آليات إصلاح الحمض النووي مهمة جدا للحفاظ على سلامة الجينوم في جميع الكائنات الحية. Uracil-DNA glycosylase هو بروتين حاسم لإصلاح الحمض النووي في مسار إصلاح الأنسجة الأساسي. باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF ، يمكننا الكشف مباشرة عن منتج AP لفحص نشاط الإنزيم.
يتطلب فحص الجليكوسيلاز التقليدي عمل الركيزة. هذه الطريقة خالية من الملصقات وتكتشف مباشرة تغير الكتلة من ركيزة اليوراسيل إلى منتج AP. وتشمل المزايا الأخرى الدقة العالية والتنوع وقابلية التوسع والسرعة وسهولة الأداء.
لقد استخدمنا E.coli uracil-DNA glycosylase كمثال. يمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة لفحوصات جليكوزيلاز الحمض النووي الأخرى. ومن الضروري وجود موظفين مدربين تدريبا جيدا في المختبر يتمتعون بمهارات دقيقة في السحب والتخفيف.
يجب استخدام الكواشف الطازجة والمخازن المؤقتة منخفضة الملح للحصول على إشارات أفضل وضوضاء خلفية أقل. سيوضح الإجراء هوي لان تشانغ ، طالب الدكتوراه من مختبري. لفحص جليكوزيلاز الحمض النووي باستخدام الركيزة الحاملة لقاعدة الجوانين يوراسيل من T1 U + 9 duplex ، أضف 70 ميكرولتر من الماء ، و 10 ميكرولترات من 10X uracil-DNA glycosylase أو المخزن المؤقت لتفاعل UDG ، وخمسة ميكرولترات من مخزون T1 ، وخمسة ميكرولترات من مخزون U + 9 في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر.
أغلق الأنبوب قبل احتضانه في حمام مائي لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، تليها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وأخيرا على الجليد لمدة ثلاث دقائق لضمان التلدين السليم لقالب الركيزة على الوجهين. بعد ذلك ، في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر ، أضف 49 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل UDG البارد المثلج وميكرولتر واحد من UDG المخفف ، ثم قم بإعداد تخفيفات تسلسلية باستخدام المخزن المؤقت UDG لتركيزات الإنزيم المطلوبة ووضع UDG المخفف على الجليد. بعد ذلك ، في أنبوب آخر سعة 1.5 ملليلتر ، أضف تسعة ميكرولترات من مزيج الركيزة المحضر وقم بتسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية ، ثم أضف ميكرولتر واحد من UDG المخفف وقم بتحريك الأنبوب لخلط المحتويات.
قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لخليط التفاعل ووضع الأنبوب على الفور للحضانة عند 37 درجة مئوية. استخدم المؤقت لتوقيت التفاعل. لإنهاء التفاعل ، قم بإعداد 0.25 حمض الهيدروكلوريك المولي و 0.23 محلول قاعدة تريس المولي.
استخدم مقياس الأس الهيدروجيني لتأكيد الرقم الهيدروجيني عند تحضير الكاشف واختباره بواسطة شريط الأس الهيدروجيني قبل تشغيل خطوة إنهاء التفاعل ، ثم قم بتحمض 10 ميكرولترات من tris-EDTA مع ميكرولتر واحد من 0.25 حمض الهيدروكلوريك المولي وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني حوالي اثنين زائد أو ناقص 0.5. قم بتحييد المحلول باستخدام ميكرولتر واحد من قاعدة tris وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني النهائي حوالي 6.5 زائد أو ناقص 0.5. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من 0.25 حمض الهيدروكلوريك المولي إلى خليط التفاعل لتعطيل الإنزيم ووضع الأنبوب على الجليد لمدة ست دقائق ، ثم أضف ميكرولتر واحد من قاعدة تريس لتحييد منتجات الحمض النووي وتجنب كسر موقع AP عن طريق التعرض المطول للحمض.
بعد إضافة 13 ميكرولتر من tris-EDTA لزيادة حجم خليط المنتج لنقل رقاقة المصفوفة ، ضع الأنبوب على الجليد. أخيرا ، انقل جميع منتجات تفاعل UDG البالغة 25 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي الدقيق إلى لوحة ميكروتيتر 384 بئرا. افتح باب موزع النانولتر وقم بتحميل لوحة microtiter 384 بئر على حامل اللوحة في سطح السفينة ، ثم أدخل صفيف رقاقة المصفوفة في موضع لوحة الكشافة المقابلة.
ضع لوحة الكشافة المحملة على سطح المعالجة الخاص بموزع النانولتر وأغلق الباب. المس زر التشغيل على شاشة النقل وانتظر حتى يبدأ الجهاز في توزيع العينات من لوحة microtiter إلى شريحة المصفوفة. بعد ذلك ، باستخدام خيار علامة تبويب الرؤية ، اعرض صورة الشريحة ووحدات التخزين الموزعة لكل بقعة أثناء التوزيع.
تأكد من أن الحجم المرقط على الشريحة يتراوح بين خمسة إلى 10 نانولترات. باستخدام برنامج التطبيق المناسب ، قم بإعداد ملف xlsx يحتوي على قيمة الإشارة المتوقعة M × Z للاستيراد. ثم استخدم البرنامج التطبيقي لإنشاء فحص UDG جديد وتعريفه بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الخيار استيراد مجموعة المقايسة بتنسيق مصمم وتحديد ملف Excel من القائمة المنسدلة.
بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق زر لوحة مشروع العميل وانقر فوق الجزء العلوي من شجرة الخيارات المنسدلة لإنشاء لوحة فحص جديدة. ثم في مربع الحوار، اكتب اسم ملف. وفي القائمة المنسدلة نوع اللوحة، حدد نوع اللوحة 384 بئرا.
اضغط على موافق ( OK) وانتظر حتى تظهر لوحة فارغة على يسار الشاشة. بعد ذلك ، انقر فوق خيار الفحص وحدد الفحص من القائمة المنسدلة. لتعيين المقايسة المحددة لكل موضع بقعة عينة على اللوحة، حرك المؤشر إلى كل موضع من مواضع اللوحة الفارغة، وانقر لتمييز البئر، وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد إضافة لويحات.
باستخدام كمبيوتر سطح مكتب أو كمبيوتر محمول، قم بإعداد قائمة عمل بتنسيق xlsx بدون رأس لجميع العينات الموجودة على الشريحة، ثم انقر فوق الزر إضافة نموذج مشروع جديد وحدد الملف من القائمة المنسدلة لاستيراد قائمة العمل. ابحث عن جميع رموز عينة الاختبار في قائمة العمل على يسار الشاشة، ثم انقر فوق نموذج التعليمات البرمجية في قائمة العمل وانقر بزر الماوس الأيمن على الموضع المقابل للوحة لربط الاختبارات بكل موضع. اضغط على زر الإدخال/الخروج من مطياف الكتلة لتمديد سطح السفينة وإخراج حامل الشريحة.
أدخل شريحة العينة في حامل الرقاقة ، وضع حامل الشريحة المحملة على السطح الممتد واضغط على زر الدخول / الخروج مرة أخرى حتى تدخل شريحة العينة إلى الأداة. في برنامج التحكم في مطياف الكتلة، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز الاكتساب. في نافذة الاستحواذ، انقر فوق علامة التبويب التشغيل التلقائي لبدء تشغيل الجهاز والحصول على أطياف الكتلة من العينات الموجودة على الشريحة.
لتحليل البيانات ، قم بتشغيل برنامج تحليل البيانات ، ثم تصفح شجرة قاعدة البيانات وحدد معرف الشريحة.انقر لتمييز هدف جيدا على الشريحة وانقر فوق رمز الطيف لإظهار الطيف الكتلي. انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار مربع حوار التخصيص واقتصاص نطاق طيف معين في نافذة جديدة، ثم انقر فوق المحور x لكتابة الحدود العليا والسفلية ل M by Z واضغط على موافق لإظهار طيف النطاق المحدد بما في ذلك إشارات الاهتمام. لقياس ارتفاع الذروة للإشارات M by Z القيم المقابلة لركيزة uracil ومنتج AP والقالب ، انقر فوق الذروة وعرض ارتفاع الذروة في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.
أخيرا ، لحفظ الطيف لحفظ السجلات ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق تصدير وحدد نوع الملف بتنسيق JPEG في القائمة المنسدلة. انقر فوق الوجهة وتصفح القرص لتحديد جهاز التخزين في القائمة المنسدلة ، ثم اكتب اسم الملف وانقر على تصدير. يظهر هنا النظام النموذجي لفحص جليكوزيلاز الحمض النووي.
بقي الحمض النووي لقالب النيوكليوتيدات ال 19 دون تغيير بعد التحلل المائي للجليكوزيلاز. لذلك ، يمكن أن تكون الإشارة بمثابة مرجع لقياس كمية منتج AP. أنتج اختلاف نيوكليوتيد واحد بين الركيزة والقالب المقابل ملف تعريف إشارة منفصل جيدا لكليهما.
كما تم فصل إشارة منتج AP بشكل جيد عن إشارة الركيزة المحتوية على اليوراسيل. بالنسبة لتحليل بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد، تم قياس ارتفاعات الذروة. أظهر تحليل الدورة الزمنية لنشاط UDG عند 0.01 و 0.02 و 0.05 و 0.1 اعتمادا على الجرعة والوقت.
يظهر هنا مثال على مخطط معدل التفاعل مع كثافة إشارة MS النسبية للمنتج والركيزة بتركيزات نانومولاري. يتم تقديم معدل تفاعل UDG على أنه نانومول من موقع AP المنتج في الثانية الواحدة. تم حساب KM و VMAX من مؤامرة Lineweaver Burk.
كانت وحدة قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF متناسبة مع الوحدة المحددة من 0.001 وحدة إلى 0.02 وحدة مع معامل تحديد ملحوظ. يظهر هنا تثبيط نشاط UDG بواسطة مثبط اليوراسيل غليكوزيلاز. في وجود 100 بيكومول من المثبط ، تم تثبيط نشاط 0.05 وحدة من UDG إلى مستوى لا يمكن اكتشافه ووجد أن IC50 هو 7.6 بيكومول.
نظرا لأن حجم AP قابل للتحلل ويمكن تحلله بواسطة تفاعل التخلص من بيتا عند درجة الحموضة القصوى ودرجة الحرارة المرتفعة ، يجب إجراء تبريد الفحص على الجليد للفترة المحددة. أيضا ، استخدم مقياس الأس الهيدروجيني للتأكد من أن HCL يحمض المخزن المؤقت للتفاعل إلى الرقم الهيدروجيني المطلوب وقاعدة tris تحييد خليط المنتج بشكل صحيح. يمكن أيضا تعديل هذه الطريقة لتحليل جليكوزيلاز الحمض النووي ثنائي الوظيفة.
على سبيل المثال ، U + 2 T3 هي ركيزة مناسبة لفحص جليكوزيلاز الحمض النووي فورماميدوبيريميدين. يمكن بسهولة اكتشاف منتجات الانقسام لنشاط FPG AP ligase بواسطة كتلة MALDI-TOF. هذه الطريقة لديها القدرة على أن تصبح الطريقة المرجعية لقياس الجليكوسيلاز أحادي الوظيفة ويمكن استخدامها أيضا كأداة لفحص مثبطات الجليكوسيلاز لتطوير المستحضرات الصيدلانية.
