وأيد هذا العمل عن طريق منحة من NS64571 NINDS (CLH) ، عن طريق منح التطوير الوظيفي في وقت مبكر من مايو كلينيك (CLH) ، وبواسطة هبة سخية من دونالد وفرانسيس Herdrich (CLH) نود أن نشكر تدفق مايو كلينيك الأساسية الخلوي للحصول على المساعدة.

1. حقن الفيروس داخل القحف : تم تعديل هذه التقنية المستخدمة على نطاق واسع التالية والتي مختبرنا والزملاء. لفترة وجيزة ، والحقن داخل القحف من سلالة من التهاب الدماغ و النخاع دانيال فيروس تايلر الفئران (TMEV) أو صورية العدوى (1 ، 10) والتي أجريت على الفئران الشباب (يفضل 5-6 اسابيع من العمر) لانتزاع الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs). يرجى ملاحظة أن النتائج ستختلف بين سلالة دانيال ، من سلالة فول ، وسلالة GDVII. لغرض حصاد BILs والفئران تتلقى 2x10 5 من PFU TMEV والمصابين لمدة 24 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق الإبرة الحقن (27 قياس ، في ربع ، كندال) ، لتلقائي 1 مل حقنة هاملتون وتعيين لتسليم 10 ميكرولتر من الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع TMEV في 10 ميكرولتر DMEM في المحاقن مع الاهتمام الدقيق لفقاعات الهواء. عندما يكون ذلك مناسبا ، والفئران المصابة صورية على 10 ميكرولتر من DMEM خالية من الفيروسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل الحقن ، صب حوالي 1 مل من isoflurane في جرة الجرس الذي يحتوي على أسلاك الشبكة مع الركيزة القطن تحتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران direclty مكان على شبكة الأسلاك في جرة الجرس حتى تصبح تخدير طفيفة ، غير حساسة لقرصة أخمص قدميها ، وثبتوا من مخدر نشوق ، وحوالي 10-15 ثانية. وينبغي أن الفئران لا تأتي في اتصال مباشر مع isoflurane ، كمادة يمكن مزعجة والصودا الكاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين تحت تأثير التخدير ، وإعداد للحقن الفئران عن طريق تحديد إحداثيات المناسبة بسرعة في منطقة القشرة الأمامية على الجمجمة باستخدام الحلاقة والتحبير. الموقع العام للحقن هو 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن (الشكل 1). في حين حقن المجسم قد تكون ملائمة لبعض الحالات التجريبية ، وجدنا أن حرة مباشرة من دون حقن الحلاقة أو التحبير هو مناسب للغالبية التجارب. فراق الفراء مع نقطة على طول الإبرة المحورين المناسب للحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء الحقن ، وتوجيه عمودي الإبرة إلى الصحافة من خلال الجمجمة والعظام وبعمق حوالي 3 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرب عن الفيروس إلى الدماغ عن طريق الضغط على زر أسفل حقنة هاميلتون والانتظار 2 ثانية للفيروس بالدخول الى المخ قبل ان تنسحب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة بعناية ووضع الماوس في قفص ونظيفة وجافة. الفئران افاقته بسرعة واستئناف وظيفة عادية في غضون دقائق. قد يعطي الاهتمام المناسب على الفئران أن تظهر عليهم أعراض غير طبيعية ، مثل النزيف من موقع الحقن ، والقتل الرحيم للحيوان يكون مناسبا. يجب أن تتبع الحيوانات السليمة التعامل مع 6 والتمسك المعاهد الوطنية للصحة ورعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام. </li></ol> 2. الدماغ التسلل الكريات البيض إعداد الخلية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الجولة القاع أنابيب الطرد المركزي التي يمكن أن أوك ريدج عقد قدرة 30 مل مع RPMI مل 10 1640 ، 9 Percoll مل و 1 مل PBS 10X ومواسير يجب الجلوس على مقاعد البدلاء RT على الدماغ أثناء عملية الإزالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب Ficoll Paque - Plus لدرجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوانية isoflurane تعديل جرعة زائدة (5) وإزالة بسرعة باستخدام أنسجة الدماغ الفولاذ المقاوم للصدأ ملعقة وضعها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 5 مل RPMI على الجليد. في بعض الظروف ، قد يكون PBS - نضح المناسبة لإزالة الخلايا الدموية المحيطية تعميم من إعداد BILs. وينبغي أن يكون كاملا والفئران بشكل صحيح تخدير قبل PBS - الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدماغ وRPMI حل ل7 مل زجاج بيركس طاحونة العلامة التجارية الأنسجة Tenbroeck والتجانس بلطف مع 10-15 السكتات الدماغية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة إضافي 5 مل RPMI في الخالط والماصة صعودا وهبوطا مرتين. نقل جناسة الدماغ (حوالي 10 مل) إلى أنبوب الجولة القاع معدة مسبقا وعكس بلطف 2-3 مرات إلى مزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في الدماغ جناسة افي 7800g لمدة 30 دقيقة في الدوار RT في الزاوية الثابتة F0360 في جهاز للطرد المركزي بيكمان X - 22R أليجرا السريرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، وإزالة الأنقاض التي الميلين طرحت في قمة الانحدار. جمع طبقة الكريات البيض التي تعوم فوق بيليه خلايا الدم الحمراء (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة طبقة الكريات البيض من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر إلى 50 مل المخروطية. تحقيق حل ما يصل الى حجم 50 ملم مع RMPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنابيب التي تحتوي على المخفف تعليق خلية في جهاز للطرد المركزي في الدقيقة السريرية 1500 (600G افي) لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطاف جمع بيليه الخلية. Resuspend الكرية في مخزن FACS 1 مل (1 ٪ ألبومين المصل البقري ، أزيد الصوديوم 0.02 ٪ من الكالسيوم والمغنيسيوم PBS مجانا) ونقل إلى تعليق الخلية 5 مل الدور السفلي FACS الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الأساس الذي تقوم عليه بعناية مع 1 زائد Ficoll - Paque مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أنبوب دورة في الدقيقة 2500 (1400 قدم) في أجهزة الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة السريرية على RT مع عدم وجود الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأبيض ، رقيق في طبقة واجهة (الشكل 2) مع 1 مل ماصة ونقل إلى 5 أنبوب جديد FACS مل. غسل جells مع 4 العازلة FACS مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أنبوب 1500 دورة في الدقيقة (600G افي) لمدة 5 دقائق على RT في أجهزة الطرد المركزي السريرية لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف بيليه وجمع الخلية. Resuspend الكرية الكريات البيض في العازلة المناسبة والحفاظ على الجليد في أنبوب FACS جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا ، وتقييم الجدوى الخلية الاستبعاد التريبان الأزرق وتحليلها حسب التدفق الخلوي. عموما ، يمكن أن نتوقع أن المحققين الحصول على ما يقرب من 5 × 10 5 خلية / الحيوانات. </li></ol> 3. immunophenotyping تدفق cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عزل وعد كريات الدم البيضاء ، وتدور هذه الخلايا لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية في عرقلة العازلة التي تحتوي على ما يلي : FACS العازلة ، طاف من ورم هجين 2.4G2 (FC كتلة ؛ anti-CD16/32) ومصل بقري جنيني في نسبة 10:05:01 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وإضافة أضداد ضد مستضدات مترافق خارج الخلية إلى الخلايا سدت في تركيز 1:200 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. وصمة عار واحتضان خلايا في 200 ميكرولتر في صفيحة V - 96 - القاع أيضا. وتشمل الضوابط المناسبة وغير ملوثين عينات خلايا ملون تألقي التعويض ، حسب الاقتضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في الخلايا الملون RT لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية باستخدام الدوار لمناسبة 96 - جيدا لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطاف غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر FACS العازلة التي pipetting بلطف صعودا ونزولا 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الغسيل تقنية أعلاه مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل ، resuspend الخلايا في بارافورمالدهيد 2 ٪ ، ونقل إلى أنابيب FACS. مطلوب تثبيت لتحليل تدفق cytometric من الخلايا المصابة من الكواشف الأحيائية المستوى 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الخلايا الثابتة على FACS Calibur دينار بعد تعديل طريقة تدفق الخلوي (8) وتحليل الملفات باستخدام FlowJo حاليا ، WinMDI أو غيرها من البرامج المتاحة التدفق الخلوي التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو مطلوب عموما في تحليل الأحداث 50-100،000 لكل عينة لimmunophenotyping كافية. </li></ol> مترافق مباشرة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة : تم الكشف عن CD45 مع استنساخ 30 - F11. تم الكشف عن Ly6C / G مع استنساخ GR1 ، RB6 - 8C5. تم الكشف عن CD11b مع استنساخ M1/70. تم الكشف عن F4/80 مع استنساخ BM8. 4. ممثل النتائج : نعرض النتائج phenotyping الخلية لBILs الماوس في 24 إصابة آخر ساعة (الشكل 3). والكريات البيض الملون ، مترافق مع PerCP الماوس مكافحة CD45 للكشف عن الخلايا المناعية ، PE - مترافق المضادة للماوس Ly6C / G للكشف عن التهابات حيدات ، APC - مترافق المضادة للفأرة وCD11b APC مترافق مكافحة الفأر F4/80 للكشف عن خلايا من سلالته الوحيدات. تم إجراء تحليل بأداة FACS Calibur دينار بحريني. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. وتقع الترجمة التشريحية للموقع الحقن ، والحقن 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. يتم جمعها في البداية من التوضيح الفصل المتدرج من الكريات البيض وBILs. الكريات البيض مباشرة تحت طبقة المايلين والحطام فوق بيليه RBC في الانحدار Percoll. يتم جمع البيض ، طبقة رقيق (BILs) في واجهة من التدرج Ficoll. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. وقد تم عزل نمط ظاهري مناعي من الدماغ infilatrating الكريات البيض في 24 ساعة بعد العدوى الكريات البيض الماوس. من الدماغ عن طريق الطرد المركزي كثافة الخليط من الفرق مستعدة الأنسجة من الحيوانات في 24 ساعة بعد العدوى داخل القحف. تم صبغ الخلايا مع أجسام مضادة ضد fluorescently - مترافق الماوس CD45 ، Ly6C / G ، CD11b وF4/80. تم تنفيذ تبوب الأولي بالتآمر CD45 ، وهي علامة للحصول على الخلايا المناعية ضد مبعثر إلى الأمام (FSC) ، وهو مؤشر على حجم الخلية (C). وقد تم تحليل ثم مرحبا CD45 (A ، D) ، CD45 الصغرى (B ، E) ، وNEG CD45 (F ، G) السكان لمستويات التعبير النسبية للعلامات الوحيدات والبلاعم Ly6C / G ، F4/80 (A ، B ، F) ، وCD11b (D ، E ، G). Ly6C / G + F4/80 + + CD11b عثر حيدات التهابات بشكل حصري تقريبا في عدد السكان مرحبا CD45 (A ، D) ، بما يتفق مع تسلل من هذه الخلايا من محيطها. في المقابل ، لو تم العثور على Ly6C/G-F4/80 CD11b + الضامة بشكل حصري تقريبا في لو CD45 (B ، E) وCD45 NEG (G) من السكان ، بما يتفق مع النمط الظاهري المقيم. في تجارب عديدة ، ونحن لم يلاحظ خلايا CD45 مرحبا أو Ly6C / G + F4/80 + + CD11b حيدات التهابات في الدماغ من غير مصاب أو صورية العدوى ،الفئران تيد (لا تظهر البيانات).

<ol>
	<li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornaviruses+and+cell+death.">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li><li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay.">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li><li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li><li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain.">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li><li>Donovan, J., &amp;amp, P. . B. r. o. w. n., , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+&#38;+restraint.">Handling &#38; restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenteral+injections.">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li><li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur.">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li><li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination.">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li><li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+in+mice:+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination.">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نستخدم التدفق الخلوي بشكل روتيني لتحديد كلا من نوعية الخلية إعداد الدماغ التسلل ، والتمييز مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية 2 و 9. في نقطة زمنية حادة ، لدينا أسلوب BILs غلة نسب عالية من التهابات داخل حيدات السكان CD45hi فضلا عن النسب العالية من السكان في الضامة CD45lo....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> هوي مختبر </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> دانيال سلالة </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> جولة القاع أنابيب الطرد المركزي أوك ريدج </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> روش </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll - Paque بلس </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> التريبان الأزرق 0.4 ٪ (W / V) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900 - CI </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب مخروطية 15 مل </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 مل زجاج بيركس الأنسجة Tenbroeck العلامة التجارية طاحونة </td><td> الصياد </td><td> 08-414 - 10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 مل المخروطية </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> سيغما </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF - PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040 - CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS أنابيب </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> سيغما </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 ورم هجين </td><td> ATCC </td><td> HB - 197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V - أسفل لوحة </td><td> كورنينج </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> أليجرا X - 22R أجهزة الطرد المركزي أو ما يعادلها </td><td> بيكمان </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96 لوحة وكذلك الدلو الدوار </td><td> بيكمان </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> الزاوية الثابتة الدوار </td><td> بيكمان </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> سيغما </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> دينار بحريني FACS Calibur </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7.5 </td><td> شجرة نجمة ، وشركة </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 557235 </td><td> استنساخ : 30 - F11 </td></tr><tr><td> GR1 (Ly6C / G) </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 553128 </td><td> استنساخ : RB6 - 8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> استنساخ : M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> استنساخ : BM8 </td></tr></tbody></table>

isolation of brain-infiltrating leukocytes

نحن تصف طريقة لإعداد الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs) من الفئران. نحن لشرح كيفية تصيب الدماغ و النخاع الفئران مع فيروس تايلر الفئران (TMEV) عبر تقنية الحقن داخل الجمجمة السريع ، وكيفية تنقية سكان الكريات البيض المخصب من الخلايا التسلل من الدماغ كله. باختصار ، هي تخدير الفئران مع isoflurane في غرفة مغلقة وخالية من ناحية حقن حقنة مع هاميلتون في القشرة الأمامية. ثم يتم قتل الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى عن طريق جرعة زائدة isoflurane والعقول كلها تستخرج والمتجانس في RPMI مع طاحونة Tenbroeck الأنسجة. وطرد الخليط الدماغ من خلال التدرج المستمر Percoll 30 ٪ لازالة الانقاض الخلية الميلين وغيرها. وتوترت ثم تعليق خلية في 40 ميكرون ، وغسلها وطرد على التدرج متقطع بلس Ficoll - Paque لتحديد وتنقية الكريات البيض. ثم يتم غسل الكريات البيض ومعلق في مخازن مناسبة لimmunophenotyping بواسطة التدفق الخلوي. التدفق الخلوي يكشف عن مجموعة من الخلايا المناعية الفطرية في المراحل المبكرة من العدوى في الفئران C57BL / 6. إصابة آخر في 24 ساعة ، مجموعات فرعية متعددة من الخلايا المناعية الموجودة في BILs ، مع السكان المخصب من GR1 + ، + CD11b وخلايا + F4/80. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة في وصف رد الفعل المناعي للعدوى حادة في الدماغ.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes at JoVE.com

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

ووصف طريقة سريعة للحصول على الكريات البيض التسلل من الدماغ الفئران. هذه الطريقة تستخدم الانحدار المستمر والمتقطع Percoll التدرج Ficoll لتحديد وتنقية طبقة الكريات البيض المخصب. ثم قد تكون معزولة الكريات البيضاء التي تتميز قياسات تدفق cytometric.

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.0K Views.  Mayo Clinic College of Medicine. ووصف طريقة سريعة للحصول على الكريات البيض التسلل من الدماغ الفئران. هذه الطريقة تستخدم الانحدار المستمر والمتقطع Percoll التدرج Ficoll لتحديد وتنقية طبقة الكريات البيض المخصب. ثم قد تكون معزولة الكريات البيضاء التي تتميز قياسات تدفق cytometric.

Video: Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

حصاد الانتقائي للMarginating-الرئوية الكريات البيضاء

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...