وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث الأعمال الصغيرة الابتكار من المعاهد الوطنية للصحة (NIAID ، 1R43AI082698 - 01) وزارة الزراعة معهد الوطني للأغذية والزراعة (NIFA ، 2009-33610-20028).

1. Y. طاعون وحة التلقيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط Y. طاعون A1122 (BeiResources # NR15) الثقافات الأسهم على لوريا ، Bertani (LB) آغار (ميلر). استخدام تقنية معقمة ، وتأدية جميع Y. طاعون التلاعب في نوع من الدرجة الثانية ومجلس الوزراء. السلامة الأحيائية Y. طاعون A1122 هو مستوى السلامة الأحيائية (BSL) 2 استبعاد عامل تحديد سلالة. انها تفتقر الى كل من الزوج 75 كيلوبايت منخفضة الكالسيوم الاستجابة (LCR) الفوعة البلازميد ، وموضع PGM التي مطلوبة من أجل الفوعة. تنمو Y. طاعون حتى 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في درجة حرارة ثابتة للرقابة الجوية الحاضنة. معدل نمو Y. طاعون بطيئة مع الوقت جيل من 1.25 ح 9. </li></ol> 2. Y. طاعون سائل الإعلام التلقيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل احد Y. طاعون مستعمرة في العقيمة 17 × 100 ملم تحتوي على أنبوب الثقافة 2 مل من مرق LB باستخدام التلقيح المعدنية المعقمة الحلقة. حدد مستعمرة يكون موحدا في حجمها ، ويدل على مستعمرات أخرى ، ويفصل بوضوح من بقية المستعمرات على طبق من ذهب. دوامة أنبوب لفترة وجيزة وتنمو ثقافة في 28 درجة مئوية لمدة حوالي 20 ساعة في حاضنة تهتز (225 دورة في الدقيقة). </li></ol> 3. Y. ثمرة طاعون ، بالإضافة مراسل فج ، والكشف bioluminescent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Y. بين عشية وضحاها طاعون 1:20 الثقافة في مرق LB العذبة في أنبوب 50 مل الصقر (على سبيل المثال ، 500 ميكرولتر من الخلايا في 9.5 مل من المتوسط) ، وتنمو بمعدل 28 درجة مئوية مع الهز (225 دورة في الدقيقة). تنمو حتى في كثافة ضوئية في 600 نانومتر (A 600) بنسبة 0.2 في التوصل (حوالي 5 ساعات). الخلايا بنشاط متزايد هي الأفضل منذ الكشف عن قدرة فج لتنبيغ يرتبط bioluminescent استجابة لاستمرار واللياقة البدنية من البكتيريا المضيف. ومع ذلك ، فقد ثبت أن نظام الكشف لتكون متوافقة مع الخلايا التي تحصد في جميع مراحل دورة نمو يصل إلى 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد الركيزة اللازمة للتفاعل bioluminescent بإعداد 2 ٪ ن decanal الحل. مزيج من 200 ميكرولتر ن decanal مع 9.8 مل من مرق LB. دوامة بقوة لمدة 5 ثانية. رئيس لluminometer microplate حاقن مع 2 مل من محلول ن decanal 2 ٪. قبل تعيين luminometer autoinject إلى 67 ميكرولتر من الحل decanal لكل microplate جيدا ثم قرأ على الفور لمدة 10 ثانية. عينة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 الاستغناء aliquots مل من مرق LB في أنابيب الثقافة 3. إضافة 20 ميكرولتر من المخزون حل مراسل بالعاثية (رصيد 5 × 10 وحدات اللوحة تشكيل 9 [PFU] / مل) لكل أنبوب ، وتنميط وسائل الإعلام وحدها عينات بمثابة سيطرة سلبية. في غياب Y. خلايا الطاعون ، يجب اضافة بالعاثية مراسل استثارة رد فعل لا bioluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 الاستغناء aliquots مل من Y. طاعون ثقافة (من الخطوة 3.1) في أنابيب الثقافة 6. إضافة 20 ميكرولتر لمراسل بالعاثية الأسهم إلى 3 من الثقافات (اختبار الثقافات). ما تبقى من 3 الثقافات بمثابة سيطرة على &quot;الخلايا وحدها&quot; السلبي (autobioluminescence الخلفية). مزيج الثقافات vortexing لفترة وجيزة ، وحصاد 200 ميكرولتر من كل عينة (للمرة 0 قراءة) والاستغناء عن لوحة بيضاء في 96 - microtiter جيدا. احتضان ثقافة المتبقية في 28 مع اهتزاز (225 دورة في الدقيقة) درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الوقت 0 عينات لتلألؤ بيولوجي (وحدات خفيفة نسبيا ، RLU) باستخدام luminometer microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد 200 ميكرولتر من كل عينة بعد 10 ، 20 ، 30 ، 40 ، 50 ، و 60 دقيقة بالإضافة بالعاثية بعد المراسل ، وقياس عينة لتلألؤ بيولوجي. إذا Y. طاعون خلايا موجودة ، فإن بالعاثية مراسل ربط على وجه التحديد إلى الخلية ، وحقن الحمض النووي ، واستخدام آلات يستضيف النسخي ومتعدية لكتابة وترجمة الجينات مراسل luxAB (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوة الإشارة وزمن الاستجابة إشارة يتناسب مع عدد الخلايا الحالية. ينبغي على تركيزات عالية من الخلايا (10 5 8 -10 كفو / مل) ، زيادة كبيرة في RLU بالمقارنة مع الضوابط يكون واضحا في غضون 20 دقيقة. بتركيزات أقل الخلية ، (10 2 -10 4 CFU / مل) ، وينبغي زيادة كبيرة في RLU يكون واضحا في غضون 40-60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، على الإسراع في عملية الكشف من دون الحاجة إلى Y. قد تكون مختلطة طاعون ثمرة ، من مستعمرة لوحة نمت حديثا (عن طريق vortexing) مباشرة في أنبوب 1.5 مل إيبندورف مع 200 ميكرولتر من مرق LB إيواء مراسل فج. الاستغناء عن خليط الخلية / فج في بئر من لوحة microtiter. احتضان لوحة microtiter عند 28 درجة مئوية ، وقراءة عينة لتلألؤ بيولوجي بعد 60 دقيقة (نقطة واحدة فقط الوقت). </li></ol> 4. ممثل النتائج : دورة الوقت بوساطة ممثل تجربة بالعاثية مراسل كشف Y. ويصور طاعون في الشكل 2. الضوابط السلبية لل1) فج وحده (أي الخلايا) ، أو 2) الخلايا وحده (أي فج) توفير مستويات أساسية من تلألؤ بيولوجي من حوالي 20 RLU المؤتمر الوطني العراقي طوال 60 دقيقةubation (مستويات أساسية محددة luminometer). في المقابل ، زيادة في تلألؤ بيولوجي للعينات الاختبار (فج مراسل والخلايا) هو واضح في 15 دقيقة بعد إضافة فج. ينبغي زيادة قوة إشارة باطراد على مدى 60 دقيقة. حضانات لفترات زمنية طويلة (أكثر من 80 دقيقة) ، سيؤدي في اشارة الى ان الانخفاض سيكون من إشارة الذروة بسبب بالعاثية تحلل بوساطة الخلايا المضيفة. ويتم الحصول على نتائج مماثلة في درجات حرارة الحضانة من 37 درجة مئوية على الرغم من أن درجة الحرارة المثلى لY. طاعون نمو تصل الى 28 درجة مئوية 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. بالعاثية بوساطة الكشف bioluminescent من Y. طاعون. وفي الوقت 0 ، كانت مختلطة بالعاثية مراسل والخلايا ، وحضنت في 28 درجة مئوية ، وتلألؤ بيولوجي (RLU) تم رصد أكثر من مرة. زيادة كبيرة في RLU (* الطلاب اختبار t ، ف &lt;0.05) هو واضح في غضون 15 دقيقة.

<ol>
	<li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threats+in+bioterrorism.+I:+CDC+category+A+agents.">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li><li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , (2000).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (1999).</li><li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthrax+as+a+biological+weapon,+2002:+updated+recommendations+for+management.">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li><li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis:+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance.">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li><li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes.">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li><li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis.">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li><li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis.">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li><li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , 1-19 (2001).</li><li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage.">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li><li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella,+Salmonella,+and+Shigella.">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li><li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR.">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا الأسلوب يدل على قدرة بالعاثية مراسل لكشف بسرعة Y. يمكن أن الطاعون منذ بالعاثية مراسل تنبيغ استجابة لإشارة bioluminescent Y. مثقف طاعون داخل الخلايا 20 دقيقة بعد إضافة فج. وبالعاثية مراسل هي أيضا قادرة على الكشف عن مباشرة Y. طاعون في مصفوفات السريرية...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> Difco آغار LB ، ميلر </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB مرق ، ميلر </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 × 100 ملم أنابيب الثقافة </td><td> الولايات المتحدة الأمريكية والعلم </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> ن Decanal </td><td> سيغما </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> VERITAS microplate luminometer </td><td> تيرنر النظم البيولوجية </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> Microlite microtiter 96 - جيدا لوحة </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

'bioluminescent' reporter phage for the detection of category a bacterial pathogens

يرسينيا بيستيس وعصيات الجمرة الخبيثة هي الفئة أ مسببات الأمراض البكتيرية التي هي العوامل المسببة للمرض الجمرة الخبيثة والطاعون ، على التوالي 1. على الرغم من الطبيعي حدوث الأمراض على حد سواء &quot;هو الآن نادرة نسبيا ، وإمكانية استخدام هذه الجماعات الإرهابية باعتبارها الاسلحة البيولوجية مسببات حقيقية. بسبب سراية المرض المتأصل ، وبطبيعة الحال السريرية السريع ، وارتفاع معدل وفيات الأطفال ، فمن الأهمية بمكان أن يتم الكشف عن تفشي بسرعة. ولذلك المنهجيات التي توفر الكشف السريع والتشخيص ضرورية لضمان التنفيذ الفوري للتدابير الصحة العامة وتفعيل إدارة الأزمات. قد المؤتلف بالعاثية مراسل توفير نهج محدد وسريع للكشف عن Y. الطاعون وباء. الجمرة الخبيثة ، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها في الوقت الحاضر استخدام تحلل بالعاثية الكلاسيكية فحوصات لتحديد أكدت هذه مسببات الأمراض البكتيرية 2-4. هذه المقايسات الاستفادة من طبيعيا بالعاثية التي هي محددة وlytic لمضيفيهم البكتيرية. بين عشية وضحاها بعد نمو للبكتيريا المزروعة في وجود فج محددة ، وتشكيل لويحات (تحلل الجرثومي) يوفر تحديد هوية الهدف البكتيرية. على الرغم من أن هذه القياسات ليست قوية ، فإنها تعاني من ثلاثة عيوب : 1) أنها تقوم المختبرات ؛ 2) أنها تتطلب العزلة البكتيرية وزراعة عينة من المشتبه بهم ، و 3) أنها تأخذ 24-36 ساعة لإكمال. لمعالجة هذه القضايا ، والمؤتلف وراثيا &quot;للضوء الموسومة&quot; فج المراسل من خلال دمج جينات harveyi الضمة luxAB في جينوم Y. الطاعون وباء. الجمرة الخبيثة بالعاثية محددة 5-8. وكان مراسل luxAB الناتجة بالعاثية قادرة على الكشف عن هدفهم محددة بسرعة (في غضون دقائق) ، ومنح بحساسية النمط الظاهري bioluminescent إلى الخلايا المتلقية. الأهم من ذلك ، تم الحصول عليها إما مع الكشف عن خلايا المزروعة المستلم أو وهمية مع المصابين العينات السريرية 7. لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن هنا تصف طريقة للكشف بالعاثية بوساطة من المعروف Y. طاعون عزل باستخدام بالعاثية مراسل luxAB شيدت من فج CDC التشخيص الطاعون ΦA1122 6،7 (الشكل 1). ويمكن استخدام طريقة مماثلة ، مع تعديلات طفيفة (مثل التغير في درجة الحرارة ونمو وسائل الإعلام) ، للكشف عن B. الجمرة الخبيثة العزلات باستخدام B. الجمرة الخبيثة Wβ بالعاثية المراسل : luxAB 8. الأسلوب يصف تنبيغ بالعاثية بوساطة من النمط الظاهري biolumescent المزروعة إلى Y. طاعون الخلايا التي يتم قياسها في وقت لاحق باستخدام luminometer microplate. وتشمل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة على المقايسات بالعاثية تحلل التقليدية هو سهولة الاستخدام ، ونتائج سريعة ، والقدرة على اختبار عينات متعددة في وقت واحد في شكل لوحة microtiter 96 - جيدا. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. الكشف التخطيطي ، وبالعاثية تختلط مع العينة ، وتنميط يصيب الخلية ، وأعرب عن luxAB ، وbioluminesces الخلية. تجهيز العينات ليست ضرورية ، وتنميط وخلايا مختلطة وقياسها في وقت لاحق للضوء.

Watch this Scientific Journal Video about 'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens at JoVE.com

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

وهناك طريقة بسيطة لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية الأولوية لاستخدام وراثيا مراسل فج. هذه بالعاثية المراسل ، والتي هي محددة لأنواع معينة المضيفة ، قادرة على الاستجابة بسرعة transducing bioluminescent إشارة إلى الخلايا المضيفة. هنا ، نحن تصف استخدام فج مراسل للكشف عن<em&gt; يرسينيا بيستيس</em&gt;.

&#39;Bioluminescent&#39; بالعاثية مراسل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الفئة أ

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

13.3K Views.  Guild Associates, Inc.. وهناك طريقة بسيطة لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية الأولوية لاستخدام وراثيا مراسل فج. هذه بالعاثية المراسل ، والتي هي محددة لأنواع معينة المضيفة ، قادرة على الاستجابة بسرعة transducing bioluminescent إشارة إلى الخلايا المضيفة. هنا ، نحن تصف استخدام فج مراسل للكشف عن يرس...

Video: 'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

البكتيرية التصوير Bioluminescent<em&gt; في الجسم الحي</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس ليسا من الأنسجة الثابتة الفورمالين

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...