نود أن نشكر جوناثان كوبر مختبر في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان للحصول على إذن لاستخدام ناظم البرد بهم. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة كيك WM. BM هو زميل غوردون مور وبيتي من علوم الحياة مؤسسة البحوث. ونحن ممتنون لGottschling دانيال لبروتوكول قسمة له تثبيت معنا.

1. تصحيح المجتمعات الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمية المجتمعات المحلية على الخميرة من غشاء (مثل ميليبور MF غشاء التصفية؛ 2A الشكل). هذا البروتوكول يتوافق مع المجتمع نموذجية من أقل من 8 خلايا 2X10 على فلتر غشاء 6 ملم القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة من الورق 541 WHATMAN مرشح لتغطية الجزء السفلي من وقطره 1 سم جيدا (الشكل 2B). وسوف تستخدم هذه الورقة WHATMAN باعتبارها الناقل لنقل المجتمع في مراحل لاحقة. إضافة 1 مل الميثانول بنسبة 100٪ إلى البئر، وترك البئر في -20 درجة مئوية لدرجة الحرارة للتوازن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع السائل N 2 في ديوار. تجميد المجتمع في النيتروجين السائل عن طريق غمس المجتمع لما لا يقل عن 15 ثانية في السائل N 2 باستخدام منتاش (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المجتمع المجمدة إلى البئر من الميثانول ° -20 درجة (الشكل 2D). ضمان أن يتم الاحتفاظ المجتمع الأفقي عندما غمر في الميثانول.انتظر 20 دقيقة. غشاء MF تصفية يبدأ في التفكك في الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المجتمع باستخدام الناقل WHATMAN 541 ورق الترشيح من الميثانول إلى جانب طبق بيتري الباردة أبقى في -20 درجة مئوية لمدة تبخر الميثانول (2E الشكل). عند نقل، والحفاظ على المجتمع على رأس الناقل WHATMAN تصفية واستخلاص قطرات بعيدا إضافية من الميثانول باستخدام قطعة أخرى من الورق السميك WHATMAN قبل وضع في طبق بتري الباردة. وسوف يضمن هذا الوقت من التبخر يتسق عينة لعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار 4-6 ساعة حتى لتبخر الناقل WHATMAN مرشح تبدو جافة. تبخر الميثانول المتبقية غير كافية يترك التي تتعارض مع تقطيع. الإفراط في تجفيف أسباب الشقوق وتشوه في المجتمعات المحلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ عينة من الفريزر -20 درجة مئوية. قطع بعيدا WHATMAN 541 رقة الترشيح التي لا تغطيها المجتمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مستطيل مكعب الألومنيوم احباط الحاويات التي هي كبيرة بما يكفي بحيث العينة على الأقل ~ هامش مم 2 منكل جانب (الشكل 2F). وضع المجتمع على السطح السفلي من الألومنيوم احباط الحاويات؛ تغطية مباشرة مع عينة أكتوبر إلى 3 ~ 4 مم فوق ارتفاع المجتمع. إذا هامة، ويمكن تعديل اتجاه العينة في هذه الخطوة فيما يتعلق الجانبين من الحاوية. انتظر 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عينة OCT-جزءا لا يتجزأ من على لوحة معدنية على الثلج الجاف لتجميد. تخزين المجتمعات المجمدة في -20 -80 ° C أو C ° الثلاجة. </li></ol> 2. باجتزاء المجتمعات مجمدة لتصوير الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين درجة حرارة الغرفة لC ° cryosection -25 و ترك العينات في غرفة درجة الحرارة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينة الصعود إلى جبل البرد بعد تطبيق قطرة من أكتوبر على الجبل. انتشرت بشكل موحد أكتوبر على جانب عينة مع تعرض رقة الترشيح WHATMAN (قاع الإناء) بحيث أكتوبر سمك 2-3 مم. اسمحوا أكتوبر تجميد داخل غرفة ناظم البرد قبل SEctioning. ضمان هامش أكتوبر من 2-3 مم من كل جانب من العينة يساعد على الحفاظ على سلامة أقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام الجانبين من كتلة عينة أكتوبر لمحاذاة العينة. إذا لم يتم محاذاة العينة فيما يتعلق شفرة، سوف تبدأ تقطيع من ركلة ركنية أو الجانب من العينة. ضبط جبل لضمان أن نصل يقطع رأسي تماما (أو الأفقي) مواجهة كتلة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام نموذجية للمجتمعات الخميرة هي ~ 14 ميكرون سميكة. بعد قطع مقطع، استخدام شريحة المجهر الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لجمع هذا الباب، من خلال تناوله ببطء الشريحة إلى قسم قطع. سوف تذوب القسم ونقل إلى الشريحة المجهر. يمكن نقل ما يصل إلى 18 أقسام على شريحة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الشرائح في درجات الحرارة الباردة، ويفضل -20 ° C، قبل التصوير. فقدان الإشارة هو الحد الأدنى عند الاحتفاظ بها لمدة أسبوع واحد في C. ° 4 للإشارة مضان أقصى، ويتم ذلك يفضل التصوير على الفور بعد تقطيع. </li></ol>

<ol>
	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الإجراء المقدمة هنا يوفر وسيلة لتفقد البنية الداخلية للمجتمعات الخميرة. الخطوة تحديد الميثانول يجعل مستعمرة الخميرة جامدة 8 و يحافظ على سلامة المستعمرة، ومع ذلك، فإنه يتسبب أيضا 8 الانكماش التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج. نرى عادة حوالي 30٪ انكماش في ارتفاع المستعمرات الخميرة، مقارنة المستعمرات جزءا لا يتجزأ مباشرة في أكتوبر دون تحديد 9. لتجنب انكماش، وهو نهج بديلة لcryosectioning هو تضمين مباشرة المجتمعات المحلية في أكتوبر وتجميدها. يتم الاحتفاظ مضان في أسلوب يعتمد على تضمين المباشر، ولكن العيب هو أن ليست ملزمة الخلايا داخل كل قسم معا. ونتيجة لذلك، فإن بعض الخلايا على حواف الباب تعويم بعيدا، وأقسام هي أكثر عرضة للمعاناة اضطرابات في عملية تقطيع (الشكل 4). على الرغم من انه لا يركز علىإعادة، قد مشرق الميدان صور المقاطع العرضية للمجتمعات الخميرة تعطي لنا أيضا معلومات مفيدة عن حالة الخلايا داخل المجتمع 9. أم لا يتأثر ممتلكات الفائدة بمقدار الخطوة لابد من تحديد فحص على أساس كل حالة على حدة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> 100٪ الميثانول </td><td> JT بيكر </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> الأنسجة تيك أكتوبر مجمع </td><td> Andwin العلمية </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> WHATMAN الصف رقم 541 ورقة تصفية الكمية </td><td> WHATMAN </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> ميليبور-MF غشاء تصفية </td><td> ميليبور </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> ناظم البرد </td><td> لايكا </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

الميكروبات تعيش عادة في المجتمعات المحلية. ويعتقد أن التنظيم المكاني للخلايا داخل المجتمع للتأثير على بقاء وظيفة من وظائف المجتمع 1. وقد أثبتت التقنيات البصرية تقطيع، بما في ذلك الفحص المجهري متحد البؤر واثنين من الفوتون، مفيدة لمراقبة التنظيم المكاني للمجتمعات البكتيرية وarchaeal 2،3. وقد كشفت مجموعة من مبائر التصوير وباجتزاء المادية للمستعمرات الخميرة التنظيم الداخلي للخلايا 4. ومع ذلك، فقد كان باجتزاء البصرية باستخدام المجهر متحد البؤر مباشرة أو اثنين الفوتون-فقط قادرة على الوصول إلى طبقات الخلايا قليلة في عمق المستعمرات الخميرة. هذا القيد هو المرجح بسبب تشتت الضوء القوي من خلايا الخميرة 4. هنا، نقدم طريقة يعتمد على تحديد وcryosectioning للحصول على التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت داخل المجتمعات خميرة الخباز. نستخدم الميثانول وكيلا مثبتللحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا. تنقل خلالها المجتمعات الثابتة مع مجمع OCT، المجمدة، وcryosectioned في ناظم البرد. التصوير مضان من الأقسام يكشف عن التنظيم الداخلي للخلايا الفلورسنت داخل المجتمع. أمثلة من المجتمعات تتكون من سلالات الخميرة التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء تظهر إمكانات الأسلوب cryosectioning للكشف عن التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت وكذلك في التعبير الجيني داخل مستعمرات الخميرة 2،3. على الرغم من تركيزنا كان على المجتمعات خميرة الخباز، ويمكن يحتمل نفس الأسلوب يمكن تطبيقها على دراسة المجتمعات الميكروبية الأخرى.

وتظهر الصور مضان من المقاطع العرضية الرأسية للمجتمعات التي تحتوي على الخميرة الحمراء السكان تنافسية والأخضر الموسومة-6 في الشكل 3. هذه المجتمعات تتكون من سلالات بدئية اثنين من الخميرة والمنافسة على الموارد المشتركة، بما في ذلك الفضاء، إلى أنماط عمودية 7، كما تم عرضه في عمودي على المقاطع العرضية. يمكن حل القرارات وصولا الى خلية واحدة في المقاطع العرضية. الشكل 3 مقارنة المقاطع العرضية للمجتمعات تكرار الحصول عليها مع (القاع) وبدون (أعلى) التلاعب في نتائج الميثانول، وبعد البروتوكولات في الشكل 1. لcryosectioning المجتمعات الخميرة دون تحديد، ويتبع البروتوكول بدءا من الخطوة 1.8. يتم الاحتفاظ إشارة مضان في أقسام المجتمع دون تحديد، ولكن المساس بسلامة المجتمع. ونتيجة لذلك: (1) بعض الخلايا تطفو بعيدا حول حافة الباب، و (2) في العام ييELD (أي جزء من أجزاء لم تتأثر القطع الأثرية من الإجراء تقطيع) أقل مقارنة مع المجتمعات الثابتة. ويبين الشكل 4 مشرق الميدان ومضان العمودي ممثل المقاطع العرضية للمجتمع الخميرة. الخلايا على أعلى النموذج المجتمع تاج الذي يظهر متميزة عن غيرها من الخلايا التي تتميز أقوى نثر في مضان مشرق الميدان وأكثر إشراقا. هذه الأنماط تتفق مع أنماط ذكرت التمايز في مستعمرات الخميرة 4. <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. مخطط انسيابي للإجراءات نموذجية لcryosectioning المجتمعات الخميرة مع (يسار) وبدون (يمين) نتائج مباريات. <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. </sويوضح خطوات&gt; ترونج المشاركة في تحديد وتجميد المجتمعات الخميرة. (A) وتزرع المجتمعات الخميرة على رأس الأقراص ذات القطر مم 6 من MF غشاء التصفية. (B) يتم وضع قطعة من الورق 541 مرشح في WHATMAN الميثانول المحتوية جيدا لاستخدامها باعتبارها الناقل. (C) يتم تجميد المجتمعات المحلية عن طريق غمس لهم في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية عادة ~. (D) يتم تحويل المجتمعات إلى المجمدة -20 ° C جيدا من الميثانول على رأس الناقل WHATMAN التصفية. (E) بعد تحديد، يتم استخدام الناقل WHATMAN مرشح لاتخاذ المجتمعات من الميثانول ونقلها إلى طبق بارد للتبخر. (F) يتم نقل المجتمع بعد التبخر إلى حاوية الألومنيوم احباط مكعب مستطيل ومغطاة أكتوبر لتجميد النهائي للكتلة. <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. الصور مضان ممثل العمودي شريحة من مندوبlicate المجتمعات الخميرة نمت في ظل ظروف مماثلة تظهر دون (أعلى) ومع (القاع) التلاعب في نتائج الميثانول. المجتمع يتكون من اثنين من سلالات بدئية خميرة S. ذات الكلمات الدلالية مع mCherry والبروتينات الفلورية yEGFP 7. دون تحديد، ليست ملزمة الخلايا معا، وربما تطفو بعيدا أو إعادة ترتيب خلال تقطيع. الميثانول في نتائج المباريات وتبقي خلايا المجتمع معا، ولكن يسبب انكماش كما لوحظ في الفرق بين مرتفعات المجتمع (متوسط٪). <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. الممثل تظهر مشرق الميدان (أعلى) ومضان (القاع) صور العمودي شريحة من مجتمع الخميرة. المجتمع يتكون من اثنين من سلالات بدئية خميرة S. ذات الكلمات الدلالية مع البروتينات الفلورية dsRed وYFP 7.

Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

نقدم بروتوكول للتجميد وcryosectioning المجتمعات الخميرة لمراقبة أنماط من الخلايا الداخلية الفلورسنت. وتعتمد الطريقة على التلاعب في نتائج الميثانول وOCT-تضمين الحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا دون تعطيل البروتينات الفلورية داخل مجتمع ما.

Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. نقدم بروتوكول للتجميد وcryosectioning المجتمعات الخميرة لمراقبة أنماط من الخلايا الداخلية الفلورسنت. وتعتمد الطريقة على التلاعب في نتائج الميثانول وOCT-تضمين الحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا دون تعطيل البروتينات الفلورية داخل مجتمع ما.

Video: Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Demonstrated in this video are the techniques for flash freezing and sectioning embryonic brain tissue from mouse. Useful tips for using the cryostat are given, including troubleshooting methods that can be used while cutting to ensure that the resultant tissues sections are free of cracks and other distortions.

فلاش التجميد وCryosectioning E12.5 مخ الفأر

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

المجتمعات الميكروبية في الطبيعة ومختبر -- مقابلة

Biology of Microbial Communities  - Interview

بيولوجيا المجتمعات الميكروبية -- مقابلة

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

الحصول على الإسفار الوقت الفاصل بين الأفلام من الخميرة في مهدها وتحليل ديناميات وحيدة الخلية باستخدام الطعوم

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...