الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا نصف طرق لتقييم الحالات المبكرة للعلاج أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة. تقدم هذه التقنية كميزة رئيسية ، مما يسمح بدراسة حالات مختلفة من البلعمة الليشمانيا ومشاركة العديد من البروتينات.
تجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية يمكن أن تمتد أيضا إلى أنواع أخرى من الدراسات ، بما في ذلك العدوى بالبكتيريا والخمائر ، أو أن تبتلعها أنواع أخرى من الخلايا. يجب على الأشخاص الذين يجربون هذه التقنية الاهتمام بوقت تعرض الخلايا لمحلول Nucleofector. بالإضافة إلى ذلك ، نقترح البدء في اختبار النقل باستخدام اثنين من البلازميدات كحد أقصى.
ستوضح أماندا ريبوكاس الإجراء ، طالبة دكتوراه من مختبرنا. بادئ ذي بدء ، بذور 0.2 مليون خلية THP-1 ، أو البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية في 500 ميكرولتر RPMI لكل بئر على صفيحة 24 بئر مع أغطية زجاجية 13 ملم. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وغسل الخلايا مرتين مع 0.9٪ المالحة واحتضان الخلايا في وسط RPMI كامل.
إضافة أنواع الليشمانيا ذات مرحلة ثابتة إلى الخلايا عند 10 طفيليات هي نسبة خلية مضيفة واحدة ، ثم جهاز طرد مركزي عند 720 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، اغسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ لإزالة أي بروماستيغوتات غير داخلية. احتضن الخلايا في RPMI Medium المكمل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك، قم بتركيب أغطية الغطاء باستخدام وسائط التركيب المفضلة. ثم عد ما لا يقل عن 400 خلية في حقول عشوائية تحت المجهر الفلوري. للتحقيق في التكوين الحيوي الكهروضوئي الناجم عن الليشمانيا ، ابدأ في نقل خلايا THP-1 بالبلازميد عن طريق بذر 15 مليون خلية THP-1 في قوارير زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 75 سنتيمترا مربعا تحتوي على 10 ملليلتر من Complete RPMI Medium مع 100 نانوغرام لكل ملليلتر PMA ، و 50 ميكرومولار إلى ميركابتوإيثانول لمدة 48 ساعة.
ثم ، اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول ملحي بنسبة 0.9٪ وافصل الخلايا باستخدام محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمي. ثم ، جهاز طرد مركزي في 250 مرة غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أعد تعليق خلايا THP-1 في ملليلتر واحد من RPMI Medium وقم بإجراء العد في غرفة Neubauer.
الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى في 250 مرات غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant. أعد تعليق 2 مليون خلية في 100 ميكرولتر من محلول Nucleofector واحتضنها مع 0.5 ميكروغرام من طلاء البلازميد للبروتين محل الاهتمام ، الموسومة ببروتين الفلورسنت. انقل التعليق الذي يحتوي على خلايا THP-1 والحمض النووي إلى كوفيت Nucleofector.
ثم ، قم بنقل الخلايا باستخدام برنامج Nucleofector Y one. استرجع الخلايا والبذور المنقولة في 500 ميكرولتر من RPMI Medium على 24 لوحة بئر مع أغطية زجاجية 13 ملم. احتضان الخلايا وإكمال RPMI المتوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 و 2 و 4 و 6 و 12 و 24 ساعة.
اترك الغطاء الزجاجي 13 ملم في درجة حرارة الغرفة وقم بحمايته من الضوء قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستحواذ. تنظيف الأغطية بأنسجة ماصة. بعد ذلك ، أضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف ، ثم أضف الشريحة.
حرك الهدف لأعلى حتى يلامس الزيت الشريحة. مراقبة وضبط التركيز على المجهر واختيار الخيار 63x الهدف مع النفط. افتح برنامج LIQA واضبط أشعة الليزر في الأطوال الموجية 488 و 552 و 405.
حدد دقة الصورة ك 1024 × 1024. بعد النقر فوق الزر المباشر ، اضبط مكدس Z واضغط على خيار البدء. انتظر الحصول على الصورة ثم حدد الخيار ، الحد الأقصى للإسقاط ، في الأدوات.
احفظ التجربة، وقم بتصدير صور بتنسيق TIFF إلى جهاز كمبيوتر. أظهرت النتائج أن كلا من Leishmania Braziliensis LCL ، و Leishmania Braziliensis DL ، يرتبطان بالمثل بالبلاعم. أيضا ، لم يلاحظ أي اختلافات فيما يتعلق Leishmania Braziliensis LCL و Leishmania Braziliensis DL البلعمة بواسطة الخلايا المضيفة.
تمت مقارنة تجنيد LC3 في الفجوة الطفيلية ، أو PV ، التي تسببها Leishmania Braziliensis LCL أو Leishmania Braziliensis DL ، في الخلايا المصابة. بعد أربع ساعات من العدوى ، لوحظت نسب مماثلة من PV المزينة LC3 في Leishmania Braziliensis LCL و Leishmania Braziliensis DL المصابة بالبلاعم. وهكذا ، أظهرت النتائج أن Leishmania Braziliensis LCL و Leishmania Braziliensis DL يتفاعلان بالمثل مع البلاعم أثناء الربط ، البلعمة ، والتكوين الحيوي للخلايا الكهروضوئية فيما يتعلق بتجنيد LC3.
أظهرت الصور المجهرية التمثيلية كفاءة نقل خلايا THP-1 باستخدام بلازميدات PLC-GFP و Rab5-GFP و Rab7-GFP. يجب على الأشخاص الذين يحاولون هذا البروتوكول الانتباه إلى حضانة درجة الحرارة وحماية عينات المجهر من الضوء ، وجميع الأنواع. إن تعديل التعبير عن البروتينات المحددة التي تعجل بالبلعمة الليشمانيا سيوضح أهمية تلك البروتينات في نتائج عدوى الليشمانيا.
يمكننا توسيع هذه التقنية نحو أنواع مختلفة من دراسات علم الأمراض والآليات المرتبطة بإنشاء الطفيليات وتحديد الأهداف لتطوير الاستراتيجيات العلاجية.
