وقد تم تمويل البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R15GM094770.

<html> 1. عزل مستعمرة والتثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 300 المستعمرات على وسط آغار للمرة أشارت (مستعمرة معزولة ينبغي 1-2 مم في القطر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستعمرة (حتى الوجه) والمتوسطة الكامنة باستخدام ملعقة الضيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان عدة قطرات من 2 ٪ آغار 42 درجة مئوية على شريحة المجهر باستخدام 1 مل pipetman طرف ومستعمرة على الفور مكان على وجه آغار حتى قبل أن يتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان عدة قطرات من 2 ٪ آغار 42 درجة مئوية على مستعمرة والسماح ليصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتداء قفازات لجميع الخطوات خلال الفترة المتبقية من هذا البروتوكول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم كتلة مع شفرة حلاقة ووضعها في قارورة سعة 3،5 المسمار الحد الأقصى البورسليكات بارافورمالدهيد تحتوي على 2 ٪ / 2 ٪ تثبيتي غلوتارالدهيد لمدة 7 أيام في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. يغسل والمعاملة الأزميوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حوالي 1 أسبوع ، وغسل كتل أغار على الجليد تحت غطاء الدخان الكيميائية التي تفرخ مرتين لمدة 15 دقيقة مع ما يكفي من الصوديوم كاكوديلات 0.15M (7.2 درجة الحموضة) لتغطية كامل مستعمرة (حوالي 1،5 مل) ثم مرتين لمدة 5 دقائق مع نفس الحجم من العازلة OS 1X (100 ملي KH 2 PO 4 10 ملي MgCl 2 ، ودرجة الحموضة 6.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة نفس الحجم من أوسو 1 4 ٪ [2 مل أوسو 4 (2 ٪) + 2 مل 2X OS مخزن] لقوارير (على الجليد) لتغطية كتل آغار تحت غطاء الدخان الكيميائي لمدة 1 ساعة ثم يغسل مرتين مع نفس المبلغ من العازلة OS 1X لمدة 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك قنينة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في المخزن المؤقت OS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التخلص من جميع تثبيتي ، ويغسل في هذه الخطوة على أنها نفايات خطرة. وكانت تحتوي على شطف جميع ماصات أوسو 4 3X مع الزيت النباتي. </li></ol> 3. غسل وتجفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل القطع الصباحية أغار مرتين المقبل على الجليد مع نفس الحجم على النحو الوارد أعلاه من الماء البارد لمدة 10 دقيقة كل باستخدام ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بالتتابع مع نفس الحجم من 25 ٪ و 50 ٪ و 75 ٪ ، 95 ٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة كل تليها 2 يغسل مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 10 دقيقة. ترك المبيت في 4 درجات مئوية في الإيثانول بنسبة 100 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التخلص من جميع يغسل في هذه الخطوة على أنها نفايات خطرة. </li></ol> 4. Spurr في التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي (في أقرب وقت ممكن) تزن الحلول التالية (EM العلوم) في كوب من البلاستيك القابل للتصرف تحت غطاء الدخان للتحضير كاشف Spurr ل. بالنسبة لجميع الأعمال اللاحقة باستخدام هذا الكاشف ، الاستمرار في استخدام غطاء الدخان. (ERL 4221 محلول 5 جرام) (4 حل DER 736 غراما) (NSA حل 13 غراما) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج هذه الحلول (ببطء) لمدة 20 دقيقة في غطاء محرك السيارة باستخدام بقضيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DMAE حل 0،15 غراما ويقلب 20 دقيقة على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديغا الخليط لمدة 1-2 ساعات أعلاه في غطاء محرك السيارة. </li></ol> 5. Spurr في التسلل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم Spurr لغسل كتل آغار 5 مرات مع نفس الحجم على النحو الوارد أعلاه 100 ٪ غرفة الايثانول مؤقت لمدة 10 دقيقة لكل منهما. بعد غسل الايثانول مشاركة إزالة الإيثانول باستخدام ماصة باستير بحيث يغطي الإيثانول المتبقية مجرد كتل آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يقرب من مبلغ مساو من كاشف لSpurr (حوالي 0،5 مل) وتدوير القوارير على عجلة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم السماح للوقوف لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة إزالة حل به تماما ماصة باستور ، إضافة إلى تغطية Spurr كتلة آغار (حوالي 1،5 مل) ، وتناوب على عجلة قوارير لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والسماح للوقوف لمدة 30 دقيقة. وكرر استبدال Spurr ، والتناوب ، وحضانة 3 مرات أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة النهائي ، وإزالة كاشف Spurr وإضافة جديدة لتغطية Spurr القطع. السماح للكتل آغار لتصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال لSpurr وتناوب بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الصباح ، واستبدال Spurr مغادرة الدورية حتى اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان صباح اليوم التالي Spurr في قوالب السيليكون مرقمة (فيشر العلمية) فقط لتغطية الجزء السفلي من قوالب ثم إضافة إلى كتل آغار قوالب. في احتضان 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4 ساعات ، وأعلى قبالة العفن ، مع أكثر من Spurr واحتضان عند 60 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان بعد إزالة الكتل من قوالب الكتل لا تزال مرنة قليلا ، والعودة إلى القوالب واحتضان إضافي 2 أيام </li></ol> 6. Sectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكان يستخدم مشراح Ultracut ايكا S لقطع المقاطع μ 0.5 سميكة لالمجهر الضوئي و 0.1 μ المقاطع رقيقة لEM الإرسال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهري للضوء ، كما تم خفض أقسام ، وضعوا على قطرة درهم 2 O ، والمجففة على حرارة 52 درجة مئوية كتلة. وكانت ملطخة ثم المقاطع المجففة مع انخفاض 1.0 ٪ طولويدين الزرقاء ، 1 ٪ البورات الصوديوم ل15/05 ثانية. بعد التلوين ، وغسلها فورا المقاطع تحت تيار من الماء ، والمجففة ، وغطت وسائل الاعلام في تركيب (KPL) ، وزلة تغطية مختومة على العينة. </li></ol>&gt; 7. ممثل النتائج : وقد جرى استعراض واسع النطاق على أهمية تشكيل لقياس النمط في الخميرة وغيرها من الكائنات الحية الدقيقة في السابق 1. وتجدر الإشارة بوجه خاص هو زيادة وظائف للمستعمرات الجرثومية المنظمة النسبية للمجتمعات غير منظم. وصف الأسلوب هو تعديل لطريقة لدمج أكبر المستعمرات المتخصصة 2 ، ولقد تم نشر وصفا موجزا للتعديلات لدينا 3. مثال على صورة مجهرية ضوء مقطع من خلال مركز مستعمرة S. البرية ويرد خميرة مستعمرة الخميرة في الشكل 1. زقاق ، الخيطان الكاذبة والخميرة بيضوي الشكل يمكن تمييزها بسهولة ، ومنطقة مستعمرة غزو آغار وراء ذلك هو أيضا واضح. ويرد مثال لصورة مجهرية الإلكترون من سلالة من الخميرة مختبر (W303 الخلفية) في الشكل 2. كانت الصورة من منطقة المستعمرة تحتوي على وتيرة عالية من الخلايا sporulated. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. المجهري ضوء مستعمرة الخميرة البرية. تم عزل هذه الخميرة (YPS133) مؤخرا من الإفرازات الشجرة 4. وقد حضنت المستعمرة لمدة 6 أيام في المتوسط ​​5 YNA قبل sectioning. السهام تشير ممثل فتح زقاق والسهام تملأ تشير ممثل الخلايا الخضرية بيضوي الشكل ، السهام تملأ تشير سلاسل من الخلايا ممدود (الخيطان الكاذبة) ، وزقاق. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الكترون المجهري مختبر سلالة الخميرة. وقد حضنت مستعمرة SH1020 (W303 الخلفية) لمدة 6 أيام في المتوسط ​​قبل YNA sectioning 3. الصورة تظهر منطقة المقطع مع ارتفاع وتيرة زقاق. سهم يشير إلى بنية ثنائية الطبقة الجدار بوغ. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الكمي لتوزيع الخلايا في مستعمرات sporulated : أ) تم تركيب شبكة تحتوي على 15 المستطيلات المجاورة مكدسة جنبا الى جنب مع الطويلة في المنطقة الوسطى من صورة مقطع مستعمرة. يتم تحجيم الشبكة ، مع الحفاظ على نسب المستمر ، لتغطي فقط الجزء العلوي والسفلي من مستعمرة. (B &amp; C) ويتم تحديد جزء من الخلايا في كل مستطيل sporulated النسبي لمجموع الخلايا في هذا المستطيل عن طريق التفتيش البصري للصور في الفترة من 4 ايام القديمة (B) و 8 ايام المستعمرات القديمة (C). على سبيل المثال ، مستطيل في الجزء العلوي من مستعمرة (المسمى &quot;1&quot;) يتوافق مع الجانب الأيسر من الرسم البياني. ويبين متوسط ​​4 المستعمرات ، وأشرطة الخطأ عرض الأمراض المنقولة جنسيا. خطأ.

<ol>
	<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+symmetries:+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response.">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li><li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+within+a+community:+benefit+to+yeast+long-term+survival.">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li><li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significances+of+bacterial+colony+patterns.">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li><li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li><li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li><li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization.">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li><li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies.">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li><li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics.">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li><li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies.">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li><li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة عرض يكشف عن الهياكل الداخلية للمستعمرات. لأن الطريقة فعالة في تحديد أنماط من أنواع الخلايا في مجموعة س. سلالات خميرة مع morphologies مستعمرة مختلفة ، وأيضا في الأنواع متناقض S. ذات الصلة 5 ، الأسلوب ومن المرجح أيضا أن تعمل على نطاق واسع من الفطريات والك?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Osmium tetroxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 19152</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone embedding molds</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC 9975029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cycloaliphatic epoxide resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 15004</td>
<td>ERL 4221</td>
</tr>
<tr>
<td>Epoxy resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 13000</td>
<td>DER 736</td>
</tr>
<tr>
<td>Nonenyl Succinic Anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 19050</td>
<td>NSA</td>
</tr>
<tr>
<td>2-Dimethyl aminoethanol	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 13300</td>
<td>DMAE</td>
</tr>
<tr>
<td>Mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotating wheel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>Pelco 1055</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>Ultracut S</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

yeast colony embedding method

الزخرفة من أنواع مختلفة من الخلايا في الأجنة هي الآلية الرئيسية في عملية التنمية metazoan. مجتمعات الكائنات الدقيقة ، مثل المستعمرات والأغشية الحيوية أيضا عرض نماذج من أنواع الخلايا. على سبيل المثال ، في الخميرة س. البيرة ، لا الخلايا والخلايا sporulated الكاذبة موزعة بشكل متجانس في المستعمرات. لا تزال على أهمية وظيفية من الزخرفة والآليات الجزيئية التي تكمن وراء هذه الأنماط غير مفهومة. أحد التحديات فيما يتعلق بالتحقيق في أنماط من أنواع الخلايا في مستعمرات الفطرية هو أنه على عكس الأنسجة metazoan ، ونسبيا في مستعمرات الخلايا ضعيفة المرفقة مع بعضها البعض. بصفة خاصة ، مستعمرات فطرية لا تحتوي على نفس المستوى واسعة من المصفوفة خارج الخلية الموجودة في معظم الأنسجة. نحن هنا التقرير على طريقة لدمج وsectioning مستعمرات الخميرة التي تكشف عن أنماط الداخلية من أنواع الخلايا في هذه المستعمرات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحضير المقاطع سميكة (0.5 μ) مفيدة للفحص المجهري والمقاطع الخفيفة رقيقة (0،1 μ) مناسبة لانتقال المجهر الإلكتروني. ويمكن بسهولة زقاق الكاذبة خلايا يمكن تمييزها عن خلايا الخميرة بيضوي الشكل بواسطة المجهر الضوئي ، في حين أن بنية الداخلية لهذه الخلايا التي يمكن تصور EM. يستند هذا الأسلوب على المستعمرات المحيطة بها مع آغار ، تسلل لهم Spurr المتوسطة ، ثم sectioning. المستعمرات التي يبلغ قطرها في حدود 1-2 مم هي مناسبة لهذا البروتوكول. بالإضافة إلى الرؤية والداخلية من المستعمرات ، وطريقة تسمح برؤية منطقة مستعمرة أن يغزو آغار الكامنة.

Watch this Scientific Journal Video about Yeast Colony Embedding Method at JoVE.com

Yeast Colony Embedding Method

وهناك طريقة لتضمين مستعمرات الخميرة السماح لsectioning المجهر الضوئي والإلكترون. هذا البروتوكول يسمح بتحديد توزيع الخلايا والخلايا sporulated الكاذبة داخل المستعمرات توفير أداة جديدة لفهم تنظيم أنواع الخلايا داخل المجتمع الفطرية.

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Views.  University of Missouri - Kansas City. وهناك طريقة لتضمين مستعمرات الخميرة السماح لsectioning المجهر الضوئي والإلكترون. هذا البروتوكول يسمح بتحديد توزيع الخلايا والخلايا sporulated الكاذبة داخل المستعمرات توفير أداة جديدة لفهم تنظيم أنواع الخلايا داخل المجتمع الفطرية.

Video: Yeast Colony Embedding Method

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

والفحص الكمية للأنسولين ، معربا عن الأسلاف لتشكيل مستعمرة

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

تشكيل مستعمرة الفحص لينة آجار

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...