وأيد هذا العمل من قبل شركة التأمين على الحياة &quot;نوفاليس ، Taitbout&quot; ، مدرسة قصر العلوم العصبية في باريس (ENP) ، والوكالة الوطنية للبحوث دي لا &quot;ANR - 09 - NEUR - 004&quot; في اطار &quot;نيورون إيرانيت&quot; لل FP7 البرنامج من قبل المفوضية الأوروبية ، &quot;مؤسسة بحوث تصب لا ميديكال&quot; ، ومؤسسة يتين ممثل ومؤسسة باستور.

1. التجسيمي الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيروس المستخدمة في هذه التجارب هي التي تعاني من نقص ناقلات النسخ المتماثل lentiviral على أساس فيروس نقص المناعة البشرية للتعبير عن Channelrhodopsine2 - YFP (بروتين فلوري الصفراء) الانصهار بناء يقودها المروج synapsin 6. وقدمت بسخاء البلازميد بواسطة K. Deisseroth &#39;ق مجموعة أبحاث ( <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). ويمكن الحصول على Lentiviruses من مصادر تجارية أو المنتجة في المختبر وفقا للبروتوكولات القائمة 7. وكانت ناقلات التتر متوسط ​​في الترتيب 10 وحدات من تنبيغ 10 / مل. يتم تخزين aliquots الفيروسية عند درجة -80 وينبغي إذابة قبل التحميل ماصة. وينبغي تجنب متعددة تجميد / الذوبان دورات. أبدا التعرض الحل الفيروس مباشرة إلى الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الماصات الزجاج البورسليكات الزجاج باستخدام الشعيرات الدموية على مستوى ماصة مجتذب (سوتر ف-97 ماصة مجتذب). يجب أن يكون الإعداد سحب محسوبة بشكل صحيح لانتاج ماصة طويلة وجامدة. المقبل ، وخفض غيض من ماصة باستخدام مقص للحصول على معلومات سرية من 30-40 ميكرون في القطر. سحبت تخزين ماصات في مربع الغبار الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعداد الثاني Nanoject microinjector مع تعليمات الشركة المصنعة لتسليم 50 NL. إعداد ماصة بواسطة الحقن مرة أخرى ملء مع الزيوت المعدنية وإدراجه في لmicroinjector المكبس. نعلق على microinjector إطار التجسيمي. فارغة جزئيا من النفط ماصة الزجاج قبل ملء مع الحل فيروس </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع micropipette ، ونقل 2 ميكروليتر من محلول الفيروس على قطعة معقمة من Parafilm. انخفاض بلطف ماصة الزجاج في قطرة من حل الفيروس وملء مع ماصة 1-2 ميكرولتر. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس مع الكيتامين ملغ / كلغ 100 و 10 ملغ / كلغ زيلازين ، مخففة في ملحي معقم. إزالة الشعر من فروة الرأس للحيوان قارض به كليبرز ، الحلاقة ، مقص ، أو كيميائية depilitory. تطهير فروة الرأس مع ثلاثة تطبيقات بالتناوب الايثانول 70 ٪ وbetadine. ينبغي لجميع الأدوات الجراحية أيضا تعقيمها وتطهيرها ثم مع الايثانول 70 ٪. وضع الحيوان في إطار التجسيمي بقضبان الأذن والأنف بار ، مؤكدا ان رئيس آمنة. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف قرنية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مشرط ، وقطع من فروة الرأس بين العينين ما بين الأذنين. سحب الجلد جانبا لفضح الجمجمة ومرساة الجلد مع زوج من المشابك. تنظيف سطح الجمجمة. وركزت أجهزة التجسيمي مع غيض من الزجاج في bregma ماصة. ثم يتم وضع طرف في موقع الحقن (انتيرو ، مؤخره ، 3.30 ؛ ميديو ، الجانبي ، ± 0.82 ، لكل من نصفي الكرة اليمين واليسار ، على التوالي). الموقف من شريط الأنف لابد من تعديلها وفقا لحساب إحداثيات التجسيمي. في تجربتنا ، يتم ضبط شريط الأنف شيتم محاذاة ntil bregma وموقع الحقن لنفس الارتفاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع الحقن. استخدام تدريبات عالية السرعة الجراحية ، وحفر ثقوب بعناية في الجمجمة. بإبرة حقنة عازمة على طرف مدمن مخدرات ، وإزالة بقايا العظام رقيقة لفضح جافية. تأكد من أن يتم توسيط ثقب في الموضع الصحيح. الحرص على عدم تمزق الأوعية الدموية على سطح الدماغ أثناء الحفر. إذا تمزق الأوعية الدموية ، اضغط برفق على سطح الدماغ مع القطن برعم صغير أو الأنسجة لعدة ثوان حتى توقف تدفق الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض ماصة وصفر ارتفاع ظهراني بطني عندما غيض من اللمسات ماصة على سطح الدماغ. ثم ، وانخفاض في العمق الصحيح ظهراني بطني (ظهراني بطني ، و 2.9 من سطح الدماغ) وانتظر 30 ثانية للتوازن الضغط. حقن 4 مرات 50 NL فيروس ليصبح المجموع 200 NL. انتظر 30 ثانية بين كل حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دقيقة واحدة بعد حقن الماضي ، سحب الأنبوب ببطءTTE. كرر 1،6-1،8 نقطة لنصف الكرة الأرضية الآخر. إزالة الحيوان من جهاز التجسيمي ، وتنظيف الجرح وغرزة قطع الجلد باستخدام خيوط جراحية. السماح للحيوانات لاسترداد على لوحة ظاهرة الاحتباس قبل ان يعود الى القفص. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إعطاء الحيوانات من غير الستيرويدية المضادة للالتهابات والمسكنات (مثل كاربروفين 4mg/kg) مباشرة بعد 3 أيام ، وبعد الجراحة. </li></ol> 2. المزمنة لزرع الصمام في تحفيز optogenetic المجراة في البصلة الشمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الحيوانات مع جزيئات lentiviral ثنائيا يتم زرعها المقبل مزمنة مع LED زرقاء مصغرة (أوسرام ، الصمام CMS 4.6W الأزرق). لحام دبابيس أدى إلى الإناث موصل كهربائي مصغر بحيث يتم وضع الرابط على الجانب الآخر من الصمام. التحقق من عدم وجود قطع كهربائية قصيرة وتحديد دبوس الإيجابية والسلبية على الموصل. اختبار الصمام من خلال توصيله إلى وحدة تحكم الحالية لLED رغم برقية المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس و / أو تعيين السلطة المطلقة للضوء LED ، تركيب الصمام على micromanipulator وموقف الصمام في اتصال مباشر مع photodetector من السلطة متر من شدة الضوء ذروته عند 470 نانومتر. حفر ثقب صغير بقطر 3 ملم في لوحة PVC مبهمة. يلصق هذا الثقب إلى السلطة متر وبناء منحنى مستوى الطاقة الضوئية مقابل المدخلات الحالية لحساب السلطة في 2 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس مدى انتشار الضوء من خلال الدماغ ، وقطع كتل من أنسجة المخ طازجة من 300 ، 500 ، 1000 ، 1500 و 2500 ميكرون في سمك 0-4 درجة مئوية ACSF باستخدام 14 vibratome. وضع قطعة من الجمجمة مع حج القحف مماثلة لتلك التي أجريت على الفئران يعيشون تحت الصمام. أولا ، وقياس قوة الضوء دون الأنسجة تركزت على الصمام. ثم ، وضع كل كتلة من الأنسجة بين LED وphotodetector من السلطة متر ، وقياس الطاقة. بناء منحنى سماكة الأنسجة مقابل جزء نسبي انتقال ، محسوبة كنسبةبين السلطة يقاس من خلال الأنسجة ودون الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس مع الكيتامين ملغ / كلغ 100 و 10 ملغ / كلغ زيلازين ، مخففة في ملحي معقم. تنظيف وتعقيم الصمام مع الايثانول 70 ٪. إزالة الشعر من فروة الرأس من الحيوان وتطهير فروة الرأس مع ثلاثة تطبيقات بالتناوب الايثانول 70 ٪ وbetadine. ثم ضع الحيوان في إطار التجسيمي. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف قرنية العين. نعلق موصل إلى حائز التجسيمي. وينبغي تعديل الموقف من شريط الأنف حتى سطح الجمجمة فوق البصلة الشمية أفقي تماما وموازية لسطح مصغرة الصمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مشرط ، وقطع في فروة الرأس من 3 ملم الأمامي للعيون إلى 3 ملم الخلفي الى الاسماع. سحب الجلد جانبا وتثبيته مع زوج من المشابك. كشط بعيدا الأغشية على سطح الجمجمة باستخدام شفرة حلاقة. نظيفة وجافة الجمجمة. تطبيق غطاء رقيق من مادة لاصقة cyanoacrylate الإعلانية للسماح لاحقةhesion من الاكريليك الأسنان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تدريبات عالية السرعة الجراحية ، وإجراء حج القحف مستطيلة (1 مم و 3 مم الذيلية الوحشي ؛ تركزت على عجزي 5.1 مم ، 0 ملم الوحشي من bregma) على بصيلات الشم. للقيام بذلك ، رقيقة بعناية حتى الجمجمة سوى طبقة رقيقة من بقايا العظام. إزالة بعناية العظام المتبقية مع مساعدة من إبرة حقنة عازمة. وينبغي إيلاء عناية خاصة لتجنب هذه المسألة ثقب الجافية وتمزق في الأوعية الدموية الرئيسية التي تقع بين نصفي الكرة الأرضية والحدود الذيلية من بصيلات الشم. تراكم الدم والتخثر على سطح الدماغ يحول دون تغلغل ضوء الأمثل في الأنسجة. شطف حج القحف وسطح المخ بمحلول ملحي معقم ثم الجافة الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق مصغرة ادى الى الموصل. انخفاض مصغرة LED على الجزء العلوي من بصيلات الشم. وينبغي أن المحور الرئيسي للالصمام مصغرة تكون موازية للمحور منقاري - الذيلية من الفأرة ، مع تنظيف وتعقيم المياه المالحة دراي الجمجمة. آمن ثم قاده في الجمجمة مع الطبقة الأولى من الاكريليك (أي الأسمنت المتعدد الكربوكسيل) ، تليها طبقة ثانية من الاكريليك الأسنان. قد تكون هناك حاجة لإضافة اثنين من البراغي الصغيرة لإصلاح الصمام. وينبغي إدراج مسامير على الجمجمة (الخلفي لموقف LED) ومغطاة الأكريليك على حد سواء. بينما لا يزال السائل الاكريليك ، والتراجع والغراء حواف خالية من فروة الرأس على السطح من الاكريليك الأسنان. الحرص على عدم تطبيق أي الاكريليك على الموصل. بعد الاكريليك وصلابة ، وإزالة الحيوان من جهاز التجسيمي والسماح لها استرداد على لوحة ظاهرة الاحتباس قبل ان يعود الى القفص. هي معزولة في قفص الحيوانات الخاصة بهم للتعافي من عملية جراحية لسبعة أيام على الأقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إعطاء الحيوانات من غير الستيرويدية المضادة للالتهابات والمسكنات (مثل كاربروفين 4mg/kg) مباشرة بعد 3 أيام ، وبعد الجراحة. وينبغي اختبار المصابيح قبل الزرع وبعد انتهاء التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A electri الضوءيتم استخدام كابل لكال الحبل الحيوان إلى وحدة تحكم الحالية لLED بالإضافة إلى مولد النبض (ماجستير - 8) للتحكم في توقيت وشدة الصمام. كابل رقيقة تسمح بحرية كاملة في التنقل. الحرص على احترام قطبية الموصل. وقد عكس القطبية كسر الصمام. </li></ol> 3. ممثل النتائج : وأعرب عن ChR2 - YFP transduced في الخلايا العصبية ما يقرب من 48 ساعة بعد الحقن ، ويظل مستقرا لعدة أشهر 7. الرقم 1 هو صورة ممثل قسم السهمي من حيوان بارافورمالدهيد الثابتة 15 يوما بعد الحقن. لاحظ العلامات الكثيفة وحجم موقع الحقن في RMS. فقد هاجر عدد كبير من الخلايا الوليد على طول RMS لاستعمار طبقات مختلفة من البصلة الشمية (الشكل 1). وأعرب عن انصهار بروتين في جميع المقصورات الخلايا العصبية ، بما في ذلك سوما ، التشعبات ، والعمود الفقري. مصغرة LED impla<html> ntation يسمح نطاق واسع وغير مكلفة لتحفيز البصري في منطقة واسعة من الاهتمام. غير المربوطة الحيوان إلى وحدة تحكم الصمام مع كابل كهربائي الضوء الذي يسمح بحرية كاملة في التنقل. التي ميزت نشر الضوء في أنسجة المخ وعتبة ChR2 التنشيط ، نقدر يمكن أن تسبب التنشيط الضوئية على عمق ~ 2mm وتحت سطح الصمام (الشكل 2A). لمراقبة تفعيل الفنية ChR2 - معربا عن الخلايا العصبية في الجسم الحي ، يمكن تحليل التعبير عن C - منظمات المزارعين ، وهو علامة على نشاط الخلايا العصبية ، وبعد التحفيز ضوء المتكررة (الشكل 2B). كبديل ، يمكن أن التسجيلات في المختبر من الخلايا العصبية الكهربية ، بالإضافة إلى التعبير عن ChR2 التحفيز ضوء التنسيق يتم تنفيذ 14. أخيرا ، استخدمت اثنين الفوتون استهدفت فضفاضة التصحيح تسجيلات لدراسة تفعيل الفنية ChR2 - معربا عن الخلايا العصبية القشرية التي تشبه الصمام مصغرة في الجسم الحي 9. ntent &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> الشكل 1. ChR2 - YFP التعبير من الحقن lentiviral في تيار الهجرة منقاري. مبائر صور الممثل لقطاعات saggital من البصلة الشمية للماوس بعد 15 يوما من الحقن الفيروسة البطيئة في RMS منقاري. لاحظ وجود الخلايا العصبية متناثرة الوليد YFP المهاجرة من نهاية RMS إلى طبقات مختلفة من OB. معظم الخلايا حديثي الولادة (95 ٪) هي الخلايا الحبيبية ، والتي تكمن في سوما الحبيبة طبقة الخلية (GCL) والتشعبات arborize في طبقة ضفيري الخارجي (EPL). مجموعة صغيرة من الخلايا العصبية الوليد ترحيل ما يصل الى الطبقة الأكثر سطحية من OB ، في طبقة كبيبي (GL). مقياس بار ، 100μm. أقحم ، التكبير العالية من خلية الحبيبية حديثي الولادة ، والتي تبين التعبير غشاء ChR2 - YFP في التشعبات وكذلك في العمود الفقري. مقياس بار ، 20μm. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; الشكل 2. رسم تخطيطي لزرع الصمام على الجزء العلوي من البصلة الشمية والخفيف أثارت التعبير ج منظمات المزارعين في ChR2 - YFP معربا عن الخلايا الحبيبية الجديدة. والرسم التخطيطي لزرع الصمام فوق المصابيح الشمية. (ب) ، وصور تبين مبائر الممثل المزدوج المسمى ChR2 - YFP + ج + الخلايا الحبيبية منظمات المزارعين ساعة واحدة بعد التحفيز ضوء البصلة الشمية. وكشفت منظمات المزارعين C - التعبير باستخدام أرنب المضادة للمنظمات المزارعين ج الضد الابتدائي (Calbiochem ، 1:5000) و A568 - مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية (Invitrogen ، 1:1000). مقياس بار ، 10μm.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).</li><li>Slotnick, B., Bodyak, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+Discrimination+and+Odor+Quality+Perception+in+Rats+with+Disruption+of+Connections+between+the+Olfactory+Epithelium+and+Olfactory+Bulbs.">Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs.</a> J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تزايدت في الآونة الأخيرة أدوات Optogenetic سيطرتنا على السكان العصبية انتقائية ، بما في ذلك الخلايا العصبية الكبار ولدوا في نظام حاسة الشم. هنا نحن تصف كيفية إجراء الحقن التجسيمي لناقلات lentiviral معربا عن ChR2 - YFP في سكانية محددة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية. من خل?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مادة </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> الكيتامين </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> زيلازين </td><td> باير للرعاية الصحية </td><td> Rompum 0.2 ٪ </td></tr><tr><td> ماصة بولير </td><td> سوتر </td><td> P - 97 </td></tr><tr><td> زجاج الأوعية الشعرية (3.5 &quot;) </td><td> دروموند العلمية </td><td> 3 - 000 - 203 - G / X </td></tr><tr><td> Nanoject الثاني Microinjector </td><td> دروموند العلمية </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> عالية السرعة حفر الجراحية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> الحفر الصغيرة غيض 0.7mm الصلب قطرها الأزيز </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED زرقاء CMS 4.6 W </td><td> أوسرام </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> موصل كهربائي الإناث (2.54 ملم) </td><td> فيشر الكترونيك </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> الحالية للتحكم LED (حد أقصى : 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO - KL50 - 1000 </td></tr><tr><td> مولد النبض </td><td> AMPI </td><td> الماجستير - 8 </td></tr><tr><td> البصرية السلطة متر </td><td> ثور مختبرات </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylate لاصقة </td><td> وكتايت </td><td> 454 </td></tr><tr><td> الأسمنت المتعدد الكربوكسيل (أول طبقة الاسمنت) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> ميتاكريليت الاسمنت (الثانية طبقة الاسمنت) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast طراد -- السائل (# 339292) Unifast طراد -- مسحوق (# 339114) </td></tr><tr><td> كاربروفين </td><td> شركة فايزر </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

وتتم تعبئة مستمرة interneurons المحلية في البصلة الشمية من القوارض الكبار 1-3. في هذه العملية ، ودعا الخلايا العصبية الكبار ، والخلايا الجذعية العصبية في جدران البطين الوحشي تثير neuroblasts التي تهاجر لعدة مليمترات على طول تيار الهجرة منقاري (RMS) للوصول إلى وتدرج في البصلة الشمية. لدراسة الخطوات المختلفة وأثر التكامل عصبون البالغين المولودين قبل الإيجاد في دوائر حاسة الشم ، فمن الضروري تسمية انتقائي والتلاعب في نشاط هذه الخلايا العصبية معينة من السكان. تطوير التكنولوجيات الحديثة optogenetic يتيح الفرصة لاستخدام الضوء لتنشيط هذا الفوج محددة بدقة من الخلايا العصبية التي تؤثر على الخلايا العصبية المحيطة بها دون 4،5. هنا ، فإننا نقدم سلسلة من الإجراءات لفيروسي أعرب Channelrhodopsin2 (ChR2) - YFP في الفوج مقيدة زمنيا من neuroblasts في RMS قبل ان تصل الى البصلة الشمية وأصبح الكبار المولد شمال شرقurons. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض كيفية الزرع ومعايرة نموذج مصغر لLED المزمنة في تحفيز الخلايا العصبية الحية ، معربا عن ChR2.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation at JoVE.com

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

يمكن أن الخلايا العصبية البالغين المولودين في البصلة الشمية تسيطر optogenetically Channelrhodopsin2 باستخدام الحقن ، معربا عن lentiviral في تيار الهجرة منقاري وضوئي المزمنة مع مصغرة زرع الصمام.

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K Views.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). يمكن أن الخلايا العصبية البالغين المولودين في البصلة الشمية تسيطر optogenetically Channelrhodopsin2 باستخدام الحقن ، معربا عن lentiviral في تيار الهجرة منقاري وضوئي المزمنة مع مصغرة زرع الصمام.

Video: Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

دراسة دمج الكبار المولد الخلايا العصبية

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetic تحفيز السلوك في الهروب<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...