرض لتحول تردد ، يعرف باسم إزاحة بريلوين ωR ، باتباع المعادلة31:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
هنا ، <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;"> هو معامل الانكسار للمادة ، λ هو الطول الموجي للضوء الساقط ، M ' هو المعامل الطولي ، ρ هي كثافة الكتلة ، و θ هي الزاوية بين الضوء الساقط والضوء المتناثر. بالنسبة لنفس النوع من المواد البيولوجية ، تكون نسبة معامل الانكسار والكثافة <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;"> ثابتة تقريبا28،32،33،34،35،36. وبالتالي ، يمكن استخدام تحول بريلوين مباشرة لتقدير التغيرات الميكانيكية النسبية في العمليات الفسيولوجية. تم التحقق من جدوى الفحص المجهري Brillouin في عينات بيولوجية مختلفة29،37،38. في الآونة الأخيرة ، تم عرض التصوير الميكانيكي بفاصل زمني لجنين كتكوت حي من خلال الجمع بين مجهر بريلوين ونظام حضانة على خشبة المسرح39. يوفر هذا البروتوكول وصفا تفصيليا لإعداد العينات وتنفيذ التجربة ومعالجة البيانات وتحليلها بعد المعالجة. نأمل أن يسهل هذا الجهد الاعتماد الواسع النطاق لتقنية Brillouin غير الملامسة لدراسة التنظيم الميكانيكي الحيوي في تطور الجنين والعيوب الخلقية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D motorized stage&#160;</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillouin Microscope with on-stage incubator</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken eggs</td>
			<td>University of Connecticut</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CS2100M-USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>#2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for in ovo culture</td>
			<td>GQF Manufacturing Company Inc.&#160;</td>
			<td>GQF 1502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>On-stage incubator</td>
			<td>Oko labs</td>
			<td>OKO-H301-PRIOR-H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Artman instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3pc Micro Scissors 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>DR Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microdissection Forceps Set&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo

إغلاق الأنبوب العصبي (NTC) هو عملية حاسمة أثناء التطور الجنيني. يمكن أن يؤدي الفشل في هذه العملية إلى عيوب الأنبوب العصبي ، مما يسبب تشوهات خلقية أو حتى الوفيات. يتضمن NTC سلسلة من الآليات على المستويات الوراثية والجزيئية والميكانيكية. في حين أن التنظيم الميكانيكي أصبح موضوعا جذابا بشكل متزايد في السنوات الأخيرة ، إلا أنه لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير بسبب عدم وجود تقنية مناسبة لإجراء الاختبارات الميكانيكية للأنسجة الجنينية 3D في الموقع. استجابة لذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول لتحديد الخواص الميكانيكية للأنسجة الجنينية للدجاج بطريقة غير ملامسة وغير جراحية. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج مجهر بريلوين متحد البؤر مع نظام حضانة على المسرح. لفحص ميكانيكا الأنسجة ، يتم جمع جنين مزروع مسبقا ونقله إلى حاضنة على خشبة المسرح لزراعة البويضات السابقة . في الوقت نفسه ، يتم الحصول على الصور الميكانيكية لأنسجة الصفيحة العصبية بواسطة مجهر بريلوين في نقاط زمنية مختلفة أثناء التطوير. يتضمن هذا البروتوكول وصفا مفصلا لإعداد العينات ، وتنفيذ تجارب الفحص المجهري Brillouin ، والمعالجة اللاحقة للبيانات وتحليلها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين دراسة التطور الميكانيكي للأنسجة الجنينية أثناء التطور طوليا.

Neural tube defects (NTDs) are severe birth defects of the central nervous system caused by failures in neural tube closure (NTC) during embryonic development1. The etiology of NTDs is complex. Studies have shown that NTC involves a sequence of morphogenetic processes, including convergent extension, bending of the neural plate (e.g., apical constriction), elevating the neural fold, and finally adhesion of the neural fold. These processes are regulated by multiple molecular and genetic mechanisms2,3, and any malfunction in these processes may result in NTDs4,5,6. As mounting evidence suggests that mechanical cues also play crucial roles during NTC3,7,8,9,10,11, and relationships have been found between genes and mechanical cues12,13,14, it becomes imperative to investigate the tissue biomechanics during neurulation.
Several techniques have been developed for measuring the mechanical properties of embryonic tissues, including laser ablation (LA)15, tissue dissection and relaxation (TDR)16,17, micropipette aspiration (MA)18, Atomic Force Microscopy (AFM)-based nanoindentation19, microindenters (MI)&#160;and microplates (MP)20, micro rheology (MR) with optical/magnetic tweezers21,22,23, and droplet-based sensors24. Existing methods can measure mechanical properties at spatial resolutions ranging from subcellular to tissue scales. However, most of these methods are invasive because they require contact with the sample (e.g., MA, AFM, MI, and MP), external material injection (e.g., MR and droplet-based sensors), or tissue dissection (e.g., LA and TDR). As a result, it is challenging for existing methods to monitor the mechanical evolution of neural plate tissue in situ25. Recently, reverberant optical coherence elastography has shown promise for non-contact mechanical mapping with high spatial resolution26.
Confocal Brillouin microscopy is an emerging optical modality that enables non-contact quantification of tissue biomechanics with subcellular resolution27,28,29,30. Brillouin microscopy is based on the principle of spontaneous Brillouin light scattering, which is the interaction between the incident laser light and the acoustic wave induced by thermal fluctuations within the material. Consequently, the scattered light experiences a frequency shift, known as the Brillouin shift &#969;R, following the equation31:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (1)
Here, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;" /> is the refractive index of the material,&#160;&#955; is the wavelength of the incident light, M&#39; is the longitudinal modulus, &#961; is the mass density, and &#952; is the angle between the incident light and the scattered light. For the same type of biological materials, the ratio of refractive index and density <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;" /> is approximately constant28,32,33,34,35,36. Thus, the Brillouin shift can be directly used to estimate relative mechanical changes in physiological processes. The feasibility of Brillouin microscopy has been validated in various biological samples29,37,38. Recently, time-lapse mechanical imaging of a live chick embryo was demonstrated by combining a Brillouin microscope with an on-stage incubation system39. This protocol provides detailed descriptions of sample preparation, experiment implementation, and data post-processing and analysis. We hope this effort will facilitate the widespread adoption of non-contact Brillouin technology for studying biomechanical regulation in embryo development and birth defects.

تسليط الضوء على المؤلف: قياس عدم الاتصال لميكانيكا الأنسجة في أجنة الكتاكيت الحية باستخدام مجهر بريلوين

مراقبة التطور الميكانيكي للأنسجة أثناء إغلاق الأنبوب العصبي لجنين الفرخ

The scope of this research is to develop a novel tool that can measure tissue mechanics of a live embryo. Using this tool, we want to understand how tissue mechanics evolves when the embryo is experiencing neuron tube closure. This can help us understand the mechanical regulations in embryonic development.To measure tissue stiffness, current methods such as atomic force microscopy, nanoidention, and micropipette aspiration need to contact sample physically and apply force to deform it. This is highly challenging for measuring tissue mechanics of live embryo in situ. Here, we employed an optical technology named Brillouin microscopy.Compared to other technologies, Brillouin microscopy only uses a focus beam to measure tissue mechanics. Thus, this is a non-contact and a noninvasive method and has some microspatial resolution. This allow us to capture time-lapse mechanical image of a live embryo in situ.In the future, we want to understand the role of tissue mechanics in embryonic development thoroughly. In specific, we want to study how genetic factors, biochemical signaling pathway, and tissue mechanics coordinate with each other in morphogenesis. This could provide us with new insight in the provision of birth disease such as neuron tube defects.

يوضح الشكل 6 الرسم التخطيطي لمجهر بريلوين. يستخدم النظام ليزر 660 نانومتر كمصدر للضوء. يتم وضع عازل مباشرة بعد رأس الليزر لرفض أي ضوء منعكس من الخلف ، ويتم استخدام مرشح الكثافة المحايدة (ND) لضبط طاقة الليزر. يتم استخدام زوج من العدسات ، L1 و L2 ، بأطوال بؤرية f1 = 16 مم و f2 = 100 مم ، عل?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo at JoVE.com

تم تطوير هذا البروتوكول لمراقبة الخصائص الميكانيكية لأنسجة الصفيحة العصبية طوليا أثناء تعصيب جنين الفرخ. يعتمد على دمج مجهر بريلوين ونظام حضانة على خشبة المسرح ، مما يتيح التصوير الميكانيكي الحي لأنسجة الصفيحة العصبية في أجنة الكتاكيت المستزرعة خارج البويضات .

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

نطاق هذا البحث هو تطوير أداة جديدة يمكنها قياس ميكانيكا الأنسجة للجنين الحي. باستخدام هذه الأداة، نريد أن نفهم كيف تتطور ميكانيكا الأنسجة عندما يتعرض الجنين لإغلاق أنبوب الخلية العصبية. يمكن أن يساعدنا ذلك في فهم اللوائح الميكانيكية في التطور الجنيني.لقياس صلابة الأنسجة ، تحتاج الطرق الحالية مثل الفحص المجهري للقوة الذرية ، و nanoidention ، وشفط الماصة الدقيقة إلى الاتصال بالعينة جسديا وتطبيق القوة لتشويهها. هذا يمثل تحديا كبيرا لقياس ميكانيكا الأنسجة للجنين الحي في الموقع. هنا ، استخدمنا تقنية بصرية تسمى مجهر بريلوين.بالمقارنة مع التقنيات الأخرى ، يستخدم الفحص المجهري Brillouin شعاع التركيز فقط لقياس ميكانيكا الأنسجة. وبالتالي ، فهذه طريقة غير تلامسية وغير جراحية ولها بعض الدقة المكانية الدقيقة. هذا يسمح لنا بالتقاط صورة ميكانيكية بفاصل زمني لجنين حي في الموقع.في المستقبل ، نريد أن نفهم دور ميكانيكا الأنسجة في التطور الجنيني بدقة. على وجه التحديد ، نريد دراسة كيفية تنسيق العوامل الوراثية ومسار الإشارات الكيميائية الحيوية وميكانيكا الأنسجة مع بعضها البعض في التشكل. هذا يمكن أن يوفر لنا رؤية جديدة في توفير أمراض الولادة مثل عيوب الأنبوب العصبي.

monitoring-mechanical-evolution-tissue-during-neural-tube-closure

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

530 Views.  Wayne State University. نطاق هذا البحث هو تطوير أداة جديدة يمكنها قياس ميكانيكا الأنسجة للجنين الحي. باستخدام هذه الأداة، نريد أن نفهم كيف تتطور ميكانيكا الأنسجة عندما يتعرض الجنين لإغلاق أنبوب الخلية العصبية. يمكن أن يساعدنا ذلك في فهم اللوائح الميكانيكية في التطور الجنيني.لقياس صلابة الأن?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: قياس عدم الاتصال لميكانيكا الأنسجة في أجنة الكتاكيت الحية باستخدام مجهر بريلوين

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital malformations or even mortality. NTC involves a series of mechanisms on genetic, molecular, and mechanical levels. While mechanical regulation has become an increasingly attractive topic in recent years, it remains largely unexplored due to the lack of suitable technology for conducting mechanical testing of 3D embryonic tissue in situ. In response, we have developed a protocol for quantifying the mechanical properties of chicken embryonic tissue in a non-contact and non-invasive manner. This is achieved by integrating a confocal Brillouin microscope with an on-stage incubation system. To probe tissue mechanics, a pre-cultured embryo is collected and transferred to an on-stage incubator for ex ovo culture. Simultaneously, the mechanical images of the neural plate tissue are acquired by the Brillouin microscope at different time points during development. This protocol includes detailed descriptions of sample preparation, the implementation of Brillouin microscopy experiments, and data post-processing and analysis. By following this protocol, researchers can study the mechanical evolution of embryonic tissue during development longitudinally.

This protocol was developed to longitudinally monitor the mechanical properties of neural plate tissue during chick embryo neurulation. It is based on the integration of a Brillouin microscope and an on-stage incubation system, enabling live mechanical imaging of neural plate tissue in ex ovo cultured chick embryos.

Experimental Preparation and Ex Ovo Culture of Chicken Embryo for Brillouin Microscopy

To begin, cut the filter paper into a rectangular shape of approximately 17 by 20 millimeters and remove the four corners. Then, create approximately seven by 10 millimeters of hollow center in the filter paper. Attach a commercially available ring to a flexible film layer and create a hollow center in the flexible film layer.Place a prepared ring into a 35-millimeter Petri dish. After pre-culturing, retrieve the egg from the incubator, and place it on its long axis on the egg carton tray. Clean the entire surface of the eggshell with 70%ethanol, and allow it to rest for 15 minutes.Hold the egg on its short axis and crack it at the bottom. Open the egg over a clean 100-millimeter Petri dish to extract its contents. Using a pipette, transfer approximately 10 milliliters of the thin albumin into a 15-milliliter tube for ex ovo culture.Fill the center well of the culture dish with thin albumin. Using tissue paper, gently remove the thick albumin attached to the vitelline membrane of the embryo. Now, carefully affix the filter paper to the vitelline membrane, ensuring the body axis of the embryo aligns with the center rectangle on the filter paper.Cut the membrane surrounding the filter paper with scissors. Using tweezers, gently pull the isolated filter paper away from the yoke in an oblique direction. Flip the filter paper upside down to position the embryo with its dorsal side down.Carefully immerse the entire filter paper from one side of the long axis into the 100-millimeter Petri dish containing wash medium. Using a clean pipette, gently spray the wash medium parallel to the filter paper to remove any residual yolk. Next, carefully remove the filter paper from the wash medium, and use tissue paper to absorb any excess medium from the edges of the embryo.Place the filter paper with the embryo onto the culture dish, ensuring that the dorsal side of the embryo is facing downward. Transfer the culture dish to the onstage incubator for ex ovo culture. Fill the culture dishes with a warm wash medium.When the embryo reaches a desired developmental stage, transfer the filter paper with the embryo to the culture dish filled with a wash medium. Place the culture dish into the onstage incubator of the Brillouin microscope. For the calibration process, measure the Brillouin signal of water.Then, measure the Brillouin signal of methanol. Under bright-field imaging with a four times objective lens, adjust the laser illumination point to the second pair of somites. Then, switch to a 40 times objective lens and perform fine adjustment of the laser point to the middle of the neural tube.Unblock the laser beam and adjust the focal plane. Scan the embryo using a two-dimensional translational stage and acquire a Brillouin image of the region of interest. After completing the scan, carefully remove the filter paper with the embryo.Use tissue paper to absorb any excess wash medium from the embryo. Place the embryo back into the culture dish filled with thin albumin for continuous culturing. For Brillouin image reconstruction, load the water and methanol signal data.Click set region and select the region with four dots for calculating calibration parameters. Save the calibration results. Load the embryo scanning data, and click start for the processing of the parameters.Finally, reconstruct the 2-D Brillouin image based on the Brillouin shifts of all pixels. Brillouin shift in the estimated longitudinal modulus of the neural plate against somite number and incubation time showed an increase in Brillouin shift of the tissue during neural tube closure.