نود أن نشكر معهد البوليتكنيك ورسستر قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية للحصول على التمويل.

1. ترنسفكأيشن خطوط الخليوي أسلوب ترنسفكأيشن 1 (Lonza Nucleofection لزيادة كفاءة الخلية الأولية ترنسفكأيشن) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تكون خلايا للمرور مؤخرا والنمو في المرحلة السابقة لتسجيل ترنسفكأيشن. غسل الخلايا في phophate مخزنة المالحة (PBS) والخلايا التي trypsinization الحصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تعقيم تغطية زلات لوحة 6 - جيدا. قد تكون مغلفة زلات غطاء لخلية التصاق المحسنة. مكان 1.5 مل من وسائل الإعلام الثقافة (في هذه الحالة المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS)) في كل بئر ويوازن وسائل الإعلام في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا trypsinization وresuspend في حجم الحد الأدنى من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي المبلغ الصحيح من إعادة تعليق على توفير ~ 5x10 5 خلايا لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا بعناية في 100 غرفة حل ميكرولتر Nucleofector درجة الحرارة في العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع 100 ميكرولتر من الحمض النووي مع تعليق الخلية 5 ميكروغرام البلازميد ونقل العينة إلى كوفيت Nucleofector الحرص على عدم تضمين فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار البرنامج المناسب Nucleofector (وهذا قد يتطلب التجارب السابقة لإنشاء الكفاءة المثلى ترنسفكأيشن مع الحد الأدنى من الوفيات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج كفيت يحتوي على تعليق خلية / الحمض النووي في هولدر كوفيت Nucleofector والبدء في البرنامج المحدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء ، إزالة كفيت وإضافة ~ 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة ما قبل معايرتها له (مأخوذة من لوحة 6 أيضا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور إلى لوحة عينة 6 بشكل جيد مع الحجم النهائي من 1.5 مل لكل بئر. وينبغي في أي من الخلايا مطلي السكان مختلطة أو منفصلة عن الضوابط. </li></ol> أسلوب ترنسفكأيشن 2 (Qiagen Effectene ترنسفكأيشن لخطوط الخلية) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد المجمعات ترنسفكأيشن باستخدام الكاشف Effectene Qiagen بإضافة first 0.8 ميكروغرام لكل عينة DNA البلازميد الى 200 ميكروليتر EC العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6.4 كاشف محسن ميكرولتر لكل عينة ، مزيج لفترة وجيزة عبها الأنبوب ، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر Effectene كاشف لكل المزيج ، العينة عبها الأنبوب ، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذه الحضانة ، وإعداد خطوط الخلايا اثنين من الفائدة للترنسفكأيشن. غسل خلايا passaged مؤخرا (&lt;التقاء ٪ 80) مرة واحدة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة 1.5 مل مرة جديدة متوسطة النمو تحسنت ومعايرتها (في هذه الحالة لتعديل Dulbecco النسر المتوسط ​​(DMEM) ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في المجمعات ترنسفكأيشن والمحتضنة لمدة 15 دقيقة ، ونقل 1.2 مل من وسائل الإعلام إلى كل عينة. مزيج من قبل pipetting ، ونقل على الفور ~ 700 ميكرولتر من المجمعات في كل من بئرين في لوحة 6 - جيدا. إضافة قطرة قطرة ، ومزيج من قبل بلطف يحوم اللوحة. يسمح لخلايا transfect لا يقل عن 3 ساعات (قد تختلف مع نوع من الخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تعقيم تغطية زلات لوحة 6 آبار جديدة. قد تكون مغلفة زلات غطاء لخلية التصاق المحسنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن الخلايا transfected ، يغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا trysinization الحد الأدنى من خلال إضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر التربسين حل كل جيدا ، وتهييج لفترة وجيزة لوحة لمعطف تماما كل بئر ، والشفط على الفور قبالة التربسين. مرة واحدة رفعت الخلايا ، إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة ، ينبغي مطلي الخلايا في السكان إما مختلطة أو منفصلة (للضوابط) على زلات تغطية عقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح للخلايا لاستعادة لمدة 12 ساعة. </li></ol> 2. خلية الانصهار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام ثقافة من الخلايا ، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة ، فمن المستحسن لعلاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد (100 ميكروغرام / مل) إلى تثبيط تخليق البروتين. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 2 ساعة ثم يغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الصمامات عن طريق تعريضها إلى حل 50 ٪ من البولي ايثيلين جلايكول 1000 (PEG 1000) في المصل خالية DMEM ل 125 ثانية في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة حل PEG 1000 ، وإضافة 2 مل تحسنت حديثا ووسائل الإعلام معايرتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لاحتضان خلايا لمدة 18 -- 24 ساعة. </li></ol> مضان المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام والثقافة ، وغسل خلايا مرتين في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (في برنامج تلفزيوني) في كل بئر. تستنهض الهمم برفق لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا الثابتة مرتين في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء بعناية زلات من لوحة ، والفتيل قبالة PBS الزائدة. على عكس المجهر الشرائح محملة قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة (90 ٪ الجلسرين ، 100mM تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 ، DABCO 2 ٪ (1،4 - diazabicoyclo اوكتان) دابي تحتوي على (4 &#39;،6 - diamidino - 2 - phenylindole). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة متوسطة متزايدة من الشرائح ، وشارك في الختمالنسخة زلات مع طلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور هذه الخلايا عن طريق الفحص المجهري أو مبائر epifluorescence. </li></ol> 3. ممثل النتائج ويبين الشكل 2 تجربة متغايرة النوى سبيل المثال استخدام الخلايا الليفية الأولية وH1299 الرئة خلايا سرطان الخلايا غير الصغيرة. البروتين من الاهتمام في هذه التجربة (دجاج الانيميا الفيروسات VP3) يعرض في المقام الأول في هيولي توطين أنواع الخلايا الأساسية وتوطين النووية في أنواع الخلايا التي تحولت كما تصور المجهري epifluorescence. وأعرب عن هذا البروتين باعتباره إما الانصهار GFP (pEGFP - N1 النواقل ، Clontech) في الخلايا الليفية القلفة الابتدائي (الاتحاد الباكستاني) أو dsRed (dsRed - N1 النواقل ، Clontech) H1299 في الخلايا. عينات التحكم الذاتي التي تنطوي على اندماج (أعلى صفين) عرض خلايا multinucleated مع أي تغيير في أنماط توطين حالة استقرار. مثل هذه التغييرات يمكن أن يحدث خلاف ذلك نظرا لحساسية الظروف الاندماج أو تشكيل syncitia. اندماج متغايرة النوى (الصف السفلي) إثبات دخول النووية من البروتين GFP تنصهر الخلية المستمدة من الابتدائي وcolocalization مع البروتين dsRed تنصهر استجابة لإدخال المواد تتحول الخلية. المثال المعروض هو التحام متغايرة النوى نادرة نسبيا الناجمة عن الخلايا اثنين فقط ، واحدة من كل نوع ، كما يتبين من وجود كل من إشارات fluoroprotein. بالإضافة إلى الكشف عن هذه الأنواع من التحولات التوطين ، ويمكن الكشف عن النواة للنشاط مكوكية بسهولة من خلال وجود fluorophore واحد في كل من النوى. هذا النوع من تقرير واضح عند دراسة اندماج الخلية 1:1 و سيعتمد على تثبيط الترجمة. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. هو استنساخ الرسم البياني للأسلوب متغايرة النوى باستخدام الخلايا الليفية الأولية وسرطان الخلايا H1299 الخلايا غير الصغيرة ، والجين من مصلحة لإنتاج الاندماج في الإطار إلى واحد من اثنين من الجينات بروتين فلوري. ثم يتم خطوط الخلايا transfected عابر مع أي بناء ، وسمحت للتعافي. هو تشكيل المستحث متغايرة النوى عن طريق العلاج قصير مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ، يليه حضانة أخرى. أخيرا ، لوحظ تمركز شبه الخلوية من البروتين ذات الاهتمام باستخدام مختلف أشكال المجهر الفلورسنت. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تصور النواة للهيولى والاتجار مكوكية نشاط البروتين الانيميا الدجاج VP3 الفيروسات التي الانصهار متغايرة النوى. الصف العلوي : صور الممثل الخلايا H1299 الذاتي معربا عن تنصهر dsRed - VP3 الصف الأوسط :.. صور epifluorescence الممثل الأولية الخلايا الليفية القلفة (الاتحاد الباكستاني) معربا عن GFP - VP3 بعد الانصهار PEG الصف السفلي : الانصهار من الاتحاد الباكستاني متغايرة النوى وخلايا H1299. أصفر يشير colocalization من GFP وإشارات dsRed. وكان تصوير الخلايا باستخدام المجهر مضان AF6000E ايكا ايكا وبرامج التصوير.

<ol>
	<li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins.">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li><li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li><li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP/NXF1.">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li><li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus.">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li><li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+Hormone+Receptor+&#945;1+Follows+a+Cooperative+CRM1/Calreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway.">Thyroid Hormone Receptor &#945;1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li><li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization,+Apoptosis,+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex/Cyclosome+to+PML+Bodies.">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li><li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization.">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li><li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2/M+regulators+in+yeast.">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li><li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function.">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li><li>Lin, X. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RXR&#945;+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells.">RXR&#945; acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li><li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation.">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li><li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus.">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدمت بروتوكول متغايرة النوى هنا يوفر طريقة فعالة وسهلة التأويل للتوصيف السلوك الخلية توطين نوع معين ، وكذلك النواة للنشاط مكوكية. هذا الأسلوب يستفيد من حساسية التحليل مضان فضلا عن القدرة على الخلايا الحية والصور إجراء دراسات لديناميات البروتين. ويتم تكييف هذه التقنية بسهولة لكثير من أنواع مختلفة من الخلايا ، وهي قابلة لكلا التصوير الخلية الحية والثابتة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام المجهر مضان مقلوب لتصوير والتقاط يعيش الفيديو في الوقت الفاصل. على النقيض من ذلك ، يمكن استخدام الخلايا التي تقام في epifluorescence إما المجهري لتحديد حالة استقرار تعريب أو التصوير مبائر أكثر تفصيلا للتعريب ومنفصلة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching (FRAP) ، أو خسارة في مضان photobleaching (FLIP) في تحديد حركية التعريب 1. فإن إدماج fluorophores بديل في البروتوكول يسمح للتجارب التفاعل البروتين مثل مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) التي ستجرى في الحفلة 2. ران مثبطات مختلفة من الاتجار الخلوية مثل B أو الغالبة leptomycin السلبية يمكن استخدامها لإقامة بنيات GTPase الاعتماد على استيراد معين أو مسارات تصدير 5،6،9. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التجارب التي تنطوي على بعض النشاط في رحلات مكوكية ، لا بد من توخي الحذر لتجنب آثار التعريب بسبب توليف البروتين الجديد. في هذه الحالات ، يجب استخدام مثبطات الترجمة أو نقطة زمنية محدودة. ومع ذلك ، نظرا لتثبيط التحف متعدية يبقى الاحتمال. ومعظم المطلوب اندماج الخلية التي تحتوي على واحدة من كل نوع من الخلايا لتفسير واضح للتوطين مكوكية والسلوك. قد الأمثل لعدد الخلايا وشروط الاندماج (توقيت وتركيز) قد يكون ضروريا لتعزيز هذا الانصهار 01:01 مواتية الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن المهم أن نلاحظ أن الاستفادة المثلى من خطوات معينة في البروتوكول سوف يكون من الضروري تبعا لأنواع معينة تستخدم الخلية. قد الجوانب في الإجراء التجريبي مثل كفاءة الانصهار ، ترنسفكأيشن الكفاءة ، وقدرتها على البقاء بعد انصهار تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الخلايا. على وجه الخصوص ، يمكن أن أنواع الخلايا الأولية أن يكون تحديا لإدارة بسبب الظروف المعقدة والثقافة ترنسفكأيشن الكفاءة المنخفضة. ويمكن استخدام تقنيات مثل الجهاز Nucleofector Lonza سماح للتجهيز السريع للخلايا ، وكذلك الكفاءات ترنسفكأيشن زيادة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، وأساليب electroporation تسمح لسهولة نقل الخلايا في التعليق على الخطوات التي تتبع الانصهار. </li></ul>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3023602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified Eagle&#x2019;s medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH30243FS</td>
<td>High glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FisherChemical</td>
<td>O4042-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D9542-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyclone Serum (fetal bovine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH3008803HI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Falcon 6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>528875-25GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DABCO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2522-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector HDF kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>VPD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

heterokaryon technique for analysis of cell type-specific localization

ويتم تنظيم عدد كبير من البروتينات عن طريق الاتجار أو التحت خلوية nucleocytolasmic مكوكية. هذه البروتينات عرض مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية النووية بما في ذلك استيراد / تصدير RNA والبروتين ، وتنظيم النسخي ، وموت الخلايا المبرمج. ومن المثير للاهتمام ، بما في ذلك إعادة تنظيم الخلوية الرئيسية انقسام الخلايا ، والتمايز والتحول ، وغالبا ما تنطوي على مثل هذه الأنشطة 3،4،8،10. يمكن للدراسة مفصلة لهذه البروتينات وآلياتها التنظيمية ذات الصلة كما يمكن أن يكون تحديا لتحفيز هذه التغييرات يمكن توطين بعيد المنال ، والحركات نفسها أن تكون دينامية للغاية ويصعب تتبع. الدراسات التي تنطوي على oncogenesis الخلوية ، على سبيل المثال ، الاستمرار في الاستفادة من مسارات التفاهم والأنشطة التي تختلف البروتين بين الخلايا الطبيعية والخلايا الأولية تحولت 6،7،11،12. كما تظهر العديد من البروتينات التعريب غيرت خلال التحول أو نتيجة للتحول ، وأساليب تتسم بكفاءة هذه البروتينات ، والمسارات التي تشارك فيها موقف لتحسين فهم oncogenesis ومجالات جديدة تفتح لمكافحة المخدرات والاستهداف. هنا نقدم طريقة لتحليل البروتينات والاتجار في رحلات مكوكية بين نشاط خلايا الثدييات الأولية وتحويلها. هذا الأسلوب يجمع بين جيل من اندماج متغايرة النوى مع مضان المجهري لتوفير بروتوكول مرنة يمكن استخدامها للكشف عن البروتين تعريب وثابتة للدولة أو حيوية. كما هو مبين في الشكل 1 ، transfected عابر نوعين خلية منفصلة مع ثوابت بلازميد يحمل جينات fluoroprotein تعلق على الجينات في المصالح. بعد التعبير ، وتنصهر في الخلايا باستخدام مادة البولي ايثيلين جلايكول ، ويجوز عندئذ تعريب البروتين يمكن تصوير باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. بروتوكول المقدمة هنا هو النهج الأساسي الذي يمكن أن تضاف التقنيات المتخصصة.

Watch this Scientific Journal Video about Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization at JoVE.com

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

يوصف أسلوب مرن وفعال للتوصيف توطين الخلية البروتين من نوع معين والنواة للهيولى مكوكية. هذا النهج يستخدم متغايرة النوى البروتينات الانصهار fluorescently المسمى لتعريب صورة بعد انصهار بروتين الخلية. بروتوكول غير قابلة للتعريب والمطرد للدولة أو تحديدات أكثر ديناميكية تقوم على تصوير الخلايا الحية.

متغايرة النوى وتقنيات لتحليل نوع من الترجمة الخاصة الخليوي

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

heterokaryon-technique-for-analysis-of-cell-type-specific-localization

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Views.  Worcester Polytechnic Institute- WPI. يوصف أسلوب مرن وفعال للتوصيف توطين الخلية البروتين من نوع معين والنواة للهيولى مكوكية. هذا النهج يستخدم متغايرة النوى البروتينات الانصهار fluorescently المسمى لتعريب صورة بعد انصهار بروتين الخلية. بروتوكول غير قابلة للتعريب والمطرد للدولة أو تحديدات أكثر ديناميكية ...

Video: Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

تقنيات ميكرومانيبوليشن يسمح تحليل الديناميات Morphogenetic ودوران للمنظمين سيتوسكيليتال

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for generation of transgenics for in vivo imaging. These unique capabilities make the zebrafish an ideal platform to study ocular lens development and physiology. Our recent findings that an Aquaporin-0, Aqp0a, is required for stability of the anterior lens suture, as well as for the shift of the lens nucleus to the lens center with age led us to develop tools especially suited to analyzing the properties of zebrafish lenses. Here we outline detailed methods for lens dissection that can be applied to both larval and adult lenses, to prepare them for histological analysis, immunohistochemistry and imaging. We focus on analysis of lens suture integrity and cortical cell morphology and compare data generated from dissected lenses with data obtained from in vivo imaging of lens morphology made possible by a novel transgenic zebrafish line with a genetically encoded fluorescent marker. Analysis of dissected lenses perpendicular to their optical axis allows quantification of the relative position of the lens nucleus along the anterior-posterior axis. Movement of the lens nucleus from an initial anterior position to the center is required for normal lens optics in adult zebrafish. Thus, a quantitative measure of lens nuclear position directly correlates with its optical properties.

These protocols were developed to analyze cortical lens morphology, structural integrity of the zebrafish lens sutures in fixed and live lenses and to measure the position of the zebrafish lens nucleus along the anterior-posterior axis.

تقييم التعريب الخاص بنواه عدسه Zebrafish والنزاهة التكوينية

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

تحديد سمات تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية في كبد الماوس

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...