We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

1. خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خلايا الخميرة بعامل نمائي المناسبة، مثل Try467 (الجدول 2)، مع البلازميد التي تحتوي على (أ) URA3 -degron الانصهار و (ب) علامة الأيض إضافية لاختيار البلازميد والصيانة. ملاحظة: مثال على البلازميد هو مناسبة YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) وهذا هو الخميرة بلازميد التكاملي تحتوي على البروتين الانصهار تتألف من Deg1 - وهو degron المستمدة من النسخ الخميرة. عامل Mat2 17، حاتمة FLAG - للكشف من قبل immunoblotting، Vma12 - بروتين ER مستقر، وUra3 15،18 (الشكل 3A). (انظر الجدول 3 لالبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة وللحصول على أمثلة إضافية من البلازميدات مناسبة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختيار البلازميد والصيانة، والحفاظ على الخلايا في لوحات أجار تحت الاصطناعية مناسبة معينة (SD) المتوسطة تفتقر علامات اختيار الأحماض الأمينية <sتصل&gt; 19 (على سبيل المثال، يتم تحديد Deg1 -UV وحافظت تحت SD-LYS سائل الإعلام الانتقائي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا O / N عند 30 درجة مئوية في المتوسط ​​SD انتقائية مناسبة لصيانة بلازميد حتى يتم التوصل إلى مرحلة ثابتة. تنمو الخلايا في أنابيب اختبار أو في لوحة 96-جيدا، اعتمادا على عدد من العينات المراد فحصها (القسم 2). </li></ol> 2. إعداد الخلايا لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم يعاير عدد قليل من عينات (N≤15)، وتمييع الخلايا واستبدال المتوسطة على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 50 ميكرولتر من الخلايا من O / N ثقافة مع 150 ميكرولتر من SD المتوسطة لكل بئر في 96-جيدا لوحة (قاع واضح). ملاحظة، يتم تعيين العينة الأولى كما يحتوي فارغا المتوسطة فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد القيم OD 600 من العينات في 96 لوحة جيدا باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب OD الفعلي 600 في كل بئر بضرب القراءة OD 600 من قبل عامل التخفيف (X4)، من ذوي الخوذات البيضاءICH قيمة القراءة فارغة يتم طرح. تطبيع القيم الناتجة بتقسيم بنسبة 0.55 في الحصول على احتساب مسار بطول 1 سم وفقا للقانون بير لامبرت. ملاحظة هذه القيمة ثابتة عند قياس OD 600 من 200 ميكرولتر من الخلايا في القياسية لوحة 96-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حجم الذي تحتاجه للحصول على خلايا الخميرة بمبلغ يعادل 600 OD 0.25 وتحويلها إلى أنبوب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل الخلايا بسرعة عالية (12،000 x ج) لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسط ​​انتقائية المناسب (انظر القسم 3.1) للحصول على OD 600 0.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 200 ميكرولتر من سلالات المخفف لبئر جديد في لوحة 96-جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم اختبار عدد كبير من العينات (ن&gt; 15)، وتمييع الخلايا واستبدال وسيط وبدون سابق قياس OD 600، على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 ميكرولتر من خلايا ثابتةنمت O / N في لوحة 96-جيدا في لوحة 96 بئر جديدة تحتوي على 190 ميكرولتر (تخفيف 1:20) من وسائل الإعلام انتقائية مناسبة (انظر القسم 3.1). </li></ol></li></ol> 3. حركية النمو في الثقافة السائل تحت شروط انتقائية (GiLS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وسائل الإعلام التالية لقياس النمو باستخدام مراسل Ura3-degron: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن الضوابط الإيجابية للنمو الخميرة تحت ظروف غير مقيدة، واستخدام البلازميد وسائل الإعلام الانتقائي SD (انظر القسم 1.2). إذا كان مطلوبا أي اختيار البلازميد، على سبيل المثال، عند استخدام البلازميد التكاملي مثل Deg1 -UV، SD متوسطة تحتوي على جميع الأحماض الأمينية الضرورية (SD الكامل) يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينات تجريبية قياس النمو في ظل ظروف مقيدة، استخدم SD-URA المتوسطة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القارئ المتعدد صفيحة ميكروسكوبية ل: درجة حرارة الحضانة من 30 درجة مئوية، OD 600 فترات قياس 15 دقيقة، ودورات المدارية والخطية تهتز من 1 دقيقة كل سبع دقائق &lt;ر /&gt; ملاحظة: هذا الوضع المزدوج تم تحسين يهز الحصول على توزيع متجانس للخلايا. ومع ذلك، وسائط اهتزاز أخرى أو حتى أي اهتزاز قد تعمل أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية في قارئ صفيحة ميكروسكوبية O / N أو حتى وصلت إلى مرحلة خلايا ثابتة (12-24 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات الخام إلى ملف جدول البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حركية نمو الخميرة باستخدام MDTcalc، وهو برنامج مخصص تقوم بحساب الوقت الحد الأدنى (في ساعة) للخلايا لمضاعفة حجم سكانها (الحد الأدنى مضاعفة الوقت (MDT)؛ لمزيد من التفاصيل انظر القسم 4). </li></ol> 4. احتساب الحد الأدنى مضاعفة الوقت (MDT): مبادئ MDTcalc خوارزمية ملاحظة: مبادئ خوارزمية MDTcalc، وذلك باستخدام عينة من خلايا الخميرة Try467 (الجدول 2) نمت في SD وسائل الإعلام كاملة، ويوضح الجدول (1) والشكل (1)، مما يدل على جداول البيانات والنمو المؤامرات، respecنسبيا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح OD 600 القيم الفارغة، التي تم الحصول عليها في البئر المعنية، من كل من القراءات التي تم الحصول عليها في العينة جيدا. تقسيم الفروق الناتجة بنسبة 0.55 (لوحات 96-جيدا) لتصحيح طول مسار الضوء. رسم القيم النهائية (الجدول 1، العابرة.) مع الزمن لإنتاج منحنى نمو الخميرة الفعلي (OD 600 / ساعة) (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل حساب 2 (OD 600) لكل من القيم تحولت إلى تحويل مرحلة النمو اللوغاريتمي في منحنى خطي (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المنحدر من فاصل 10 نقطة زمنية (N = 10) ابتداء من الساعة 0 وتتحرك مرة واحدة نقطة في كل مرة إلى N &lt;10 (الجدول 1، المنحدر، الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب قيمة معكوس كل منحدر من الحصول على الوقت اللازم للسكان الخلية لمضاعفة (الجدول 1، 1 / المنحدر، الشكل 1C). حساب الحد الأدنى1 / القيمة المنحدر لتحديد MDT (الجدول 1، المستطيل الأسود، الشكل 1C). استخراج MDT يحسب للخلايا في العينة (الجدول 1، 1 / المنحدر، مستطيل أسود) من الفاصل الزمني المحدد (الجدول رقم 1، التي حددها مستطيل أحمر، أرقام 1B، 1D). ملاحظة: معدل نمو الخلايا في SD-URA المتوسطة يتناسب عكسيا مع هذا الدواء. </li></ol> 5. باستخدام MDTcalc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ ملفات البرنامج تستكمل في مجلد معين في الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من حفظ ملف جدول البيانات التي تحتوي على بيانات النمو ومغلقة. فتح برنامج تطبيق MDTcalc أن نرى بداية ظهور الشاشة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج المعلومات المطلوبة، كما هو موضح في الشكل رقم 2: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;مسار الملف&quot;، انقر فوق مستطيل على اليمين لتحديد موقع ملف جدول البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت &quot;اسم ورقة&quot;، وكتابة اسم جدول حيث tانه يقع البيانات الخام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;وضع البداية، إدراج جدول تنسيق الوقت 0 من العينة الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;عمود الوقت، إدراج الرسالة تحديد موقع العمود نقطة زمنية (ينبغي توفير الوقت بالثواني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;عمود فارغ، إدراج الرسالة تحديد موقع العمود فارغة (عادة ولكن ليس بالضرورة في بئر A1 من لوحة 96-جيدا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;قيمة OD&quot;، اختر الحد الأدنى تحولت OD 600 القيمة المطلوبة لبدء MDT حساب (عادة 0،15-0،25). تعيين هذه القيمة يمنع حسابات MDT للثقافات في مرحلة متخلفة بسبب التخفيف المفرط بحيث يتم احتساب هذا الدواء فقط للعينات التي تصل إلى 600 OD محددة القيمة أو أعلى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تم إدخال القيمة الأخيرة، اضغط على زر &quot;حساب&quot; في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من أن شريط التقدم على اليمين يتغير تدريجيا إلى زreen. لا فتح ملف جدول البيانات أثناء عملية حسابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير مجموعتين من البيانات التي تظهر تلقائيا على الشاشة عند الانتهاء من حساب MDT في جدول بيانات. تأكد من أن البيانات تشمل ما يلي: (أ) قيمة MDT لكل بئر يمر اختبار الحد الأدنى من قيمة OD (كما هو مبين في القسم 5.2.1.6) و (ب) نقطة زمنية الأولية للفترة التي تم احتساب مليون دينار تونسي (البداية الوقت). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li><li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis.">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li><li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+and+the+cell+cycle:+with+this+RING+I+do+thee+destroy.">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li><li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT&#945;2+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Degradation signal masking by heterodimerization of MAT&#945;2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility.">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li><li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates.">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li><li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes.">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., &amp; Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li><li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses.">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li><li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms:+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast.">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li><li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope/endoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation.">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li><li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways.">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li><li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li><li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator:+the+yeast+2+repressor.">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li><li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery.">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).</li><li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins.">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li><li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation.">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li><li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family.">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics.">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li><li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

نحن هنا تصف مقايسة على أساس نمو الخلايا لتحديد النسبية معدلات تدهور البروتين، وتسمى &quot;حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية&quot; (GiLS). الفحص GiLS ديها العديد من المزايا: انها بسيطة لإعداد، والحصول على البيانات وتحليل واضح وصريح وهو نموذجي للغاية. وبالتال...

نظام تدهور اليوبيكويتين-بروتوزوم هو آلة التنظيمية الرئيسية، والتي تورطت في الحفاظ على توازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. يو بي إس تقارن البداية جزيئات اليوبيكويتين متعددة لبروتين بعد الهدف الذي تتدهور البروتين بولي اليوبيكويتين الموسومة من قبل بروتوزوم 26S. في معظم الحالات، فإن معدل الحد خطوة لاليوبيكويتين بوساطة التحلل هو الركيزة ubiquitylation بوساطة E2 التصريف الإنزيمات والإنزيمات E3 ligating (E3 Ligases) 1. بالتالي، الاستقرار داخل الخلايا بروتينات معينة تعكس قابليتها للاليوبيكويتين-الاقتران ونشاط الانزيمات وما شابه ذلك ubiquitylation بهم. ligases E3 هي مكونات التعرف على الركيزة الرئيسية لشركة يو بي إس. على هذا النحو، وهذه الانزيمات تعترف degrons ضمن الركائز التي هي إما غائبة أو لم تتعرض في نظرائهم مستقرة 2. على سبيل المثال، العديد من المنظمين دورة الخلية مأوست يتم توليفها وتدهورت بطريقة محددة زمنيا من أجل الحفاظ على تقدم دورة الخلية في النظام. وغالبا ما تسيطر على تدهور هذه البروتينات من خلال الفسفرة، بوساطة الخلايا، مما يشير إلى تحركات التنظيم 3،4. من ناحية أخرى، يتم التعرف على البروتينات مطوية aberrantly من خلال degrons خفي. وهذه هي المناطق التي تكون مخفية عادة في البنية الأصلية ويتعرضون على هيكل الاضطراب. وتشمل مجالات مثل degrons مسعور 5-7 وشرائح المختلين جوهريا 8. منذ اكتشاف المنوي للنظام اليوبيكويتين لتدهور البروتين وتوصيف العوامل الأساسية في الخلايا الشبكية 9 لست]، وكانت الوراثة الخميرة مفيدة في اكتشاف العديد من مكونات النظام اليوبيكويتين 10. هو نجاح الخميرة كما كائن نموذج لتحليل منهجي من تدهور البروتين من قبل شركة يو بي إس يرجع ذلك أساسا إلى كون يو بي إس هي عاليةلاي المحفوظة في جميع حقيقيات النوى 4، إلى جانب قابليته على كنظام تجريبي. في الواقع، وتستخدم النظم القائمة على الخميرة عادة إلى فك آليات عمل آلية ubiquitylation. دراسة تحلل البروتين عن طريق البيوكيميائية وعادة ما يتطلب إعداد مقتطفات الخلية. بينما بروتينات الخلية الحيوانية يمكن استخراجه تحت ظروف معتدلة نسبيا التي تحافظ على تفاعلات البروتين وظيفة، وجود جدار الخلية قوية في الخميرة 11 يتطلب أقسى بكثير الظروف التي قد تؤثر على تعطيل الانتعاش البروتين. في الواقع، وإجراءات مختلفة لتعطيل خلية الخميرة تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها على استعادة بروتينات سليمة في المبالغ التي تمثل الوفرة النسبية الخلوية الخاصة بهم بشكل صحيح. مزيد من الدقة متأصلة في الطرق المختلفة المستخدمة لتحديد معدلات تدهور للبروتينات محددة: تجارب &quot;نبض مطاردة&quot; الاستقلابية القائم على العلامات تليها ايمmunoprecipitation، لعزل بروتينات معينة 12، في كثير من الأحيان لا الكمية بدقة. وبالتالي، عندما تتم مقارنة تدهور البروتين بواسطة هذه الطريقة، ينبغي توخي الحذر في تفسير النتائج. للتحايل على هذا العيب، وهو سيكلوهيكسيميد البديل (فروج) مطاردة الفحص ويمكن استخدام 12. في هذا الاختبار، يتم إضافة مثبط الترجمة إلى مزارع الخلايا والتغيرات الزمانية في مستويات بروتين ثابت للدولة يتم رصدها في وقت لاحق. ومع ذلك، فإن استخدام فروج يقتصر على البروتينات مع عمر نصف قصيرة نسبيا (&lt;90 دقيقة)، وكبت طويل الأجل لتخليق البروتين السامة للخلايا. والجدير بالذكر أن كلا من المقايسات المذكورة أعلاه تتطلب استخدام الأجسام المضادة بروتين معين، والتي ليست متاحة دائما. للتغلب على هذه القيود التقنية، فقد طور الباحثون العديد من الأساليب التي لا تتطلب استخراج الخلايا والبروتين التعامل المباشر. ويستند نهج واحد بشأن إنشاء نعم العوز الغذائيسلالات الواحد، التي حصلت عليها حذف الجينات التي تكود الإنزيمات الأيضية الأساسية. وتشمل هذه الجينات HIS3، LEU2، LYS2 وTRP1، ترميز الإنزيمات اللازمة لالحيوي من الأحماض الأمينية، فضلا عن URA3 أن يشفر المرصد المغربي للسجون كربوكسيل (Ura3)، وهو إنزيم أساسي من البيريميدين ريبونوكليوتيد الحيوي. وقد Ura3 تستخدم على نطاق واسع في الدراسات تدهور البروتين. في هذه المقايسات والتعبير التأسيسية للUra3 ينقذ نمو الخلايا ura3 في واليوراسيل نقص المتوسطة 13. بالتالي زعزعة استقرار Ura3 من خلال الانصهار من degron يمكن أن يقلل من نمو الخلايا في الحد الأدنى من المتوسط ​​تفتقر اليوراسيل. وقد استخدم هذا الأسلوب في مختلف الدراسات تدهور البروتين، بما في ذلك تحديد تدهور محددات 5، E3 ligases 14 و 15 مساعد عوامل ubiquitylation واكتشاف UPS رواية degrons 16. كل من هذه الأساليب المستخدمة نمو الخلايا على لوحات أجار كما فحص قراءات. ومع ذلك، رانه معيار النمو (الإيجابي / النمو السلبي)، في حين قوية وفعالة، هي في معظمها النوعية وليس الكمية توفير المعلومات التي من المهم لتقييم فعالية وdegron أو المساهمة النسبية لمختلف العوامل تدهور المساعدة. لذا قمنا بتطوير وتستخدم ناقلات الخميرة وطرق الفحص تمكين التحليل المنهجي والكمي للتدهور البروتين بواسطة URA3 -degron نظام الانصهار. ويستند البروتوكول على الفحص سهلة لمقبض الذي يقيس حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية (GiLS) وعلى الجيل من منحنيات النمو القياسية. وتتميز حركية نمو الخميرة قبل ثلاث مراحل رئيسية - تأخر والأسي (سجل) ومرحلة ثابتة. حساب حركية تكرار الخميرة خلال مرحلة السجل ظل ظروف انتقائية، والتي يتم تحديدها من خلال مستويات التعبير عن Ura3-degron، يوفر متحيز قياس الكمي سو تدهور البروتين. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على قياس ومقارنة معدلات تدهور ركائز UPS متعددة في وقت واحد في سلالات متعددة وتحت ظروف مختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:184px;">Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td rowspan="6" style="width:339px;">For yeast growth on SD minimal media.&#160; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>16325</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino acids</td>
			<td>Highest purity available&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">96 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">167008</td>
			<td>Any other compatible brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Cyclohexamide&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Sigma - Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>Working conc. 0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Infinite 200 PRO series</td>
			<td style="width:149px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">MDTcalc</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Experimental software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

تدهور البروتين من قبل النظام اليوبيكويتين-بروتوزوم (UPS) هو آلية تنظيمية رئيسية لتوازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. المنهج المعياري لتحديد تدهور البروتين داخل الخلايا يعتمد على فحوصات البيوكيميائية لمتابعة حركية انخفاض البروتين. مثل هذه الأساليب غالبا ما تكون شاقة وتستغرق وقتا طويلا وبالتالي غير قابلة للتجارب تهدف إلى تقييم ركائز متعددة، وتدهور الأوضاع. كبديل، تم إعداد المقايسات المعتمدة على نمو الخلايا، التي هي، في الشكل التقليدي، المقايسات نقطة النهاية التي لا يمكن تحديد كميا التغيرات النسبية في مستويات البروتين. نحن هنا تصف طريقة التي يحدد بأمانة التغيرات في معدلات تدهور البروتين اقتران لهم الخميرة خلية حركية النمو. وتستند هذه الطريقة على نظام اختيار أنشئت حيث -deleted اليوراسيل auxotrophy من URA3 هو انقاذ خلايا الخميرة عن طريق البروتين مراسل أعرب خارجيا، تتألف من مزيج بين الجينات URA3 أساسيا ومحددا تدهور (degron). تم تصميم هذا البروتين مراسل بحيث معدل تخليق لها هو ثابت في حين يتم تحديد معدل التدهور من قبل degron. كما نمو الخلايا في واليوراسيل نقص المتوسطة يتناسب مع المستويات النسبية للUra3، حركية النمو تعتمد كليا على تدهور البروتين المراسل. هذه الطريقة يقيس بدقة التغيرات في الخلايا الحركية تدهور البروتين. تم تطبيقه على: (أ) تقييم المساهمة النسبية للعوامل التصريف اليوبيكويتين المعروف أن التحلل البروتيني (ب) E2 انزيم التصريف هيكل وظيفة تحليلات (ج) تحديد وتوصيف degrons الرواية. تطبيق نظام URA3 المستندة degron- يتجاوز مجال تدهور البروتين، كما يمكن أيضا أن تتكيف مع التغييرات رصد مستويات البروتين المرتبط ظائف مسارات الخلوية الأخرى.

التحقيق في دور الانزيمات من المسار Doa10 في تدهور ركيزة مراسل لاختبار صحة طريقة GiLS تم مقارنته مقايسة تدهور التقليدي. هذه التجربة تقيم المساهمة النسبية لمكونات غشاء ER محلية Doa10-E3 يغاز مجمع 20،21 إلى تدهور مراقبة الجودة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation at JoVE.com

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Video: Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

نظام الزراعة المائية المشتركة للتحليل المتزامن والمنهجي للتفاعلات الجزيئية النباتية / الميكروبية والتشوير

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

تحليل دقيق والفائق للنمو البكتيري

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...