وتزرع نباتات نيكوتيانا benthamiana في غرفة التحكم في درجة حرارته النمو عند 25 درجة مئوية. وتستعمل أوراق صحية موسعة تماما من النباتات القديمة 3-6 الاسبوع. نصيحة : يمكن الحصول على أفضل النتائج باستخدام أوراق الناشئة حديثا 1. الأجرعية بروتوكول تسلل عابرة : اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات متتالية آغار LB / ريفامبيسين (25 ميكروغرام / مل) / الكانامايسين (100 ميكروغرام / مل) مع مخزون من الجلسرين المورمة الأجرعية (سلالة LBA4404) التي تحتوي على النواقل المناسبة مع الجينات (ق) إلى أن يعاير لموت الخلايا ، والتي تحتوي على النواقل الكاسيت GUS تحت المروج التأسيسية. وتشمل دائما مكافحة ناقلات فارغة كعنصر تحكم سلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 2 ايام. </li></ol> اليوم 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 2 مل من LB تحتوي ريفامبيسين (25 ميكروغرام / مل) ، والكانامايسين (100 ميكروغرام / مل) مع مستعمرة واحدة من كل رطل / ريفامبيسين / الكاناميسين وحة يشوبه سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل ثقافة عن طريق هز عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بسرعة 200 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى أقصى كثافة النمو. </li></ol> ويلاحظ أحيانا التثاقل ، في حال الثقافات التي تحتاج إلى أن يكون معلق تماما (أي pipetting صعودا وهبوطا) قبل المتابعة : تلميح. اليوم 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التالية الحضانة ، وزيادة الحجم الإجمالي إلى 10 مل مع LB الطازجة (التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة) وacetosyringone (نهائي تركيز 25 ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل ثقافة عن طريق هز عند 28 درجة مئوية لمدة ساعة 16. </li></ol> 5 أيام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي يغسل كل ثقافة مرتين عن طريق إضافة 10 مل (لا تضيف acetosyringone) متوسطة التسلل (10 ملي MgSO 4 0.7 H 2 O ، MES 9 ملم ، ودرجة الحموضة 5.6) وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خطوة الطرد النهائي ، resuspend كل ثقافة في المتوسط ​​5 مل تحتوي على تسلل acetosyringone (100 ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس ل 600Nm OD ، وقياسات بين 0.1 و 0.9 مقبولة. نصيحة : قد استخدمت من OD ل 600Nm منخفضة مثل 0.1 دون مشكلة ، ومع ذلك ، قد تنتج المواد المستنفدة للأوزون أعلى نتائج أكثر اتساقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الثقافات لمزيد من 3 ساعات للتحضير للثقافات الأجرعية للعدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خليط الثقافات التي تحتوي على الجين (ق) ليتم تحليلها ومراقبة سلبية (الأجرعية تحتوي على ناقلات الفارغة) في نسبة 1:1 مع ثقافة الكاسيت التي تحتوي على GUS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختراق مجافي المحور (تحت) بجانب يترك الناشئة حديثا باستخدام 1 مل إبرة حقنة أقل (الشكل 1). نصيحة : إخترق كل من خليط السيطرة السلبية (ناقلات فارغة + GUS الكاسيت) والتي تحتوي على خليط من الجينات أن يعاير (الجينات X GUS كاسيت +) على أوراق الآخر من نفس النبات. استخدام النباتات ثلاث نسخ عن كل معاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلل 3 أيام بعد تسلل المكوس أوراق ومقايسة للتعبير البروتين GUS. </li></ol> 2. مقايسة النسيجية GUS اليوم 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فراغ اختراق المتوسطة ركيزة X - الغلوكوز في أوراق استئصاله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو حتى تلوين الزرقاء مميزة تظهر. </li></ol> اليوم 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في المياه المقطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الايثانول 70 ٪ حتى تتم إزالة الكلوروفيل ، ثم نقل إلى الماء المقطر مرة أخرى. تقييم مستويات التعبير بصريا GUS. </li></ol> 3. Fluorometric MUG مقايسة : اليوم 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل بروتين مجموع طحن أقراص أوراق تسللت في بمدافع الهاون باستخدام النيتروجين السائل. إضافة 100 UL العازلة من استخراج GUS (50 ملي NaPi الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 10 ملي EDTA ، 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، 0.1 ٪ N - lauroylsarcosine ملح الصوديوم ، β - المركابتويثانول (0.7 ميكروليتر / مل) مع الحفاظ على عينة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق العمل في أجهزة الطرد المركزي 14000 ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 واتخاذ طاف والبروتين الذائبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز باستخدام nanodrop وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تركيز البروتين إلى 100 ميكروغرام من البروتين الذائبة لكل عينة باستخدام GUS العازلة الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الركيزة MUG (4 - methylumbelliferyl - β - D - غلوكورونيد هيدرات) التي أعدت في استخراج العازلة GUS إلى تركيز النهائي من 2 ملم. وينبغي أن يكون الحجم الإجمالي من 100 ميكرولتر لكل عينة (بروتين + الركيزة MUG) قد يكون كافيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ردود الفعل لاحتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف ردود الفعل من خلال إضافة 800 ميكرولتر من GUS وقف عازلة (0.2 م نا 2 CO 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان باستخدام قارئ لوحة في طول موجي 365 نانومتر من الإثارة وانبعاث موجة من 455 نانومتر وقارن بين القيم إلى منحنى معيارا MU. تقرير مستويات النشاط وGUS مجموع MU / ميكروغرام nmol ذوبان البروتين / دقيقة. </li></ol> 4. الأسهم والحلول : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetosyringone (1 م) سهم (FW = 196.2 ز) </الفرعي&gt; -- 0.981 غرام في 5 مل من DMSO </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكانامايسين (100 ملغ / مل) المخزون -- إعداد درهم في 2 0 -- فلتر تعقيم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريفامبيسين (25 ملغ / مل) المخزون -- إعداد في DMSO </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوريا ، Bertani النمو السائل (LB) وسائل الإعلام : (1L) 1 ٪ (W / V) bacto - تريبتون ، 10 ز 0.5 ٪ (W / V) bacto ، خلاصة الخميرة ، 5 ز 170 كلوريد الصوديوم 10 مم ز الحموضة -- 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetosyringone (25 ميكرومتر) = 25 ميكرولتر من مخزون M 1 في النهائي لحجم 1 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسطة تسلل : (1L) 10 ملي MgSO 4 2 0 0.7 درهم (FW = 246،48 ز) و 2.4648 ز 9 ملم زارة التربية والعلم (FW = 213،25 ز) ، 1.91925 ز الحموضة -- 5.6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetosyringone (100 ميكرومتر) = 100 ميكرولتر من مخزون 1M في الحجم النهائي من 1 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GUS استخراج الاحتياطي 50 ملي NaPi الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 10 ملي EDTA ، 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، 0.1 ٪ N - lauroylsarcosine ملح الصوديوم ، β - المركابتويثانول (0.7 ميكروليتر / مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2X الفوسفات عازلة ناه 0.2M 2 ص 4 و 0.2 م 2 نا هبو 4 درجة الحموضة 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> X - الحلاوة ركيزة الحل حل 1 ملغ من 5 - 4 - برومو كلورو - 3 - BD - indolyl غلوكورونيد (X - الغلوكوز) في الميثانول مل 0.1. إضافة 1 مل من الفوسفات 2X العازلة ، 20 ميكرولتر فيري سيانيد البوتاسيوم 0.1M ، 10μl تريتون X - 100 10 و 850 ٪ من المياه المقطرة ميكرولتر. </li></ol> 5. ممثل النتائج : بعد هذا البروتوكول ، ومن المتوقع فقدان التعبير GUS عندما يحدث موت الخلايا. أعربنا في الوقت نفسه على الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) مع أحد أعضاء Arabidopsis خلوي واقية بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) الأسرة. شاركنا في تسلل N. benthamiana يترك مع 35S مدفوعة BAG الكاسيت التعبير وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 السلالة. وكما هو مبين في الشكل 2 ، لاحظ زيادة ملحوظة في تلطيخ GUS بعد هذا التسلل. على العكس ، عندما كان يعرف الموالي لأفكارك عضوا من عائلة بي سي إل 2 استخدمت BAX ، لوحظ انخفاض ملحوظ في تلطيخ GUS (الشكل 2). في كل حالة من هذه الحالات ، كانت مختلفة بشكل واضح GUS التعبير بالمقارنة مع السيطرة. ومع ذلك ، عند الاختلاف في التعبير هو أقل وضوحا ، يمكن إجراء فحوصات MUG fluorometric لquanitate GUS التعبير. <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. مثال على مزيج الأجرعية تسلل من الجانب مجافي المحور ن. benthamiana يترك باستخدام 1 مل إبرة حقنة أقل. <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. وكان شارك في ناقلات GUS التي أعرب عنها في ن. benthamiana يترك مع الجينات المضادة للموت ، ومحفز معروف من موت الخلية. وتمت مقارنة مستويات GUS لمكافحة ناقلات فارغة (GUS التحكم).

<ol>
	<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUS+fusions:+,+&#946;-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">GUS fusions: , &#946;-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).</li><li>Nishihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+&#946;-Glucuronidase+Gene+in+Pollen+of+Lily+(Lilium+longiflorum),+Tobacco+(Nicotiana+tabacum),+Nicotiana+rustica,+and+Peony+(Paeonia+lactiflora)+by+Particle+Bombardment.">Expression of the &#946;-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment.</a> Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).</li><li>Hodal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Science. 87, 115-115 (1992).</li><li>Kabbage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAG+proteins:+a+ubiquitous+family+of+chaperone+regulators.">The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators.</a> Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).</li><li>Kang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtBAG6,+a+novel+calmodulin-binding+protein,+induces+programmed+cell+death+in+yeast+and+plants.">AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants.</a> Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).</li><li>Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).</li><li>Takayama, S., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+targeting+and+regulation+by+BAG+family+proteins.">Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins.</a> Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).</li><li>Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+BAG-1:+a+novel+Bcl-2-binding+protein+with+anti-cell+death+activity.">Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity.</a> Cell. 80 (2), 279-279 (1995).</li><li>Vitha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+&#946;-glucuronidase+assay+in+transgenic+plants.">Quantitative &#946;-glucuronidase assay in transgenic plants.</a> Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).</li><li>Otha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Expression+in+Tobacco+of+a+&#946;-Glucuronidase+(GUS)+Reporter+Gene+Containing+an+Intron+Within+the+Coding+Sequence.">Construction and Expression in Tobacco of a &#946;-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence.</a> Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<p class="jove_content"&gt; غالبا ما يكون من الصعب استخدام تقنيات الكشف عن خلية الموت في النباتات التي هي مشتركة في نظم الثدييات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقدم محطة يستند إلى طريقة حساسة لاكتشاف وتحليل اللاعبين موت الخلية. هذا الأسلوب يستفيد من حقيقة بسيطة وهي أن هناك حاجة الخلايا الحية للتعبير عن المكتب المركز?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> ريفامبيسين </td><td> VWR </td><td> IC19549001 </td><td> 25mg/mL الأسهم في DMSO </td></tr><tr><td> 4&#39; هيدروكسي 3 &#39;، 5&#39; - dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) </td><td> VWR </td><td> TCD2666 </td><td> 0.981 غرام / مليلتر في DMSO (1M الأسهم) </td></tr><tr><td> 2 -- (4 - morpholino) مونوهيدرات حامض ethanesulfonic (MES) </td><td> VWR </td><td> EM - 6110 </td><td> 1.92 غرام / لتر في الماء لجعل 1 لتر من وسائل الإعلام تسلل </td></tr><tr><td> Bacto - تريبتون </td><td> الصياد </td><td> BP1421 - 2 </td><td> 10G / لتر في الماء لجعل 1 لتر من المتوسط ​​LB </td></tr><tr><td> Bacto ، خلاصة الخميرة </td><td> VWR </td><td> EM1.03753.0500 </td><td> 5G / لتر في الماء لجعل 1 لتر من المتوسط ​​LB </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> VWR </td><td> EM - 7710 </td><td> 10G / لتر في الماء لجعل 1 لتر من المتوسط ​​LB </td></tr><tr><td> مونوهيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة </td><td> VWR </td><td> MK - 7868-12 </td><td> 2.5G / لتر في الماء لصنع 50mM من NaPi العازلة </td></tr><tr><td> ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم heptahydrate </td><td> VWR </td><td> EMD - SX0715 - 1 </td><td> 5G / لتر في الماء لصنع 50mM من NaPi العازلة </td></tr><tr><td> سلفات المغنيزيوم heptahydrate </td><td> VWR </td><td> EM - MX0070 - 1 </td><td> 2.5 غرام / لتر في الماء لجعل 1 لتر من وسائل الإعلام تسلل </td></tr><tr><td> N - Lauroylsarcosine </td><td> VWR </td><td> TCL0151 - 500G </td><td> 0.1 ٪ V / V عازلة في GUS </td></tr><tr><td> 5 - 4 - برومو كلورو - 3 - إندوكسيل بيتا - D - غلوكورونيد الملح cyclohexylammonium (X - الحلاوة) </td><td> الذهب التكنولوجيا الحيوية </td><td> G1281C </td><td> 1mg/100uL في الميثانول 100 ٪ </td></tr><tr><td> - 4 - Methylumbelliferyl μ - D - غلوكورونيد هيدرات (القدح) </td><td> سيغما </td><td> M5664 </td><td> 2 مم في 100 UL العازلة من استخراج GUS </td></tr><tr><td> فيروسيانيد البوتاسيوم هيدرات </td><td> VWR </td><td> EM - PX1460 - 1 </td><td> 100mM الأسهم عن حل الركيزة X - الحلاوة </td></tr><tr><td> β - Methylumbelliferone (MU) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M1381 </td><td> MU لاستخدام منحنى القياسية العازلة استخراج GUS </td></tr><tr><td> كربونات الصوديوم </td><td> VWR </td><td> EM - SX0395 - 11 </td><td> 0.2 M في الماء لصنع GUS وقف العازلة </td></tr></tbody></table>

a &#946;-glucuronidase (gus) based cell death assay

وقد طورنا رواية التعبير محطة عابرة في وقت واحد يعبر عن نظام الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) ، مع المنظمين المفترضين الإيجابية أو السلبية لموت الخلية. في هذا النظام ، N. ويترك benthamiana المشترك تسللت مع الكاسيت التي تحتوي على التعبير مدفوعة 35S الجين لتحليلها ، وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 سلالة كوسيلة. لأن هناك حاجة الخلايا الحية للتعبير GUS تحدث ، ومن المتوقع فقدان النشاط GUS عند هذا الجين علامة المشترك مع المنظمين وأعرب الإيجابية للموت الخلية. على قدم المساواة ، وزيادة النشاط GUS لوحظ عند استخدام الجينات المضادة للأفكارك مقارنة مكافحة النواقل. كما هو مبين أدناه ، وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح في المختبر لتحليل كل من اللاعبين المؤيدة والمناهضة للموت. وتشمل هذه المحطة لمكافحة أفكارك بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) عائلة ، فضلا عن المعروف محرضات الثدييات من موت الخلايا ، مثل BAX. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا هذا النظام لتحليل وظيفة فاة truncations محددة داخل البروتينات ، التي يمكن أن تقدم أدلة على تعديل محتمل في مرحلة ما بعد متعدية / تفعيل هذه البروتينات. هنا ، نقدم طريقة سريعة والنباتات الحساسة القائمة ، كخطوة أولية في التحقيق في وفاة وظيفة للجينات معينة.

Watch this Scientific Journal Video about A Î²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay at JoVE.com

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

موت الخلايا المبرمج المقايسات التي يشيع استخدامها في نظم الثدييات مثل الحمض النووي أو المقايسات laddering النفق ، وغالبا ما يصعب استنساخها في النباتات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقترح السريع ، ومحطة عابرة مقايسة يستند إلى تحليل خصائص الموت المحتملة للجينات معينة.

A β غلوكورونيداز (GUS) موت الخلية استنادا الفحص

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

a-glucuronidase-gus-based-cell-death-assay

Research

JoVE Journal

Biology

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

27.9K Views.  Texas A&M University. موت الخلايا المبرمج المقايسات التي يشيع استخدامها في نظم الثدييات مثل الحمض النووي أو المقايسات laddering النفق ، وغالبا ما يصعب استنساخها في النباتات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقترح السريع ، ومحطة عابرة مقايسة يستند إلى تحليل خصائص الموت المحتملة للجينات معينة....

Video: A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely used in conjunction with Annexin V to determine if cells are viable, apoptotic, or necrotic through differences in plasma membrane integrity and permeability1,2. The Annexin V/ PI protocol is a commonly used approach for studying apoptotic cells3. PI is used more often than other nuclear stains because it is economical, stable and a good indicator of cell viability, based on its capacity to exclude dye in living cells 4,5. The ability of PI to enter a cell is dependent upon the permeability of the membrane; PI does not stain live or early apoptotic cells due to the presence of an intact plasma membrane 1,2,6. In late apoptotic and necrotic cells, the integrity of the plasma and nuclear membranes decreases7,8, allowing PI to pass through the membranes, intercalate into nucleic acids, and display red fluorescence 1,2,9. Unfortunately, we find that conventional Annexin V/ PI protocols lead to a significant number of false positive events (up to 40%), which are associated with PI staining of RNA within the cytoplasmic compartment10. Primary cells and cell lines in a broad range of animal models are affected, with large cells (nuclear: cytoplasmic ratios &lt;0.5) showing the highest occurrence10. Herein, we demonstrate a modified Annexin V/ PI method that provides a significant improvement for assessment of cell death compared to conventional methods. This protocol takes advantage of changes in cellular permeability during cell fixing to promote entry of RNase A into cells following staining. Both the timing and concentration of RNase A have been optimized for removal of cytoplasmic RNA. The result is a significant improvement over conventional Annexin V/ PI protocols (&lt; 5% events with cytoplasmic PI staining).

An accurate method for the assessment of cell death is described. The protocol improves upon conventional Annexin V/ propidium iodide (PI) protocols, which display up to 40% false- positive events in cell lines and primary cells from a broad range of animal models.

تعديل Annexin الأبوطوزيس التأيد V / Propidium الفحص للحصول على تقييم دقيق للموت الخلية

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

تعديل الجذعية الجنينية الماوس الفحص خلية مقرها لقياس كفاءة قلبية التعريفي

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ultimately kill. Such A/B toxins generally consist of an enzymatically active Asubunit (e.g., ricin toxin A (RTA)) and one or more cell binding Bsubunit(s), which are responsible for toxin binding to specific cell surface receptors. Our current knowledge of how A/B toxins are capable of efficiently intoxicating cells helped scientists to understand fundamental cellular mechanisms, like endocytosis and intracellular protein sorting in higher eukaryotic cells. From a medical point of view, it is likewise important to identify the major toxin trafficking routes to find adequate treatment solutions for patients or to eventually develop therapeutic toxin-based applications for cancer therapy.
Since genome-wide analyses of A/B toxin trafficking in mammalian cells is complex, time-consuming, and expensive, several studies on A/B toxin transport have been performed in the yeast model organism Saccharomyces cerevisiae. Despite being less complex, fundamental cellular processes in yeast and higher eukaryotic cells are similar and very often results obtained in yeast can be transferred to the mammalian situation.
Here, we describe a fast and easy to use reporter assay to analyze the intracellular trafficking of RTA in yeast. An essential advantage of the new assay is the opportunity to investigate not only RTA retro-translocation from the endoplasmic reticulum (ER) into the cytosol, but rather endocytosis and retrograde toxin transport from the plasma membrane into the ER. The assay makes use of a reporter plasmid that allows indirect measurement of RTA toxicity through fluorescence emission of the green fluorescent protein (GFP) after in vivo translation. Since RTA efficiently prevents the initiation of protein biosynthesis by 28S rRNA depurination, this assay allows the identification of host cell proteins involved in intracellular RTA transport through the detection of changes in fluorescence emission.

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

In the manuscript, we describe the use of a yeast-based fluorescence reporter assay to identify cellular components involved in the trafficking and killing processes of the cytotoxic A subunit of the plant toxin ricin (RTA).

مقايسة مراسل المستندة إلى الأسفار بسيطة لتحديد المكونات الخلوية اللازمة للريسين سلسلة (RTA) الاتجار بالخميرة

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

الفحص القائم على المجهر لدراسة وتحليل الإندوسومات المعاد تدويرها باستخدام الاتجار في SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather changes, various pesticides, pathogens, and malnutrition, mainly entering through the mouth and primarily affecting the digestive tracts of adult bees. To understand and prevent the effects of such external and internal stressors on honeybees, one useful research method is the immunohistochemical method. A basic protocol is described to prepare the midgut (ventriculus) and hypopharyngeal glands (HPGs) of adult bees for histological analysis. A detailed methodology is described to assess the level of cell damage and distinguish necrosis from programmed cell death (apoptosis) as a natural process of tissue regeneration. The results of adult honeybee treatment with oxalic acid and pesticides (insecticide and acaricide) and the determination of cell death in the ventriculus and HPGs are presented. The pros and cons of the methodology are also discussed.

Immunohistochemical methods are useful in honeybee research to detect and assess the level of apoptosis and necrosis in the midgut and hypopharyngeal glands of adult bees.

أساسيات الأنسجة واكتشاف موت الخلايا في أنسجة نحل العسل

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous research indicated that multiple pathways could mediate the spontaneous death of neutrophils. A cocktail was developed by simultaneously targeting these pathways, caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor (CLON-G), which prolonged the neutrophil lifespan to greater than 5 days without significantly compromising the neutrophil function. Concurrently, a reliable and stable protocol for assessing and evaluating neutrophil death was also developed. In this work, we show that CLON-G can prolong the neutrophil lifespan in vitro to more than 5 days, and we exhibit the lengthening of the neutrophil lifespan with FACS and confocal fluorescence microscopy. This report introduces procedures for the preparation of CLON-G and showcases an in vitro spontaneous death assay of neutrophils, which can be used for the study of neutrophils and for subsequently interrogating neutrophil death, thus providing a reliable resource for the neutrophil community.

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

This protocol details the preparation of CLON-G to extend the neutrophil lifespan to greater than 5 days and provides a reliable procedure for evaluating neutrophil death with flow cytometry and confocal fluorescence microscopy.

تمديد عمر العدلات مع CLON-G ومقايسة الموت التلقائي في المختبر

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

القياس الكمي لبدء موت الخلايا من خلال التصوير المستمر

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

تسليط الضوء على المؤلف: نهج مبسط لدراسة بدء موت الخلايا في استجابة شديدة الحساسية 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

دراسة بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...