Nicotiana benthamiana Pflanzen werden in einem temperierten Klimakammer bei 25 ° C gewachsen. Voll ausgebaut gesunde Blätter von 3-6 Wochen alten Pflanzen verwendet werden. Tipp: Bessere Ergebnisse werden mit neu entstehenden Blättern gewonnen 1. Agrobacterium vorübergehende Infiltration Protokoll: Tag 1 <ol><li> Streak LB / Rifampicin (25 ug / ml) / Kanamycin (100 ug / ml) Agarplatten mit Glycerin Aktien von Agrobacterium tumefaciens (Stamm LBA4404) mit den entsprechenden Vektoren mit dem Gen (s) zum Zelltod untersucht werden und der Vektor mit den GUS-Kassette unter einem konstitutiven Promotor. Enthalten immer eine leere Vektor-Regelung als negative Kontrolle. </li><li> Inkubation bei 28 ° C für 2 Tage. </li></ol> Tag 3 <ol><li> Inoculate 2 ml LB mit Rifampicin (25 ug / ml) und Kanamycin (100 ug / ml) mit einer einzelnen Kolonie von jeder LB / Rifampicin / Kanamycin Platte zuvor gestreift. </li><li> Inkubieren jede Kultur durch Schütteln bei 28 ° C für 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis ein maximales Wachstum Dichte erreicht ist. </li></ol> Tipp: Horstig ist manchmal zu beobachten, in welchem ​​Fall Kulturen gründlich resuspendiert werden (dh Auf-und Abpipettieren), bevor Sie fortfahren müssen. Tag 4 <ol><li> Nach der Inkubation erhöht das Gesamtvolumen auf 10 ml mit frischem LB (mit den entsprechenden Antibiotika) und Acetosyringon (Endkonzentration 25 uM). </li><li> Inkubieren jede Kultur durch Schütteln bei 28 ° C für weitere 16 Stunden. </li></ol> Tag 5 <ol><li> Am nächsten Tag waschen jede Kultur zweimal durch Zugabe von 10 ml (fügen Sie keine Acetosyringon) Infiltration Medium (10 mM MgSO 4 .7 H 2 O, 9 mM MES, pH 5,6) und zentrifugieren bei 4000 xg für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach dem letzten Zentrifugationsschritt resuspendieren jede Kultur in 5 ml Medium mit Infiltration Acetosyringon (100 uM). </li><li> Messen Sie die OD 600nm, werden die Messungen zwischen 0,1 und 0,9 zulässig. Tipp: OD 600nm von nur 0,1 ohne Probleme verwendet wurden, können jedoch auch höhere OD produzieren mehr konsistente Ergebnisse. </li><li> Inkubieren Sie die Kulturen weitere 3 Stunden auf die Agrobacterium Kulturen zur Infektion vorzubereiten. </li><li> Mix Kulturen, die das Gen (s) zu analysieren und die Negativ-Kontrolle (Agrobacterium mit dem leeren Vektor) in einem Verhältnis von 1:1 mit der Kultur, die das GUS-Kassette. </li><li> Infiltrate der abaxialen (unter-) Seite neu entstehenden Blätter mit einer 1 ml nadellose Spritze (Abb. 1). Tipp: Infiltrate sowohl die Negativ-Kontrolle-Gemisch (Leervektor + GUS-Kassette) und die Mischung, die das Gen zu untersuchenden (Gen x + GUS-Kassette) auf gegenüberliegenden Blätter der gleichen Pflanze. Verwenden Sie dreifach Pflanzen für jede Behandlung. </li><li> 3 Tage nach Infiltration Verbrauchsteuern infiltriert Blätter und Assay für GUS-Protein-Expression. </li></ol> 2. Histochemische GUS-Test Tag 8 <ol><li> Vacuum infiltrieren die X-Gluc Trägermedium in die ausgeschnittene Blätter. </li><li> Inkubieren im Dunkeln über Nacht bei Raumtemperatur oder bis deutliche Blau-Färbung erscheint. </li></ol> Tag 9 <ol><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> Inkubieren in 70% Ethanol bis Chlorophyll entfernt wird, dann Transfer zum destilliertem Wasser wieder. Optisch bewerten GUS-Expression Ebenen. </li></ol> 3. Fluorometric MUG-Assay: Tag 8 <ol><li> Isolieren gesamten Proteins durch Schleifen infiltriert Blattscheiben in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff. Add 100 uL der GUS-Extraktionspuffer (50 mM NaPi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-Lauroylsarcosin Natriumsalz, β-Mercaptoethanol (0,7 ul / ml), während die Probe auf Eis. </li><li> Centrifuge Suspension bei 14.000 g für 5 min bei 4 ° C und nehmen Überstand als Gesamt-lösliches Protein. </li><li> Measure-Konzentration mit Hilfe eines NanoDrop nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Passen Sie die Protein-Konzentration auf 100 ug Gesamt-lösliches Protein für jede Probe mit GUS-Extraktionspuffer. </li><li> Add MUG Substrat (4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid Trihydrat) in GUS-Extraktionspuffer zu einer Endkonzentration von 2 mM hergestellt. Ein Gesamtvolumen von 100 mL pro Probe (Protein + MUG Substrat) sollte ausreichend sein. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktionen für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Stop-Reaktionen durch Zugabe von 800 ul GUS Stop Puffer (0,2 M Na 2 CO 3). </li><li> Messen Sie mit einem Fluoreszenz-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 455 nm und Werte vergleichen zu einem MU Standardkurve. Bericht Ebenen der GUS-Aktivität als nmol MU / ug gesamte lösliche Protein / min. </li></ol> 4. Stocks and Solutions: <ol><li> Acetosyringon (1 M) Aktie (FW = 196,2 g) </sub&gt; - 0,981 g in 5 ml DMSO </li><li> Kanamycin (100 mg / ml) auf Lager - in dH vorbereiten 2 0 - Filter sterilisieren </li><li> Rifampicin (25 mg / ml) auf Lager - in DMSO vorbereiten </li><li> Luria-Bertani (LB) flüssige Nährmedien: (1L) 1% (w / v) Bacto-Trypton, 10 g 0,5% (w / v) Bacto-Hefeextrakt, 5 g 170 mM Natriumchlorid 10 g pH - 7 </li><li> Acetosyringon (25 nM) = 25 ul einer 1 M Stammlösung in einem Endvolumen von 1 ml </li><li> Infiltration Medium: (1L) 10 mM MgSO 4 .7 dH 2 0 (FW = 246,48 g), 2,4648 g 9 mM MES (FW = 213,25 g), 1,91925 g pH - 5,6 </li><li> Acetosyringon (100 uM) = 100 ul einer 1M Lager in einem Endvolumen von 1 ml </li><li> GUS-Extraktionspuffer 50 mM NaPi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-Lauroylsarcosin Natriumsalz, β-Mercaptoethanol (0,7 ul / ml) </li><li> 2x Phosphatpuffer 0,2 M NaH 2 PO 4 und 0,2 M Na 2 HPO 4 pH 7 </li><li> X-Gluc Substrat-Lösung 1 mg 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl bD-Glucuronid (X-Gluc) in 0,1 ml Methanol. 1 ml 2x Phosphat-Puffer, 20 ul 0,1 M Kaliumferricyanid, 10 &amp;mgr; l Triton X-100 10% und 850 ul destilliertes Wasser. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nach diesem Protokoll ist der Verlust der GUS-Expression zu erwarten, wenn Zelltod eintritt. Wir haben gleichzeitig das Reporter-Gen, β-Glucuronidase (GUS) mit einem Mitglied des Zyto-Schutz Arabidopsis Bcl-2 assoziierte athanoGene (BAG) Familie zum Ausdruck gebracht. Wir co-infiltriert N. benthamiana Blätter mit einem 35S angetrieben BAG Expressionskassette und die GUS-Vektor pCAMBIA 2301 unter Verwendung von Agrobacterium LBA4404. Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurde eine sichtbare Steigerung der GUS-Färbung nach dieser Infiltration beobachtet. Umgekehrt, wenn die bekannten pro-apoptotischen Mitglied der Bcl-2 Familie BAX verwendet wurde, war eine deutliche Reduktion der GUS-Färbung beobachtet werden (Abb. 2). In beiden Fällen wurde GUS-Expression sichtbar anders im Vergleich zur Kontrollgruppe. Allerdings, wenn der Unterschied im Ausdruck weniger offensichtlich ist, kann fluorometrische MUG-Assays durchgeführt, um GUS-Expression quanitate werden. <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Beispiel Agrobacterium Mischung Infiltration der abaxialen Seite des N. benthamiana Blätter mit einer 1 ml nadellose Spritze. <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. A GUS-Vektor wurde in N. co-exprimiert benthamiana Blätter mit dem Anti-Todes-Gen, und ein bekannter Induktor von Zelltod. GUS-Spiegel wurden in ein leeres Vector-Regelung (GUS Kontrolle) verglichen.

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	<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUS+fusions:+,+&#946;-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">GUS fusions: , &#946;-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).</li><li>Nishihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+&#946;-Glucuronidase+Gene+in+Pollen+of+Lily+(Lilium+longiflorum),+Tobacco+(Nicotiana+tabacum),+Nicotiana+rustica,+and+Peony+(Paeonia+lactiflora)+by+Particle+Bombardment.">Expression of the &#946;-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment.</a> Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).</li><li>Hodal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Science. 87, 115-115 (1992).</li><li>Kabbage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BAG+proteins:+a+ubiquitous+family+of+chaperone+regulators.">The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators.</a> Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).</li><li>Kang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtBAG6,+a+novel+calmodulin-binding+protein,+induces+programmed+cell+death+in+yeast+and+plants.">AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants.</a> Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).</li><li>Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).</li><li>Takayama, S., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+targeting+and+regulation+by+BAG+family+proteins.">Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins.</a> Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).</li><li>Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+BAG-1:+a+novel+Bcl-2-binding+protein+with+anti-cell+death+activity.">Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity.</a> Cell. 80 (2), 279-279 (1995).</li><li>Vitha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+&#946;-glucuronidase+assay+in+transgenic+plants.">Quantitative &#946;-glucuronidase assay in transgenic plants.</a> Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).</li><li>Otha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+Expression+in+Tobacco+of+a+&#946;-Glucuronidase+(GUS)+Reporter+Gene+Containing+an+Intron+Within+the+Coding+Sequence.">Construction and Expression in Tobacco of a &#946;-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence.</a> Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Es ist oft schwierig, den Zelltod Nachweisverfahren in Pflanzen, die häufig in Säugetier-Systemen verwenden. In Kombination mit einem GUS-Reporter-System präsentieren wir ein auf pflanzlicher Basis, empfindliche Methode zum Nachweis und zur Analyse von Zelltod Spieler. Diese Methode nutzt die Tatsache, dass lebende Zellen für GUS-Expression auftreten, sind erforderlich. Um sicherzustellen, aussagekräftige Ergebnisse und Wiederholbarkeit, ist es entscheidend, dass die Kulturen beherbergen die GUS-Kassette und das...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Rifampicin </td><td> VWR </td><td> IC19549001 </td><td> 25mg/ml Lager in DMSO </td></tr><tr><td> 4&#39;-Hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-Dimethoxyacetophenon (Acetosyringon) </td><td> VWR </td><td> TCD2666 </td><td> 0,981 g / mL in DMSO (1M Lager) </td></tr><tr><td> 2 - (4-Morpholino) ethansulfonsäure Monohydrat (MES) </td><td> VWR </td><td> EM-6110 </td><td> 1,92 g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L der Infiltration Medien </td></tr><tr><td> Bacto-Trypton </td><td> Fischer </td><td> BP1421-2 </td><td> 10g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L LB-Medium </td></tr><tr><td> Bacto-Hefeextrakt </td><td> VWR </td><td> EM1.03753.0500 </td><td> 5g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L LB-Medium </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> VWR </td><td> EM-7710 </td><td> 10g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L LB-Medium </td></tr><tr><td> Mononatriumphosphat Monohydrat </td><td> VWR </td><td> MK-7868 bis 12 </td><td> 2,5 g / L in Wasser zur Herstellung von 50mm Puffer NaPi </td></tr><tr><td> Natriumdihydrogenphosphat Heptahydrat </td><td> VWR </td><td> EMD-SX0715-1 </td><td> 5g / L in Wasser zur Herstellung von 50mm Puffer NaPi </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfatheptahydrat </td><td> VWR </td><td> EM-MX0070-1 </td><td> 2,5 g / L in Wasser zur Herstellung von 1 L der Infiltration Medien </td></tr><tr><td> N-Lauroylsarcosin </td><td> VWR </td><td> TCL0151-500G </td><td> 0,1% v / v in GUS-Puffer </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-Chlor-3-Indoxyl-beta-D-Glucuronid Cyclohexylammoniumsalz (X-Gluc) </td><td> Gold-Biotechnologie </td><td> G1281C </td><td> 1mg/100uL in Methanol 100% </td></tr><tr><td> 4-Methyl-μ-D-Glucuronid-Hydrat (MUG) </td><td> Sigma </td><td> M5664 </td><td> 2 mM in 100 uL der GUS-Extraktionspuffer </td></tr><tr><td> Kaliumferrocyanid Trihydrat </td><td> VWR </td><td> EM-PX1460-1 </td><td> 100 mM Stammlösung für X-Gluc Substrat-Lösung </td></tr><tr><td> β-Methylumbelliferon (MU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1381 </td><td> Für MU Standardkurve verwenden GUS-Extraktionspuffer </td></tr><tr><td> Natriumcarbonat </td><td> VWR </td><td> EM-SX0395-11 </td><td> 0,2 M in Wasser zur Herstellung von GUS Anschlagpuffer </td></tr></tbody></table>

a &#946;-glucuronidase (gus) based cell death assay

Wir haben eine neue vorübergehende Anlage Ausdruck System, das gleichzeitig Ausdruck der Reportergen β-Glucuronidase (GUS), mit vermeintlichen positive oder negative Regulatoren des Zelltods entwickelt. In diesem System, N. benthamiana Blätter sind mit einer 35S angetrieben Expressionskassette enthält das Gen analysiert werden co-infiltriert, und die GUS-Vektor pCAMBIA 2301 unter Verwendung von Agrobacterium LBA4404 als Vehikel. Da lebende Zellen benötigt werden für die GUS-Expression auftritt, ist der Verlust der GUS-Aktivität zu erwarten, wenn dieses Markergen wird mit positiven Regulatoren des Zelltods co-exprimiert. Ebenso erhöhte GUS-Aktivität beobachtet wird, wenn anti-apoptotischen Gene im Vergleich zu den Vektor-Steuerung verwendet werden. Wie unten gezeigt, haben wir erfolgreich dieses System in unserem Labor verwendet, um sowohl pro-und anti-death-Spieler zu analysieren. Dazu gehören die Anlage anti-apoptotischen Bcl-2 assoziierte athanoGene (BAG) Familie, sowie bekannte Säugetier-Induktoren von Zelltod, wie BAX. Darüber hinaus haben wir dieses System verwendet, um den Tod in Abhängigkeit von bestimmten Verkürzungen innerhalb Proteinen, die Hinweise auf die mögliche posttranslationale Modifikation / Aktivierung dieser Proteine ​​könnte zu analysieren. Hier präsentieren wir eine schnelle und empfindliche Pflanzen basierende Methode, als einen ersten Schritt bei der Untersuchung des Todes Funktion bestimmter Gene.

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A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Der programmierte Zelltod-Assays häufig in Säugetier-Systemen wie DNA laddering oder TUNEL-Assays, sind oft nur schwer in Pflanzen zu reproduzieren. In Kombination mit einem GUS-Reporter-Systems, schlagen wir eine schnelle, auf pflanzlicher Basis transienten Assay, um das Potenzial der Tod Eigenschaften bestimmter Gene zu analysieren.

Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

a-glucuronidase-gus-based-cell-death-assay

Research

JoVE Journal

Biology

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

27.9K Aufrufe.  Texas A&M University. Der programmierte Zelltod-Assays häufig in Säugetier-Systemen wie DNA laddering oder TUNEL-Assays, sind oft nur schwer in Pflanzen zu reproduzieren. In Kombination mit einem GUS-Reporter-Systems, schlagen wir eine schnelle, auf pflanzlicher Basis transienten Assay, um das Potenzial der Tod Eigenschaften bestimmter Gene zu analysieren.