Este trabalho foi financiado pelo NINDS e American Heart Association para S.Ge. Esta abordagem foi originalmente criado e desenvolvido pelo autor no laboratório do Dr. Hongjun Song na Johns Hopkins University. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Canção Hongjun por sua orientação e apoio.

1. Injeção de vírus Alto título de retrovírus engenharia (1 × 10 9 unidade / ml) é produzida por co-transfecção de vetores retrovirais em células e VSVG HEK293T, seguido por ultracentrifugação do sobrenadante viral. Para as fontes e métodos de produção, ver a demonstração JOVE excelente (3). Nota: adultos jovens (4-6 semanas de idade) do sexo feminino camundongos C57BL / 6 (Charles River) estão alojados em condições normais. Todos os procedimentos seguem o Manual do Conselho Nacional de Pesquisa para o cuidado e uso de animais de laboratório sob um protocolo aprovado pelo Stony Brook University IACUC. <ol><li> 2ul degelo dos retrovírus congeladas por animal no gelo. </li><li> Anestesiar (100 mg + 10 quetamina xilazina mcg por grama de peso corporal) e montar o animal em uma estrutura estereotáxica (Steolting). Remover o cabelo na cabeça e limpe a pele com álcool 70%. </li><li> Expor o crânio e faça quatro furos rasos usando uma broca de dentista (0,6 mm broca) na seguintes coordenadas: <ul><li> anterioposterior = mm -2 de bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 de bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li><li> anterioposterior = mm -2 de bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 de bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li></ul></li><li> Montar um Hamilton 1μl, flat ponta da seringa e injetar 0,5 mL por local de retrovírus em uma taxa de 0,25 mL / min no giro denteado. (Veja as coordenadas acima de profundidade ventral.) Pause 2 minutos após cada injecção antes de retirar a seringa lentamente para evitar o refluxo do fluido. Entre as injeções, brevemente lavar a superfície externa da ponta da seringa com PBS estéril e um aplicador para remover vestígios de sangue. </li><li> Fechar a ferida com material de sutura cirúrgica estéril (tipo P-1; Tamanho 6-0) eo retorno do animal às condições de alojamento padrão até os estágios de tempo desejado após a injeção. </li></ol> 2. Preparação fatia Para obter alta qualidade fatias aguda de camundongos adultos, usamos uma solução de corte modificada para a preparação fatia (veja abaixo). <ol><li> Pré-chill solução de corte de 0-4 ° C no gelo e bolhas com 95% de O 2 -5% CO 2 por pelo menos 30 minutos. </li><li> Anestesiar e transcardially perfundir um animal com gelado solução saturada de oxigênio de corte. </li><li> Remover rapidamente o cérebro em uma placa de Petri com papel-filtro pré-umedecido com frio, solução oxigenada de corte. Cortar o cerebelo e uma fatia superfície de montagem, pelo menos, um milímetro anterior para as coordenadas de injeção (visível). Cola do cérebro em um estágio vibrotome e montá-la na câmara de corte cheio de frio e oxigenado solução de corte. </li><li> Prepare as fatias coronal ou horizontal (300-350μm) e transferi-las com uma pipeta de grande calibre a uma câmara de incubação contendo temperatura ambiente ACSF aeradas com 95% O 2 / 5% CO 2. </li><li> Incubar as fatias, borbulhando de forma contínua, a 32 ° C por 30-60 minutos. Retorno da câmara à temperatura ambiente para a duração da gravação. </li></ol> 3. Experimentos eletrofisiológicas <ol><li> Fatias são transferidos para a câmara de gravação que é continuamente perfundidos com oxigênio saturado ACSF em 32 ° C - 34 ° C. </li><li> Um eletrodo de estimulação bipolar de tungstênio é colocado na camada molecular do giro denteado utilizando uma objetiva de microscópio de baixa ampliação (10X). </li><li> PED recém-nascido na zona sub-granular / camada de células granulares são identificados pela expressão de GFP ou dTomato. De célula inteira de gravação patchclamp é realizada em neurônios recém-nascidos sob alta ampliação (40X). </li><li> Propriedades de queima das células gravadas são obtidas por injeção de uma série de correntes sob clamp de corrente de modo. </li><li> Estímulos elétricos são entregues pelo eletrodo de estimulação através de um isolador de estimulação controlado pelo software de gravação, e evocou as correntes pós-sinápticos no PED recém-nascidos são registrados. </li></ol> 4. Análise de Dados Amplitudes de respostas evocadas pós-sinápticos são analisados ​​em diferentes estágios de desenvolvimento do adulto-nascido neurônios. 5. Resultados representante Usando o protocolo acima, GFP expressão em recém-nascidos neurônios do giro denteado semelhante à Figura 1 é comum. Note-se que os neurônios recém-nascidos são facilmente visualizadas e ambos dendritos e axônios são fortemente marcadas. Expressão em thin axônios DGC e pequenas espinhas depende da qualidade e de título do vírus, o promotor utilizado ea duração da expressão em vivo. Em nossas mãos, as células recém-nascido e sub-celular organelas são normalmente visíveis dentro de poucos dias após a injeção, e expressão da coluna pode ser rastreada desde os primeiros estágios de desenvolvimento. Wburaco células gravações dos neurônios recém-nascidos em estágios diferentes de tempo permitem o estudo das propriedades únicas células recém-nascido, por exemplo, potenciais de ação (Figura 2a), bem como o processo de integração sináptica em circuitos neurais existentes durante a maturação (Figura 2b). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 imagem 2-fótons confocal de neurônios recém-nascido em uma seção de giro horizontal denteado de um rato adulto. Células verdes são 21dpi (dias pós-injeção) expressando GFP-PED recém-nascido rotulados com PUX-GFP retrovírus. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 a, b) Ação potencial de disparo propriedades de um recém-nascido DGC aos 21 dpi.) Representante evocado correntes excitatórias pós-sináptico (EPSCs) gravado em um recém-nascido DGC aos 21 dpi.

<ol>
	<li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis.">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li><li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain.">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neurogênese contínua no hipocampo do cérebro de mamíferos adultos oferece um sistema único modelo experimental para estudar o desenvolvimento e integração neuronal no cérebro maduro. O protocolo aqui apresentado combina rotulagem retroviral e métodos eletrofisiológicos para estudar a integração de recém-nascidos neurônios granulares denteado no cérebro de ratos adultos. Para garantir que seus experimentos forem bem sucedidos, recomendamos o seguinte durante etapas críticas do processo: Para evitar a infecção e inflamação indesejável, todas as ferramentas devem ser esterilizados (em autoclave, qualquer tipo de esterilizador, ou etanol 70%) antes da cirurgia. Use PBS estéril para lavar a ponta da agulha da seringa antes da injeção. Para injecção de vírus, os animais devem ser bem montado no dispositivo estereotáxico e fontes de movimentos desnecessários devem ser minimizados durante a injeção. Certifique-se a cabeça está bem fixo e firme, e ajustar a posição do nariz do mouse para nível bregma e lambda antes de coordenadas de injeção de cálculo. Extrato de vírus para dentro da seringa rapidamente para minimizar a exposição a temperaturas quarto - retrovírus são particularmente sensíveis à temperatura. Injetar o vírus lentamente na dose recomendada para minimizar os danos de pressão. Usando o recomendado seringa de ponta chata (vs. ponta chanfrada comum) irá garantir uma uniformemente distribuído área infecção giro denteado. Antes de preparar fatias, o corte de solução e incubar ACSF devem ser aeradas com 95% O CO 2 -5 2% para pelo menos 30 minutos para permitir que o oxigênio para saturar as soluções. Os animais devem ser perfundidos com rapidez e tecidos mantidos em frio, solução saturada de oxigênio para a melhor qualidade fatia. Para a gravação, aumente a intensidade do estímulo progressivamente até que haja uma resposta pós-sináptica. Mudar o local do eletrodo de estimulação dentro da camada molecular do giro denteado, se necessário. Em resumo, a abordagem recomendada oferece uma maneira de explorar as propriedades distintas e possíveis papéis funcionais do adulto-nascido neurônios durante a fase inicial de integração em circuitos, ativo maduro.

<ul><li> Corte de solução (em mM): 110 cloreto de colina, 2,5 KCl, 1,3 KH 2 PO 4, 25,0 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 dextrose, 1,3 de ascorbato de sódio, 0,6 piruvato de sódio, ácido 5,0 cinurênico. </li><li> Fluido cérebro-espinhal artificial (ACSF, em mM): NaCl 125,0, 25,0 NaHCO 3, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1,3 KH 2 PO 4, 1,3 MgCl 2, 1,3 ascorbato de sódio, 0,6 piruvato de sódio, 10 dextrose. </li><li> Solução interna para toda célula patchclamp (em mM): 120 gluconato de potássio, KCl 15, 4 MgCl 2, 0,1 EGTA HEPES, 10.0, 4 MgATP, 0,3 Na 3 GTP, 7 de fosfato (pH 7,4, 300 mOsm). </li></ul>

studying the integration of adult-born neurons

Neurogênese ocorre em cérebros de mamíferos adultos na zona sub-ventricular (SVZ) do ventrículo lateral e na zona sub-granular (SGZ) do giro denteado do hipocampo durante toda a vida. Relatórios anteriores têm mostrado que a neurogênese do hipocampo adulto está associada a diversas doenças cerebrais, incluindo a epilepsia, esquizofrenia, depressão e ansiedade (1). Decifrando o processo de integração neurônio normal e aberrante adulto-nascido pode lançar luz sobre a etiologia destas doenças e informar o desenvolvimento de novas terapias. SGZ neurogênese adulta espelhos embrionário e pós-natal o desenvolvimento neuronal, incluindo as etapas de especificação de destino, migração, integração sináptica, e maturação. No entanto, a integração ocorre ao longo de um prolongado, período de 6 semanas. Entrada sináptica inicial para adultos-nascido SGZ células granulares denteado (PED) é GABAérgica, seguido da entrada glutamatérgica menos 14 dias (2). Os fatores específicos que regulam a formação de circuito de adulto-nascido neurônios no giro dentado são actualmente desconhecidas. Nosso laboratório utiliza uma réplica deficiente do vetor retroviral com base no vírus da leucemia murina Moloney para entregar proteínas fluorescentes e hipótese de genes reguladores a essas células a proliferar. Esta técnica fornece viral elevada especificidade e resolução para a análise da data de nascimento de células, a linhagem, morfologia e sinaptogênese. A experiência típica muitas vezes emprega dois ou três vírus contendo rótulo único, transgene, e elementos de promotor para uma única célula de análise de um processo de desenvolvimento desejado in vivo. O protocolo a seguir descreve um método para analisar a integração funcional dos neurônios recém-nascido através de um único verde (GFP) ou vermelho (dTomato) retrovírus proteína fluorescente e patch-clamp eletrofisiologia.

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Uma maneira de estudar a integração de recém-nascidos células granulares denteado em animais adultos é descrito. Esta técnica utiliza um retrovírus engenharia para rotular neurônios recém-nascidos, seguido de gravações eletrofisiológicas para determinar a integração funcional vivo.

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

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13.6K visualizações.  State University of New York at Stony Brook. Uma maneira de estudar a integração de recém-nascidos células granulares denteado em animais adultos é descrito. Esta técnica utiliza um retrovírus engenharia para rotular neurônios recém-nascidos, seguido de gravações eletrofisiológicas para determinar a integração funcional vivo.