Forschung wurde durch die NIH 1R15GM094770 finanziert.

1. Colony Isolierung und Fixierung <ol><li> Inkubieren 300 Kolonien auf Agar-Medium für die angegebene Zeit (eine isolierte Kolonie sollte 1-2 mm im Durchmesser). </li><li> Entfernen Kolonie (face up) und die zugrunde liegenden Medium mit einem schmalen Spachtel. </li><li> Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf einem Objektträger mit 1 mL Pipetman Spitze und sofort Platz Kolonie auf Agar Gesicht, bevor es erstarrt. </li><li> Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf Kolonie und damit zu verfestigen. </li><li> Tragen Sie Handschuhe für alle Schritte für den Rest dieses Protokolls </li><li> Trimmblock mit Rasierklinge und legen Sie sie in einem 3,5 ml Borosilikatglas Schraubverschluss Fläschchen mit 2% Paraformaldehyd / 2% Glutaraldehyd Fixativ für 7 Tage bei 4 ° C. </li></ol> 2. Wäscht und Osmium-Behandlung <ol><li> Nach ca. 1 Woche, waschen Agarblöcken auf Eis unter Laborabzug durch Inkubation zweimal für 15 Minuten mit genügend 0,15 Natriumcacodylat (pH 7,2), um vollständig zu bedecken die Kolonie (ca. 1,5 mL), dann noch zweimal für 5 Minuten mit dem gleichen Volumen 1X OS-Puffer (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0). </li><li> Fügen Sie das gleiche Volumen von 1% OsO 4 [2 mL OsO 4 (2%) + 2 mL 2x OS Buffer], um Fläschchen (auf Eis) auf die Agar-Blöcke unter Laborabzug für 1 Stunde decken dann zweimal waschen mit der gleichen Menge 1X OS-Puffer für jeweils 10 Minuten. </li><li> Lassen Sie Vials über Nacht bei 4 ° C in 1X OS-Puffer. </li><li> Fixativ und alle Wäschen in diesem Schritt sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. Alle Pipetten mit OsO 4 gespült 3X mit Pflanzenöl. </li></ol> 3. Waschen und Dehydration <ol><li> Am nächsten Morgen waschen Agarblöcken zweimal auf dem Eis mit dem gleichen Volumen wie oben mit kaltem Wasser für jeweils 10 Minuten mit Pasteurpipette. </li><li> Wash nacheinander mit dem gleichen Volumen von 25%, 50%, 75%, 95% Ethanol für jeweils 10 Minuten um 2 Waschgänge mit 100% Ethanol für 10 Minuten. Lassen Sie über Nacht bei 4 ° C in 100% Ethanol. </li><li> Alle Wäschen in diesem Schritt sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. </li></ol> 4. Spurr der Vorbereitung <ol><li> Am nächsten Morgen (so früh wie möglich) wiegen die folgenden Lösungen (EM Sciences) in einen Einweg-Plastikbecher unter einer Abzugshaube zu Spurr-Reagenz vorbereiten. Für alle weiteren Arbeiten mit diesem Reagens, weiterhin einen Abzug verwenden. (ERL 4221-Lösung 5 Gramm) (DER 736-Lösung 4 Gramm) (NSA Lösung 13 Gramm) </li><li> Mischung dieser Lösungen (langsam) für 20 Minuten in der Kapuze mit einem Rührstab </li><li> Add DMAE-Lösung 0,15 Gramm und rühren 20 Minuten wie oben. </li><li> Degas obigen Mischung für 1-2 Stunden in der Kapuze. </li></ol> 5. Spurr die Infiltration <ol><li> Sobald Spurr ist gemacht waschen Agarblöcken 5 mal mit gleichem Volumen wie oben von 100% Raumtemp Ethanol für jeweils 10 Minuten. Nach dem letzten Ethanol waschen entfernen Sie den Ethanol mit einer Pasteurpipette, so dass die restliche Ethanol deckt gerade die Agar-Blöcke. </li><li> Fügen Sie etwa die gleiche Menge Spurr-Reagenz (ca. 0,5 mL) und drehen am Rad Fläschchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur und dann lassen Sie es 30 Minuten stehen. Nach 30 Minuten entfernen Sie die Lösung vollständig mit einer Pasteurpipette, fügen Spurr auf Agar-Block (ca. 1,5 ml) Deckel ist, drehen Fläschchen auf Rad für 15 Minuten bei Raumtemperatur und lassen Sie es 30 Minuten stehen. Wiederholen Sie die Spurr Nachfolger, Rotation und Inkubation 3 weitere Male. </li><li> Nach der letzten 30 Minuten, entfernen Spurr-Reagenz und fügen frische Spurr ist, um die Blöcke zu decken. Lassen Sie die Agar-Blöcke, um bei Raumtemperatur für 4 Stunden stehen. </li><li> Ersetzen Sie die Spurr und drehen über Nacht. </li><li> Am Morgen ersetzen Spurr und verlassen rotierenden bis zum nächsten Tag. </li><li> Am nächsten Morgen statt Spurr ist in nummerierte Silikonformen (Fisher Scientific) nur auf den Boden der Formen bedecken dann add Agarblöcken die Formen. Inkubation bei 60 ° C für 4 Stunden </li><li> Nach 4 Std., runden die Formen, mit mehr Spurr und Inkubieren bei 60 ° C über Nacht. </li><li> Wenn nach dem Entfernen der Blöcke aus den Formen der Blöcke noch leicht flexibel, um die Formen wieder und inkubieren eine zusätzliche 2 Tage </li></ol> 6. Sectioning <ol><li> Ein Leica Ultracut S Mikrotom wurde auf 0,5 μ dicke Schnitte für die Lichtmikroskopie und 0,1 μ dünne Schnitte für die Übertragung EM schneiden. </li><li> Für die Lichtmikroskopie, wie Abschnitte geschnitten wurden, wurden sie auf einen Rückgang von dH 2 O gelegt und getrocknet auf einer 52 ° C Wärme zu blockieren. Getrocknete Schnitte wurden dann mit einem Rückgang um 1,0% Toluidinblau, 1% Sodium Borate für 5-15 Sekunden gefärbt. Nach der Färbung wurden die Schnitte sofort unter einem Strom von Wasser gewaschen, getrocknet, bedeckt in Eindeckmittel (KPL) und ein Deckglas über die Probe versiegelt. </li></ol> Die breite Relevanz der Messung von Musterbildung in der Hefe und anderen Mikroorganismen wurden bisher 1 Bewertung. Besonders hervorzuheben ist die verbesserte Funktionalität der organisierten Mikrobenkolonien relativ unorganisiert Gemeinden. Das beschriebene Verfahren ist eine Abwandlung einer Methode zur Einbettung von größeren spezialisierten Kolonien 2 und eine kurze Beschreibung unserer Modifikationen wurde 3 veröffentlicht. Ein Beispiel für eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Schnitts durch das Zentrum einer Kolonie von wilden S. cerevisiae Hefe Kolonie ist in Abbildung 1 dargestellt. Asci, Pseudohyphen und eiförmig Hefe sind leicht zu unterscheiden, und die Region der Kolonie Eindringen in die zugrunde liegenden Agar ist auch offensichtlich. Ein Beispiel für eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Labor-Hefestamm (W303 Hintergrund) ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Bild ist aus einer Region der Kolonie, die eine hohe Frequenz von sporenbildenden Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Lichtmikroskopie einer wilden Hefe Kolonie. Diese Hefe (YPS133) wurde vor kurzem von Baum Exsudate 4 isolierte. Die Kolonie wurde für 6 Tage auf YNA Medium 5 vor dem Schneiden inkubiert. Offene Pfeile zeigen repräsentative Asci, gefüllt Pfeile zeigen repräsentative eiförmig vegetativen Zellen, gefüllt Pfeilspitzen zeigen Ketten von langgestreckten Zellen (Pseudohyphen) und Asci. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Elektronenmikroskopie eines Labor-Hefestamm. Die Kolonie der SH1020 (W303 Hintergrund) war für 6 Tage auf YNA Medium vor dem Schneiden 3 inkubiert. Bild zeigt einen Bereich des Abschnitts mit einer hohen Frequenz von Asci. Ein Pfeil zeigt die bi-Schicht-Struktur der Spore Wand. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Die Quantifizierung der Verteilung der sporenbildenden Zellen in Kolonien: A) ein Raster mit 15 angrenzenden Rechtecke entlang ihrer Längsseite gestapelt wird auf den zentralen Bereich eines Bildes von einer Kolonie Abschnitt überlagert. Das Gitter wird so skaliert, ohne dabei die Proportionen konstant, nur deckt den oberen und unteren Rand der Kolonie. (B &amp; C) Der Anteil der sporenbildenden Zellen in jedes Rechteck bezogen auf das Gesamtgewicht Zellen in diesem Rechteck wird durch visuelle Inspektion von Bildern aus 4-Tage alte (B) und 8-Tage-alten (C) Kolonien bestimmt. Zum Beispiel entspricht das Rechteck am oberen Rand der Kolonie (mit &quot;1&quot;) auf der linken Seite des Diagramms. Mittel von 4 Kolonien gezeigt; die Fehlerbalken zeigen die std. Fehler.

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	<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+symmetries:+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response.">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li><li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+within+a+community:+benefit+to+yeast+long-term+survival.">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li><li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significances+of+bacterial+colony+patterns.">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li><li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li><li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li><li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization.">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li><li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies.">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li><li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics.">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li><li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies.">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li><li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li></ol>

Die vorgestellte Methode zeigt, die inneren Strukturen der Kolonien. Da die Methode ist effektiv bei der Bestimmung Muster von Zelltypen in einer Reihe von S. cerevisiae-Stämme mit unterschiedlichen Morphologien Kolonie, und auch in einer verwandten Spezies S. paradoxus 5, ist das Verfahren auch am ehesten auf eine breite Palette von Pilzen und anderen Mikroorganismen zu arbeiten. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Methode ist, um sicherzustellen, dass die ge...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Osmium tetroxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 19152</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone embedding molds</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>NC 9975029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cycloaliphatic epoxide resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 15004</td>
<td>ERL 4221</td>
</tr>
<tr>
<td>Epoxy resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 13000</td>
<td>DER 736</td>
</tr>
<tr>
<td>Nonenyl Succinic Anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 19050</td>
<td>NSA</td>
</tr>
<tr>
<td>2-Dimethyl aminoethanol	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>RT 13300</td>
<td>DMAE</td>
</tr>
<tr>
<td>Mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotating wheel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>Pelco 1055</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>Ultracut S</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

yeast colony embedding method

Strukturierung von verschiedenen Zelltypen im Embryo ist ein wichtiger Mechanismus in Metazoen Entwicklung. Gemeinschaften von Mikroorganismen, wie Kolonien und Biofilmen zeigen auch Muster von Zelltypen. Zum Beispiel in der Hefe S. cerevisiae, sind sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen nicht gleichmäßig in Kolonien verteilt. Die funktionelle Bedeutung der Strukturierung und der molekularen Mechanismen, die diese Muster zugrunde liegen, sind noch weitgehend unverstanden. Eine Herausforderung in Bezug auf die Untersuchung Muster von Zelltypen in Pilzkolonien ist, dass im Gegensatz zu vielzelligen Gewebe, Zellen in Kolonien relativ schwach miteinander verbunden. Insbesondere sollten Sie Pilzkolonien nicht die gleichen umfangreichen Ebene der extrazellulären Matrix in den meisten Geweben gefunden. Hier berichten wir über eine Methode zum Einbetten und Schneiden Hefekolonien, dass das Innere Muster von Zelltypen zeigt in diesen Kolonien. Die Methode kann verwendet werden, um dicke Abschnitte vorbereiten (0,5 μ) sinnvoll für die Lichtmikroskopie und dünne Schnitte (0,1 μ) für Transmissions-Elektronenmikroskopie werden. Asci und pseudohyphal Zellen können leicht von eiförmige Hefezellen mittels Lichtmikroskopie unterschieden werden, während die innere Struktur dieser Zellen können mit Hilfe von EM. Die Methode basiert auf umliegenden Kolonien mit Agar-Agar, infiltrieren sie mit Spurr das Medium, und dann Schnitte basieren. Kolonien mit einem Durchmesser im Bereich von 1-2 mm eignen sich für dieses Protokoll. Zusätzlich zu visualisieren das Innere der Kolonien, erlaubt das Verfahren die Visualisierung der Region der Kolonie, dass die zugrunde liegenden Agar eindringt.

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Yeast Colony Embedding Method

Eine Methode zur Einbettung von Hefe-Kolonien ermöglicht Schnitte für Licht-und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll erlaubt die Bestimmung der Verteilung der sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen innerhalb Kolonien bietet ein neues Werkzeug zum Verständnis der Organisation von Zelltypen innerhalb eines Pilz-Gemeinschaft.

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Aufrufe.  University of Missouri - Kansas City. Eine Methode zur Einbettung von Hefe-Kolonien ermöglicht Schnitte für Licht-und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll erlaubt die Bestimmung der Verteilung der sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen innerhalb Kolonien bietet ein neues Werkzeug zum Verständnis der Organisation von Zelltypen innerhalb eines Pilz-Gemeinschaft.

Serie: Yeast Colony Embedding Method

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Forschung

Biologie

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...