وقد تم تمويل هذا العمل من قبل NINDS وجمعية القلب الأميركية إلى S.Ge. تأسست أصلا هذا النهج ، والتي وضعها المؤلف في مختبر الدكتور سونغ هونغ جون في جامعة جونز هوبكنز. نود أن نشكر الدكتور سونغ هونغ جون لتوجيهاته ودعمه.

1. حقن الفيروس ويتم إنتاج عالية عيار الارتجاعي هندسيا (1 × 10 9 وحدة / مل) من قبل ترنسفكأيشن المشترك للفيروسات وناقلات VSVG HEK293T في الخلايا ، تليها تنبيذ فائق من طاف الفيروسية. عن مصادر وأساليب الإنتاج ، انظر المظاهرة إن الرب الممتازة (3). ملاحظة : يتم إيواء البالغين الشباب (4-6 أسابيع من العمر) من الإناث C57Bl / 6 الفئران (تشارلز ريفر) في ظل الظروف القياسية. متابعة كافة الإجراءات دليل المجلس القومي للبحوث من أجل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية بموجب البروتوكول التي وافقت عليها جامعة ستوني بروك IACUC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2ul ذوبان الارتجاعي المجمدة لكل حيوان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير (100 + 10 ميكروغرام الكيتامين زيلازين ميكروغرام لكل غرام من وزن الجسم) ، وجبل الحيوان على إطار التجسيمي (Steolting). إزالة الشعر على الرأس ومسح الجلد مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض الجمجمة وحفر أربعة ثقوب الحفر الضحلة باستخدام الأسنان (0.6mm مثقاب) في الإحداثيات التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> anterioposterior = -2 مم من bregma ؛ الوحشي = ± 1.6 مم ؛ بطني = 2.5 مم ؛ anterioposterior = -3 ملم من bregma ؛ الوحشي = ± 2.6 مم ؛ بطني = 3.2 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> anterioposterior = -2 مم من bregma ؛ الوحشي = ± 1.6 مم ؛ بطني = 2.5 مم ؛ anterioposterior = -3 ملم من bregma ؛ الوحشي = ± 2.6 مم ؛ بطني = 3.2 مم. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شن هاميلتون 1μl ، مسطحة وحقن حقنة غيض 0.5 الارتجاعي ميكرولتر لكل موقع بمعدل 0.25 ميكروليتر / دقيقة في التلفيف المسنن. (راجع أعلاه للحصول على إحداثيات عمق بطني). قفة 2 دقيقة بعد كل حقنة قبل أن تنسحب ببطء حقنة لمنع حويضي السوائل. بين الحقن ، وشطف السطح الخارجي لفترة وجيزة من طرف المحاقن المعقمة مع برنامج تلفزيوني والتطبيقية لإزالة آثار دماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجرح العقيمة مع مواد خياطة الجروح الجراحية (نوع P - 1 ؛ الحجم 6-0) والعودة إلى ظروف السكن الحيوانية القياسية حتى المراحل الزمنية المطلوبة بعد الحقن. </li></ol> 2. إعداد شريحة للحصول على نوعية عالية من شرائح الحاد فئران بالغة ، ونحن نستخدم حلا قطع تعديل لإعداد شريحة (أنظر أدناه). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البرد حل لقطع 0-4 درجة مئوية على الجليد وفقاعة مع 95 ٪ O 2 -5 ٪ CO 2 على الأقل 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ويروي transcardially حيوان مع حل الأوكسجين المشبع الجليد الباردة القطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بسرعة الدماغ في طبق بتري مع فلتر ورقة قبل المبللة بمحلول الاوكسيجين الباردة ، والقطع. قطع المخيخ وشريحة متزايدة على الأقل السطح الأمامي 1MM إلى إحداثيات الحقن (مرئي). الغراء في المخ في الصعود إلى منصة vibrotome وتركيبها في غرفة مليئة القطع حل القطع الباردة والاوكسيجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انفجر تحضير شرائح الإكليلية أو الأفقي (300 350μm) ونقل لهم ماصة كبيرة تحمل لاحتضان غرفة تحتوي على درجة حرارة الغرفة ACSF مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح ، محتدما بشكل مستمر ، عند درجة 32 ل30-60 دقيقة. عودة الغرفة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة التسجيل. </li></ol> 3. تجارب كهربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقلها الى غرفة شرائح تسجيل وهو perfused باستمرار مع ACSF الأوكسجين المشبع في 32 درجة مئوية -- 34 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع التحفيز الكهربائي بين القطبين التنغستن في الطبقة الجزيئية للالتلفيف المسنن باستخدام مجهر التكبير المنخفض الهدف (10X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحديد DGCS الوليد في منطقة شبه الحبيبية / الطبقة الحبيبية الخلية عن طريق التعبير عن GFP أو dTomato. يتم تنفيذ كامل الخلية العصبية على تسجيل المواليد الجدد patchclamp تحت التكبير عالية (40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم الحصول على خصائص الخلايا اطلاق سجلت عن طريق الحقن في سلسلة من التيارات الجارية تحت المشبك واسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسليم المحفزات الكهربائية بواسطة القطب التحفيز عبر المعزل التحفيز التي تسيطر عليها تسجيل البرمجيات ، وأثار التيارات بعد المشبكي في DGCS حديثي الولادة يتم تسجيلها. </li></ol> 4. تحليل البيانات ويتم تحليل سعة من الردود بعد المشبكي أثار في مراحل تنموية مختلفة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية. 5. ممثل النتائج باستخدام بروتوكول أعلاه ، GFP التعبير في التلفيف المسنن العصبية الوليد مشابهة الشكل رقم 1 هو شائع. لاحظ أن الخلايا العصبية هي تصور حديثي الولادة بسهولة والمسماة بقوة كل من التشعبات والمحاور. التعبير في المحاوير DGC رقيقة وأشواك صغيرة تعتمد على نوعية وعيار من الفيروس ، والمروج المستخدمة وطول التعبير في الجسم الحي. في أيدينا ، وخلايا الوليد والعضيات الخلوية الفرعية وعادة ما تكون وضوحا في غضون بضعة أيام بعد الحقن ، ويمكن تتبع التعبير العمود الفقري منذ المراحل الأولى للتنمية. Wثقب الخلايا العصبية التسجيلات من حديثي الولادة في مراحل زمنية مختلفة تسمح هذه الدراسة فريدة من خصائص الخلية الوليد وامكانات العمل مثلا (الشكل 2A) ، فضلا عن عملية التكامل متشابك في الدوائر العصبية الموجودة خلال نضوج (الشكل 2B). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 2 فوتون صورة مبائر من الخلايا العصبية في قسم الأطفال حديثي الولادة التلفيف المسنن الأفقي للماوس الكبار. الخلايا الخضراء هي 21dpi (أيام آخر الحقن) ، معربا عن GFP DGCS الوليد المسمى مع pUX - GFP الارتجاعي. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 أ) (ب) العمل المحتمل اطلاق خصائص DGC الوليد في 21 نقطة في البوصة). أثار ممثل التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) التي سجلت على DGC المولود في 21 نقطة في البوصة.

<ol>
	<li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis.">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li><li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain.">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تكوين الخلايا العصبية في قرن آمون المستمر للأدمغة الثدييات الكبار ويوفر نظام فريد النموذج التجريبي لدراسة التنمية والتكامل في الخلايا العصبية للدماغ ناضجة. بروتوكول المعروضة هنا يجمع العلامات فيروسات وطرق الكهربية لدراسة التكامل بين الخلايا العصبية الوليد الحبيبية المسنن في أدمغة فئران بالغة. لضمان تجاربك الناجحة ، فإننا نوصي بما يلي خلال الخطوات الحاسمة من الإجراء : لتجنب العدوى والالتهابات غير المرغوب فيها ، يجب تعقيم جميع الأدوات (عن طريق التعقيم ، أي نوع من التعقيم ، أو الايثانول 70 ٪) قبل الجراحة. استخدام برنامج تلفزيوني العقيمة لغسل رأس الإبرة حقنة قبل الحقن. للحقن الفيروس ، يجب أن تكون محمولة على الحيوانات بشكل جيد على الجهاز التجسيمي ويجب التقليل من مصادر حركة لا لزوم لها خلال الحقن. تأكد من أن الرأس هو ثابت وراسخ جيدا ، وضبط موضع أنفه من الماوس لbregma مستوى وامدا قبل حساب إحداثيات الحقن. استخراج الفيروس إلى المحقنة بسرعة للحد من التعرض لدرجة حرارة الغرفة -- الفيروسات القهقرية بشكل خاص حساس للحرارة. حقن الفيروس ببطء بمعدل أوصت للحد من الأضرار الضغط. وأوصى باستخدام حقنة ذات الرؤوس المسطحة (مقابل طرف مشطوف شيوعا) ضمان وجود عدوى موزعة بالتساوي منطقة التلفيف المسنن. قبل إعداد شرائح ، لا بد من قطع فقاعات الحل ويحتضنها ACSF مع 95 ٪ O CO 2 -5 2 ٪ على الأقل 30 دقيقة للسماح للتشبع الأكسجين إلى الحلول. وينبغي perfused الحيوانات بسرعة والمحافظة على النسيج في البرد حل الأكسجين المشبعة ، للحصول على جودة أفضل شريحة. للتسجيل ، وزيادة كثافة التحفيز تدريجيا حتى هناك استجابة بعد المشبكي. تغير موقع القطب التحفيز داخل الطبقة الجزيئية للالتلفيف المسنن عند الضرورة. وباختصار ، فإن النهج الموصى به يوفر وسيلة لاستكشاف خصائص متميزة وأدوار وظيفية ممكنة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية في المرحلة الأولى من الاندماج في الدوائر ونشطة ناضجة.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل القطع (مم) : 110 كلوريد الكولين ، بوكل 2.5 ، 1.3 KH 2 PO 4 ، 3 NaHCO 25.0 ، 0.5 CaCl 2 ، 7 MgCl 2 ، 10 الدكستروز ، 1.3 أسكوربات الصوديوم ، الصوديوم البيروفات 0.6 و 5.0 حمض kynurenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي (ACSF في مم) : 125.0 كلوريد الصوديوم ، 25.0 NaHCO 3 ، 2،5 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 1.3 KH 2 PO 4 ، 1.3 MgCl 2 ، 1.3 أسكوربات الصوديوم ، 0.6 البيروفات الصوديوم ، 10 الدكستروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الداخلية حل لكامل الخلية patchclamp (مم) : 120 غلوكونات البوتاسيوم ، 15 بوكل ، 4 MgCl 2 ، 0.1 EGTA ، HEPES 10.0 ، 4 MgATP ، 0.3 نا GTP 3 ، 7 فسفوكرياتين (7.4 درجة الحموضة ، 300 mOsm). </li></ul>

studying the integration of adult-born neurons

تكوين الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات يحدث الكبار في منطقة البطين الفرعي (SVZ) من البطين الجانبي وفي منطقة الحبيبية الفرعي (SGZ) من التلفيف المسنن لقرن آمون في جميع مراحل الحياة. وأظهرت تقارير سابقة بأن يرتبط تكوين الخلايا العصبية قرن آمون في الدماغ الكبار الذين يعانون من اضطرابات متنوعة ، بما في ذلك ، والصرع والاكتئاب ، والفصام والقلق (1). قد فك رموز عملية طبيعية وشاذة التكامل عصبون البالغين المولودين في تسليط الضوء على مسببات هذه الأمراض وأبلغ تطوير علاجات جديدة. SGZ تكوين الخلايا العصبية الكبار المرايا التنمية العصبية الجنينية وبعدها ، بما في ذلك مراحل مواصفات مصير ، والهجرة ، والتكامل متشابك ، والنضج. ومع ذلك ، الاندماج الكامل يحدث على مدى فترة طويلة 6 أسابيع. مدخلات متشابك الأولي إلى البالغين المولودين في الخلايا الحبيبية SGZ المسنن (DGCS) هو GABAergic ، تليها مدخلات glutamatergic في 14 يوما (2). العوامل المحددة التي تنظم تشكيل الدائرة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية في التلفيف المسنن غير معروف حاليا. مختبرنا يستخدم النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ناقلات فيروسات استنادا إلى فيروس اللوكيميا مولوني الفئران لتوصيل الجينات البروتينات الفلورية والتنظيمية المفترضة لهذه الخلايا المتكاثرة. هذا الأسلوب يوفر الفيروسية خصوصية عالية ودقة لتحليل تاريخ ميلاد الخلية ، والنسب ، مورفولوجيا ، وsynaptogenesis. تجربة نموذجية غالبا ما توظف اثنين أو ثلاثة من الفيروسات التي تحتوي على تسمية فريدة من نوعها ، التحوير ، ومروج لعناصر وحيدة الخلية تحليل العملية التنموية المنشودة في الجسم الحي. بروتوكول التالية توضح طريقة لتحليل الخلايا العصبية الوظيفية التكامل الوليد به خضراء واحدة (GFP) أو أحمر (dTomato) الارتجاعي بروتين فلوري والتصحيح ، المشبك الكهربية.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Integration of Adult-born Neurons at JoVE.com

Studying the Integration of Adult-born Neurons

تم وصف طريقة لدراسة التكامل بين حديثي الولادة الخلايا الحبيبية المسنن لدى الحيوانات البالغة. هذا الأسلوب يستخدم الارتجاعي هندستها لتسمية المولود الجديد الخلايا العصبية ، تليها التسجيلات الكهربية لتحديد التكامل الوظيفي في الجسم الحي.

دراسة دمج الكبار المولد الخلايا العصبية

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

studying-the-integration-of-adult-born-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  State University of New York at Stony Brook. تم وصف طريقة لدراسة التكامل بين حديثي الولادة الخلايا الحبيبية المسنن لدى الحيوانات البالغة. هذا الأسلوب يستخدم الارتجاعي هندستها لتسمية المولود الجديد الخلايا العصبية ، تليها التسجيلات الكهربية لتحديد التكامل الوظيفي في الجسم الحي.

Video: Studying the Integration of Adult-born Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with neurodegenerative diseases or injuries, but also in the normal brain. Here, we describe a newly-established micromechanical system to rapidly, reliably, and reversibly induce axonal varicosities, allowing us to understand the mechanisms governing varicosity formation and heterogeneous protein composition. This system represents a novel means to evaluate the effects of compression and shear stress on different subcellular compartments of neurons, different from other in vitro systems that mainly focus on the effect of stretching. Importantly, owing to the unique features of our system, we recently made a novel discovery showing that the application of pressurized fluid can rapidly and reversibly induce axonal varicosities through the activation of a transient receptor potential channel. Our biomechanical system can be utilized conveniently in combination with drug perfusion, live cell imaging, calcium imaging, and patch clamp recording. Therefore, this method can be adopted for studying mechanosensitive ion channels, axonal transport regulation, axonal cytoskeleton dynamics, calcium signaling, and morphological changes related to traumatic brain injury.

This protocol describes a physiologically relevant, pressurized fluid approach for rapid and reversible induction of varicosities in neurons.

نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). Although mouse models of tauopathy have provided a valuable resource for investigating the neurotoxic mechanisms of aggregated tau, it is becoming increasingly apparent that, due to interspecies differences in neurophysiology, the mouse brain is unsuitable for modeling the human condition. Advances in cell culture methods have made human neuronal cultures accessible for experimental use in vitro and have aided in the development of neurotherapeutics. However, despite the adaptation of human neuronal cell cultures, in vitro models of human tauopathy are not yet widely available. This protocol describes a cellular model of tau aggregation in which human neurons are transduced with lentiviral-derived vectors that code for pathogenically mutated tau fused to a yellow fluorescent protein (YFP) reporter. Transduced cultures produce tau aggregates that stain positively for thioflavin and display markers of neurotoxicity, such as decreased axonal length and increased lysosomal volume. This procedure may be a useful and cost-effective model for studying human tauopathies.

This protocol details a procedure in which human neuronal cultures are transduced with lentiviral constructs coding for mutant human tau. Transduced cultures display tau aggregates and associated pathologies.

نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

لاسلكيه الكهربائية تسجيل الخلايا العصبية من قبل Tetrodes المنقولة في بحريه السباحة الأسماك

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Studying Pre-formed Fibril Induced &amp;#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

دراسة ما قبل تشكيلها فيبريل الناجمة عن تراكم α-Synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين الماوس الجنينية الأولية

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates reafferent cues that animals must disentangle from relevant sensory cues of the surrounding environment. For example, when a fish swims, flow generated from body undulations is detected by the mechanoreceptive neuromasts, comprising hair cells, that compose the lateral line system. The hair cells then transmit fluid motion information from the sensor to the brain via the sensory afferent neurons. Concurrently, corollary discharge of the motor command is relayed to hair cells to prevent sensory overload. Accounting for the inhibitory effect of predictive motor signals during locomotion is, therefore, critical when evaluating the sensitivity of the lateral line system. We have developed an in vivo electrophysiological approach to simultaneously monitor posterior lateral line afferent neuron and ventral motor root activity in zebrafish larvae (4-7 days post fertilization) that can last for several hours. Extracellular recordings of afferent neurons are achieved using the loose patch clamp technique, which can detect activity from single or multiple neurons. Ventral root recordings are performed through the skin with glass electrodes to detect motor neuron activity. Our experimental protocol provides the potential to monitor endogenous or evoked changes in sensory input across motor behaviors in an intact, behaving vertebrate.

We describe a protocol to monitor changes in the afferent neuron activity during motor commands in a model vertebrate hair cell system.

نشاط الخلايا العصبية الجانبية الخلفية Afferent خلال السباحة في حمار وحشي

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...