فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لارس Philipsen للمساعدة في تحقيق الاستفادة المثلى من الأفلام intravital ، والدكتور جوناثان ليندكويست لقراءة المخطوطة بعناية ، وجميع أعضاء المختبر لاجراء مناقشات مفيدة Gunzer والتعليقات خلال تطوير الأسلوب. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG ، SFB 854) إلى MG

1. عدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتولد غبيرات منتفخة من العفن الرشاشية الدخناء (سلالة ATCC 46645) من مرحلة ما قبل الحضانة في RPMI 1640 (Biochrom AG ، برلين ، ألمانيا) تستكمل مع 5 ٪ FCS (V / V). ومعلق 2x10 7 غبيرات يستريح في المتوسط ​​5 مل والمحتضنة في صفيحة نسيج الثقافة جيدا 6 (TPP AG ؛ Trasadingen ، وسويسرا ، وأنواع # 92006) ل7H عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة وتورم ، وfluorescently المسمى الجراثيم وذلك بإضافة 10 ميكرولتر من محلول calcofluor الأسهم البيضاء (سيغما الدريتش ، Deisenhofen ، وألمانيا ، وأنواع # F3543 ؛ [25 ملغ / مل] في DMSO) إلى كل الرشاشية تحتوي كذلك في البئر - 6 لوحة ، والتوصل إلى تركيز calcofluor النهائية من 50 ميكروغرام / مل RPMI. بعد خلط لطيف ، والمحتضنة للجراثيم ل15 دقيقة اضافية في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الخطوة التالية ، ويتم حصاد الجراثيم عن طريق الترشيح من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، هايدلبرغ ، ألمانيا). بعد غسله مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مل 10 (الطرد المركزي في 900xg لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) هو معلق على بيليه في برنامج تلفزيوني مل (2) والعدد الإجمالي للغبيرات تورم يحددها العد مع غرفة نويباور. أخيرا هو نسج تعليق بوغ في اسفل 900xg لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ويتم إزالة بعناية طاف ، وبيليه معلق على التركيز النهائي للجراثيم 1x107 لكل 100 PBS ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للعدوى ، يتم تطبيق 100 ميكرولتر من محلول بوغ intratracheally في إناث الفئران (C57/BL6 ، 8-10 أسابيع من العمر ، هارلان ، ألمانيا). إذا العدلات هي التي يتعين مراعاتها كذلك ، فمن المستحسن استخدام ليز - EGFP الفئران ، تحمل EGFP تحت promotor الليزوزيم 1. يبدأ التخدير الحيوان مع حقنة واحدة من 150 IP حل Ketamin / Rompun ميكرولتر (Inresa Arzneimittel محدودة ، فرايبورغ ، ألمانيا (Ketamin) وباير محدودة الحيوية ، ليفركوزن ، ألمانيا (Rompun) ، 1 مل Ketamin [50 ملغ / مل] + 0.5 مل Rompun [2 ٪] + 3.5 مل العقيمة كلوريد الصوديوم [0.9 ٪]). يمكن 5 دقائق في وقت لاحق ان تكون ثابتة الماوس تخدير مع شريط مطاطي بواسطة أنيابها إلى المنحدر (أي سطح منحدر) لتسهيل التنبيب (تكميلية الشكل 1). باستخدام الملقط ، ويتم سحب اللسان لجانب واحد وريدي سكنى 22G القسطرة (B. براون AG ، Melsungen ، ألمانيا ، Vasofix Braunüle) يمكن إدراج برفق في القصبة الهوائية تحت إنارة دائمة مع أوزة مصباح العنق. يتم التحقق من الإدراج الناجح لقسطرة من خلال مراقبة حركة الصدر العادية للحيوان مع تواتر التنفس الصناعي الميكانيكي. عندما تم تأكيد التنبيب ناجحة ، يتم تطبيق وقف بوغ 100 ميكرولتر باستخدام micropipette 100 ميكرولتر. وينبغي أن استنشاق هذا الحجم من الحيوانات من دون أي مساعدة إضافية في 02/01 ثانية. وحققت زيادة توزيع الجسيمات داخل الفطرية الرئة التهوية ميكانيكيا الحيوانات المصابة لمدة 2 دقيقة مع جهاز للتنفس الحيوانات الصغيرة (MiniVent ، ساكس هوغو مارس Hugstetten ، ألمانيا) بسعر 250 نفسا في الدقيقة وحجم استنشاق 300 ميكرولتر في التنفس (تكميلية الشكل 2). بعد أن يتم إرجاع الحيوانات العدوى إلى القفص ، ويحتفل به كل 5 دقائق حتى المتنقلة مرة أخرى. الفئران لا تظهر أي دليل على الألم أو الضيق أثناء فترة الحضانة التالية. </li></ol> 2. إعداد الرئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 ساعة بعد الإصابة مع الجراثيم ، والموت الرحيم للحيوان عن طريق جرعة زائدة من isoflurane (باكستر محدودة ، Unterschleiβheim والمانيا) وحتى الحركات والتنفس قد توقف لأكثر من 30 ثانية. ثم تبعتها بذلك عن طريق بضع الصدر كأسلوب الثانوية لضمان موت سريري ، والسماح لتصور وصول القصبة الهوائية والرئتين. ثم يتم فتح الصدر بعناية لكشف سرطان الرئة والجهاز التنفسي العلوي. ثم يتم إدخال آخر ريدي سكنى 22G قسطرة في القصبة الهوائية بدءا من لسان المزمار المكشوفة. من خلال هذا نبيب يتم ملء الرئتين مع 1 مل من قبل agarose حرارة انصهار منخفضة (2 ٪ ث / ت ، Promega ، مانهايم ، ألمانيا) باستخدام حقنة 1 مل Omnifix (B. براون). حالما يتم ملء الرئتين والقصبة الهوائية قبالة تعادل مع قطعة قصيرة من خيوط الحياكة ويتم وضع كل الحيوانات في الثلاجة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 دقيقة في وقت لاحق ، عندما agarose وطدت ، يتم رفعه في الرئة بأكمله ابتداء من القصبة الهوائية. باستخدام مقص حاد وأشار ، في وقت لاحق يتم إزالة الفص الرئة اليمنى ، وتجفف لفترة وجيزة على السطح السفلي في ورقة الأنسجة ومن ثم يتم لصقها الفص بأكملها إلى كتلة إعداد Vibroslice vibratome 752M (Campden الآلات ، المملكة المتحدة ، ) باستخدام قطرة من مادة لاصقة لتثبيت الأنسجة (كارل روث محدودة ، كارلسروه ، ألمانيا ، روتي كول - 1). 1 دقيقة بعد تثبيت كتلة في مجلس النواب قطع من vibratome ، وهي مليئة قبل المبردة (4 درجات مئوية) في برنامج تلفزيوني. تم تعيين vibratome إلى اهتزاز متوسطة المدى (5 من أصل 10 كحد أقصى.) ، وكذلك سرعة معتدلة (5 من أصل 10 كحد أقصى.) بحيث شريحة الأفقي للويتم إنتاج الرئة. ثم نقل في النصف العلوي من الجهاز الى صحن صغير من البلاستيك بيتري (5 قطرها سم) حيث أنها مقلوب وثابتة مع غسالة عصامي شقة (1 سم القطر الداخلي) التي تغطيها مجموعة من خيوط النايلون بالتوازي مع ذلك ، كل 1 مم وبصرف النظر (الشكل التكميلي 3). أخيرا يملأ طبق بيتري مع 10 مل PBS تستكمل مع 10 ميكرولتر من الحمض النووي Sytox صبغ برتقالي [5 ملي] (Invitrogen ، ألمانيا) مما أدى إلى تركيز صبغة نهائية من 5 ميكرومتر. </li></ol> 3. 2 فوتون ليزر المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تثبيت الطبق بتري تحتوي على عينة الرئة تحت المجهر الهدف بحيث يمكن أن تكون درجة حرارة المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية من الحرارة أجهزة الاستشعار التي تسيطر عليها جهاز التدفئة (تكميلية الشكل 4). ويتم بعد ذلك 2 فوتون من المجهري على سطح قطع كامل باستخدام مجهر زايس LSM NLO 710 في مرحلة تستقيم ممتحن محوري مجهزة عدسة المياه 20xNA1.0 غمس (زايس ، جينا ، ألمانيا). التصوير ، ويتم مسح مناطق مختلفة على طول الباب وصولا الى عمق 400 ميكرون باستخدام الطول الموجي 800 نانومتر الإضاءة كشف الخضراء (530 نانومتر) والحمراء (580 نانومتر) مضان ، وكذلك الجيل الثاني التوافقي (SHG) ، وإشارة الزرقاء calcofluor مضان (400-470 نانومتر في الانبعاثات) مع عدم الكشف عن الخارجية descanned (NDD). 2 - D إلى جانب الصور والأفلام الفاصل الزمني (1 صورة كل ثانية 5-10) ، يمكن أن تكون مفردة أو متكررة مداخن صورة 3 الابعاد في وقت لاحق أصدرت واحدة أو الاداءات فوكسل الصور التركيز الموسعة أو 4 - D البيانات (3D مع مرور الوقت) باستخدام حزم البرمجيات المختلفة. يسمح هذا الإعداد مجهرية مراقبة السلوك الخلوية في بيئة سليمة تقريبا أنه ، كما أنه يشكل المنفذ دخول لمجموعة متنوعة من العوامل الممرضة المحمولة جوا ، وأمر له أهمية هائلة المناعية. يمكن حركية الخلية ، البلعمة والإنتاج NET بواسطة العدلات الذاتية بعد العدوى مع العفن الرشاشية الدخناء التحقيق بسهولة في ظل هذه الظروف في الوضع الطبيعي. </li></ol> 4. ممثل النتائج إذا كان ذلك صحيح فإن التصوير توليد 2 -- 3 أو لون الشرائح أو الأفلام. على الرغم من أن يتم التلوين في آخر إجراء معالجة وبالتالي فهي قابلة للتكيف بحرية ، ونحن عموما تحديد نظام التلوين الذي يعكس اللون الطبيعي للصباغة / إشارة ، والتي تم الكشف عنها في القناة النسبية. وهكذا ، وصفت في Sytox الأصباغ الحمراء ، الفطر ، وكذلك يظهر إشارة SHG باللون الأزرق ، وإذا كان حاضرا ، والملطخة EGFP الخلايا التي تحمل علامات باللون الأخضر. في المثال الأول (الشكل 1) إشارة SHG الزرقاء يصور ألياف أنسجة الرئة غير المصابة وينتج إشارة حمراء Sytox بواسطة نوى خلايا الرئة المقيم قطع مفتوحة من قبل vibratome. في المثال الثاني (الشكل 2) وأبدت الرئة المصابة ، على حد سواء حيث الهياكل والسنخية وكذلك الجماهير الفطرية ، وتظهر في الزرقاء ، في حين أن نواة الملون والشباك الحمراء. المثال الثالث (الشكل 3) هو من الحيوانات المعدلة وراثيا ، اليس EGFP حيث بالإضافة إلى هياكل الزرقاء والحمراء ويمكن أيضا أن ينظر العدلات الخضراء. يظهر هجرة العدلات والبلعمة بهم من العناصر الفردية الفطرية في متواليات الفاصل الزمني في الفيلم التكميلي. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. ظهور شريحة الرئة غير المصابة في اللون - 2 - 2 الفوتون المجهري. أعد شريحة من الرئة ماوس C57/BL6 غير المصابة وتصويره كما هو موضح في البروتوكول. قطع الإشارة Sytox نوى الخلايا المقدمة هنا هي إشارة SHG هيكل الأنسجة السنخية (A) ، وفتح أثناء إعداد شريحة الرئة (B) ، وتراكب للقناتين (C). وينظر الى المنطقة محاصر في (C) الموسع في (D). يرجى ملاحظة النسيج الليفي في الجزء السفلي من الرئة شريحة بالمقارنة مع منظمة السنخية بوضوح داخل المناطق النشطة في التنفس في الرئة أعلاه. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ظهور شريحة من الرئة المصابة الرشاشية نوع الحيوان البري في اللون - 2 - 2 الفوتون المجهري. شريحة من الرئة المصابة ماوس C57/BL6 7 ساعات قبل مع أ. وقد أعد الدخناء وتصوير كما هو موضح في البروتوكول. أظهرت هو هيكل مجتمعة الفطرية وSHG الأنسجة السنخية (A) ، وإشارة Sytox من الحمض النووي المستجدة فضلا عن نواة خلية قطع مفتوحة أثناء إعداد شريحة الرئة (B) ، وتراكب للقناتين (C) . وينظر الى المنطقة محاصر في (C) الموسع في (D). يرجى ملاحظة ، يتم وضع علامة على مجالات متميزة بوضوح الجماهير الفطرية والحويصلات الهوائية ، وهياكل - NET مع الأحرف F ، A و N ، على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. ظهور شريحة من رئة حيوان الرشاشية ليز - EGFP المصابة في اللون - 3 - 2 الفوتون المجهري. شريحة من الرئة ماوس اليس - EGFP المصابة قبل 7 ساعات معوقد أعد ألف الدخناء وتصوير كما هو موضح في البروتوكول. أظهرت هو هيكل مجتمعة الفطرية وSHG الأنسجة السنخية (الأزرق) ، وإشارة Sytox نوى الخلايا وشبكات (الحمراء) ، وكذلك فضلا عن العديد من العدلات (الخضراء). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="الشكل 4" /> تكميلية الشكل 1. تثبيت الماوس لالتنبيب وبموجب Ketamin / Rompun تخدير الحيوان هو ثابت مع شريط مطاطي على أنيابها ، من أجل تسهيل التنبيب مع القسطرة الوريدية سكنى 22G. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="الشكل 5" /> تكميلية الشكل 2. التهوية الميكانيكية الماوس. مصاب الماوس intubated بواسطة تطبيق ذلك من جراثيم 7 1x10 معلق تلفزيوني في 100 ميكرولتر. وحققت زيادة توزيع الجسيمات داخل الرئة الفطرية بواسطة التهوية ميكانيكيا الماوس مصابا تنفس الحيوانات الصغيرة. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 3 تكميلية. الفص تثبيت الرئة ، وبعد إعداد الفص الرئة اليمنى يتم إصلاح الجهاز في طبق بتري عن طريق استخدام غسالة شقة مختبر الصنع التي تغطي مجموعة من المواضيع من النايلون موازية. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="الشكل 6" /> تكميلية الشكل 4. 2 الفوتون الإعداد والتصوير ، ويجري تثبيت صحن بتري تحتوي على الفص الرئة اليمنى على حصيرة التدفئة تحت المجهر 2 فوتون بعد إضافة الحمض النووي Sytox الصبغة البرتقالية. الفيلم التكميلي : العدلات العدلات المهاجرة وphagocytosing عناصر فطرية في الرئتين الرشاشية المصابة من وجهة نظر الفاصل الزمني 2 - الفوتون المجهري لسرطان الرئة الذين يعيشون ح 7 شريحة بعد الإصابة مع الفطر والأخضر ، والعناصر الفطرية وSHG والأزرق ، ونواة الخلية و هي كذلك كما هو مبين في هياكل NET الحمراء. ويظهر في الوقت الحقيقي للتجربة في أسفل اليمين. شريط يصور حجم 50 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو</a>

<ol>
	<li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo.">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8(+)+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li><li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8(+)+T+cell+responses+in+lymph+nodes.">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li><li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores.">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li><li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation.">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li><li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis.">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li><li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li><li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities.">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li><li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA.">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li><li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation.">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li><li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li><li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

وقد اكتسبت في الوقت الحقيقي 2 - الفوتون المجهري في الجسم الحي أو في الأجهزة سليمة أهمية دراسات عميقة في التعامل مع علم وظائف الأعضاء من الخلايا المناعية على مدى السنوات ال 10 الماضية. كان مع هذا الأسلوب أن أحداثا هامة مثل ديناميات تي خلية التنشيط داخل الغدد الليمفاوية مرئية لأول مرة 2-4. في الآونة الأخيرة ، بدأ الباحثون أيضا إلى تحليل وظائف محددة مثل الخلوية الخطوات الأولى في توليد خلايا الأنسجة اللمفاوية المستجيب في استخدام هذا النهج 5. ومع ذلك ، وإن كانت قد كشفت عن وجود عدد من المفاهيم البيولوجية الجديدة باستخدام هذا الأسلوب ، لا تزال هناك تحديات والمسائل الهامة التي لم تنشر دراسات intravital التصور حتى الآن. وهذا ينطبق خصوصا على الرئة الثدييات. الجانب المثير في هذا الجهاز ، وميناء الدخول لمجموعة متنوعة من العوامل الممرضة المحمولة جوا ، ويجعل منها واحدة من أهم الأسطح التي تجري العمليات المناعية في الجسم الثدييات. مع كل نسمة على مدى الحياة بأكملها ، يتم استنشاق الجزيئات غير المرغوب فيها وبعضها لديها القدرة على إحداث العدوى 6 تهدد الحياة. انه غني عن الشرح أنه في مثل هذا الموقع الحساس والمهددة بالانقراض شبكة محكمة من آليات الدفاع يحتاج إلى أن تكون موجودة في معرض ذخيرة كاملة من الاستجابات المناعية. ومن ناحية أخرى فإنه من المهم جدا ان تخضع لرقابة صارمة الكفاح ضد مسببات الأمراض التي يسببها المناعية المحتملة في مثل هذا المكان &quot;القذرة&quot;. ردود فعل مبالغ فيه من الجهاز المناعي تحمل مخاطر عالية من الإضرار التي أصابت جسده على نطاق واسع على أنسجة الجهاز تحفيز الخلايا المناعية غير محددة الإجراءات 7،8. في ضوء هذه الأفكار سيكون من المهم للغاية ومفيدة لديها إمكانية للتحقيق في سلوك الخلايا في الرئتين الثدييات تحت ظروف حقيقية في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن مثل هذا النظام حتى الآن لم تنفذ بنجاح يشير بوضوح إلى الصعوبات الهائلة التي يتعين حلها في وضع بروتوكول للعمل. التحدي الأكثر تطلبا وربما الاستقرار التركيز. في الرئة والجهاز المسؤول عن التنفس تحت الحركة المستمرة في جميع الاتجاهات الثلاثة للفضاء لتحقيق الاستنشاق. هذا الظرف وحده يسبب مشاكل خطيرة التصوير ، ويمكن اعتبار intravital التصوير &quot;كابوس&quot;. بالفعل حركة طفيفة على أي البعد في الفضاء له تأثير هائل على الرأي القائل تدهور المجهرية ، والتي تحتاج إلى أن تكون مستقرة مع الدقة ميكرومتر من أجل توليد صور ذات مغزى 9. نظرا تركيزها ضيق بطبيعته المحلية 10 ، 2 الفوتون المجهري هو أكثر حساسية لعدم الاستقرار التنسيق ، كما خلع من بنية معينة في مجموعة من ميكرومتر قليلة في Z - الاتجاه هو ما يعادل خسارة كاملة من التركيز ، وبالتالي تجربة فاشلة. بروتوكول المعروضة في هذه الدراسة لرصد الخلايا المناعية في الرئة الفئران لا يزال ليس في التطبيق الجسم الحي ، وإنما هي تقريب وثيقا بالوضع في الرئة a سليمة وظيفيا 11. فيفو النهج السابق لمفاوي والتصوير ، وعلى سبيل المثال في الليمفاوية explanted وقد تبين أن العقد ، لتسفر عن نتائج حقيقية ما يعادل 12 في الملاحظات المجراة ، وبالتالي فهي ذات أهمية كبيرة 5. في الملاحظات على الموقع في شرائح الرئة ، والتي هي الوحيدة الممكنة مع نهجنا ، تجري في الرئة المصابة بعد وقت قصير من الختان. ويكفل سلامة 3D أثناء عملية القطع agarose المصفوفة ، وهي خطوة ضرورية للسماح لعملية قطع تسيطر على وجه التحديد في الرئة. على الرغم من أنه ضروري لتبريد الرئة explanted لفترة قصيرة للسماح للتصلب المصفوفة agarose ، فمن الممكن للعودة الى الظروف الفسيولوجية للخلايا القريب بعد إعادة التدفئة وقطع من النسيج. ويظهر ذلك بوضوح من خلال البيانات المتوفرة لدينا ، الأمر الذي يوضح أنه في ظل هذه الظروف العدلات نشطة للغاية ويحمل كامل إمكاناتهم والبالعات رشيقة ، والتي هي ضرورية لإزالة فعالة للعدوى الرشاشيات الدخناء. يقومون بدوريات على أنسجة الرئة التي تمر عبر الحواجز الظهارية من أجل الوصول إلى الأجزاء الداخلية من الحويصلات الهوائية ، وعلاوة على ذلك أنها تأخذ بنشاط الجراثيم الفطرية 11. وتمثلت النتيجة الرئيسية لهذا العمل ظهور هياكل تشبه الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات) في الجهاز الرشاشية المصابة. الحقائق المستجدة هي حديثة جدا لرواية آلية الدفاع في العدلات 13. ومع ذلك ، لأن الوصف الأولي في عام 2004 ، كان عدد من الشروط الفيزيولوجية المرضية أو في النماذج الحيوانية أو البشر حيث لوحظت هذه الظاهرة أو ينقص هو زيادة انفجارية 14-16. ومن المثير للاهتمام ، وإن كان قد أمضى الكثير من العمل على هذه الهياكل من قبل جماعات مختلفة كثيرة ، لا تزال معظم التقارير على المستوى الوصفي للغاية وليس كثيرامعروف عن آلية للإفراج NET ولائحته التنفيذية. مع بروتوكول لدينا تمكنا للمرة الأولى التي تظهر الألياف NET في الرئة المصابة. وعلاوة على ذلك ، فإننا لا يمكن التدليل على أهمية المعينين حديثا العدلات فضلا عن الهياكل الجزيئية لالفطرية وقوعها أو تثبيط 11. وهذا يدل بوضوح على احتمال اسلوبنا للتحقيق في واحدة من خطوات تشكيل NET بتفصيل أكبر. يمكن للمرء التفكير على سبيل المثال إلى استخدام العدلات من الفئران خروج المغلوب مناسبة لمراقبة قدرة على تشكيل NET في نقل التجارب بالتبني. وهكذا ، على الرغم من أن الملاحظة المباشرة للهجرة العدلات من الدم المحيطي غير ممكن مع هذا النظام نظرا لعدم وصول الدم بعد explantation الجهاز ، ونحن ما زلنا نعتقد أن لدينا بروتوكول هو نهج قيمة وسهلة نسبيا للتعامل مع هذا يتيح للتصوير في وقت مبكر أو متأخر الخطوات في الدفاع المناعي ضد الالتهابات الرئوية. هذا هو ، بالتالي ، خطوة هامة نحو تحقيق هذه الظاهرة داخل الرئة في التنفس الحيوانات الحية.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

بعد الجهاز الهضمي ، وسرطان الرئة هو السطح ثاني أكبر للتفاعل بين الفقاريات الجسم والبيئة. هنا ، يجب الحفاظ على تبادل الغاز فعالة ، بينما في الوقت ذاته على تجنب الإصابة من مسببات الأمراض المتعددة التي يتم استنشاقه أثناء التنفس الطبيعي. لتحقيق ذلك ، مجموعة رائعة من استراتيجيات الدفاع الجمع بين آليات المناعة الخلوية والخلطية موجودا. أحد التدابير الأكثر فعالية للدفاع حادة في الرئة هو توظيف للعدلات التي يبلعم إما استنشاق الجراثيم أو قتلهم عن طريق الإفراج عن المواد الكيميائية السامة للخلايا. وبالإضافة إلى ذلك مؤخرا إلى ترسانة من العدلات هو الافراج عنهم من المتفجرات المستجدة الحمض النووي خارج الخلية التي يمكن من خلالها اكتشاف البكتيريا أو الفطريات أو المعطل حتى بعد الافراج عن الخلايا NET لقوا حتفهم. نقدم هنا الأسلوب الذي يسمح احد لمراقبة مباشرة العدلات ، يهاجرون داخل الرئة المصابة مؤخرا ، مسببات الأمراض الفطرية phagocytosing كذلك تصور مثل المستجدة الواسعة التي كانت قد أنتجت في جميع أنحاء الأنسجة المصابة. ويصف طريقة تحضير شرائح سميكة الرئة قابلة للحياة بعد 7 ساعات من العدوى داخل الرغامى مع الفئران غبيرات من العفن الرشاشية الدخناء ودراستها من قبل المجهري متعدد الألوان 2 - الفوتون مرور الزمن. هذا النهج يسمح احد لتحقيق دفاع مضاد مباشرة في أنسجة الرئة الأصلية وبالتالي يفتح طريقا جديدا لتحقيق مفصل من الحصانة الرئوي.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy at JoVE.com

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

نظهر ، وكيفية استخدام 2 - الفوتون المجهري لمراقبة ديناميات المحببة العدلة في الرئتين المصابين وهم يبلعم مسببات الأمراض أو إنتاج الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات).

المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K Views.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. نظهر ، وكيفية استخدام 2 - الفوتون المجهري لمراقبة ديناميات المحببة العدلة في الرئتين المصابين وهم يبلعم مسببات الأمراض أو إنتاج الفخاخ خارج الخلية العدلات (شبكات).

Video: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

البلعمه البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا في الفئران

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...