يصف بروتوكولنا استخدام جهاز استشعار حيوي لبيروكسيد الهيدروجين في الخلايا العصبية واليرقات المستزرعة لسمك الحمار الوحشي. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تشريح دور أنواع الأكسجين التفاعلية في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والفيزيولوجيا المرضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكشف في الوقت الحقيقي عن بيروكسيد الهيدروجين في الحيوانات الحية والخلايا المستزرعة.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على الحيوانات الأخرى ، مثل نظام نموذج القوارض. لإعداد الأغطية، استخدم الأغطية المطهرة بالأحماض المخزنة في الإيثانول بنسبة 100٪. استخدام ملقط لإزالة غطاء واحد من حاوية التخزين، واللهب لإزالة الإيثانول المتبقية.
الهواء يجفف الغطاء تماما عن طريق وضعه في زاوية داخل طبق ثقافة 35 ملليمتر. إعداد Poly-D-Lysine أو PDL أو حل العمل. تطبيق PDL إلى مركز كل غطاء، وتجنب انتشار الحل إلى حواف واحتضان PDL لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تأكد من أن PDL لا تجف. غسل PDL مع 0.5 ملليلتر من الماء العقيم والسماح للوحات تجف تماما. إعداد حل عمل صفمين.
وتطبيقه على وسط كل coverslip، مع التأكد من تجنب انتشار الحل إلى الحواف. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب لمدة ساعتين إلى ست ساعات، وتجنب تجفيف محلول صفح. لإجراء تشريح الجنين في خلايا العقدة الشبكية لوحة أو RGCs، وإعداد وتسمية أربعة أطباق زراعة الأنسجة 35 ملليمتر وملئها مع أربعة ملليلتر من الإيثانول 70٪.
E2 وسائل الإعلام واحد. E2 وسائل الإعلام اثنين. و E2 وسائل الإعلام ثلاثة، في يوم تشريح.
احتفظ بالأطباق في الثلاجة. عندما تكون أجنة حمار وحشي بعد 34 ساعة من الإخصاب ، خذ أطباق الثقافة المغلفة باللحنين من الحاضنة. وغسل الغطاء ينزلق ثلاث مرات مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X.
بعد الغسيل النهائي، أضف أربعة ملليلترات من وسائط ZFCM+إلى كل طبق ثقافة. تجنب تجفيف اللوحة. استرداد أطباق الثقافة المبردة المعدة والسماح لهم التوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
املأ أربعة إلى ستة أنابيب PCR مع 15 ميكرولتر من وسائط ZFCM+. استرجع أجنة حمار وحشي من الحاضنة وانغمس في أجنة في طبق زراعة أنسجة 35 ملليمتر يحتوي على 70٪ إيثانول لمدة 5-10 ثوان لتعقيمه. باستخدام نقل ماصة، نقل الأجنة إلى وسائل الإعلام E2 طبق واحد، تحتوي على وسائل الإعلام E2 عقيمة لغسل الإيثانول الزائد.
ثم، نقل الأجنة إلى وسائل الإعلام E2 طبقين وإزالة المشيمات مع ملقط حاد. وأخيرا، نقل الأجنة إلى وسائل الإعلام E2 ثلاثة طبق لإجراء تشريح. باستخدام زوج من ملقط غرامة، ووضع وعقد الأجنة الأمامية إلى صفار مع واحدة من ملقط.
وإزالة الذيل الخلفي إلى كيس صفار مع ملقط أخرى. الاستيلاء على الرقبة مع ملقط وخلع الرأس لفضح الدماغ والعينين لوسائل الإعلام E2. مع غيض من ملقط غرامة، لفة بلطف العينين من الرأس في حين عقد الأنسجة الجمجمة إلى أسفل مع ملقط الثاني.
نقل أربع عيون إلى واحد من الأنابيب التي أعدت سابقا تحتوي على ZFCM + triturate بلطف صعودا وهبوطا مع ماصة P20 حوالي 45 مرة لتفكك الخلايا. نقل ZFCM + مع الخلايا المفككة إلى مركز الأغطية. الحفاظ على الثقافات على أعلى مقاعد البدلاء في 22 درجة مئوية على رف رغوة البوليسترين لامتصاص الاهتزازات.
في يوم التصوير، تحقق من الخلايا تحت المجهر للتحقق من نمو محاور RGC. لتصوير الخلايا الحية، نقل الأغطية من طبق الثقافة إلى غرفة تصوير الخلايا الحية. استخدم مجهر مقلوب مجهزا بمرشح أحمر OG-590 Longpass الهدف من DIC وكاميرا EMCCD.
قبل التصوير، استبدل جهاز ZFCM+medium ب ZFCM-After لتحديد موضع الخلايا بهدف 10X، والحصول على صور عند تكبير 60X باستخدام هدف غمر الزيت. استخدم تكبير إضافي 1.5X. أولا الحصول على الصور DIC.
ثم، صورة roGFP2-Orp1، وذلك باستخدام مجموعة مرشح المناسبة. بعد التقاط المجموعة الأولى من الصور، تبادل الوسائط مع الوسائط التي تحتوي على حلول علاج مختلفة. يجب تغيير الوسائط كل 30 دقيقة من التصوير لتجنب تغيرات الحموضة والأوسمولارية.
للتصوير في الجسم الحي، احتفظ بالأجنة بعد الإخصاب على مدار 22 إلى 24 ساعة في وسائط E3، التي تحتوي على 0.003٪ من فينيل ثيوريا بدون أزرق الميثيلين. تبادل وسائل الإعلام وإزالة الأجنة الميتة يوميا. في العمر المطلوب، تخدير وتركيب الأجنة في 1٪ agarose على 35 ملليمتر الزجاج أسفل أطباق الثقافة.
يمكن توجيه الأجنة بشكل ظهري أو بطني أو أفقي، اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام للتصوير. بعد agarose الصلبة، وملء الأطباق مع وسائل الإعلام E3 دون الأزرق الميثيلين، ولكن مع 0.016٪ tricaine. إعداد المجهر للتصوير.
استخدم مجهرا ضوئيا مقلوبا بالليزر لتصوير الأجنة المثبتة في الجزء السفلي من قطرة الآغاروز. تثير roGFP2-Orp1، والحصول على الصور المقابلة مع مرشحات الانبعاثات المطلوبة. الحصول على مداخن ض مع سمك مقطع متر صغير خمسة من خلال الجزء المطلوب من الأجنة.
بعد التصوير، قم بإزالة الأجنة من أغاروز مع ملقط ناعم وإبقائها في الحاضنة والوسائط الزرقاء الخالية من الميثيلين مع فينيل ثيوريا حتى العمر المطلوب. تظهر هنا صورة تمثيلية للمسان الحيوي لبيروكسيد الهيدروجين والمبروكس الممتد لسمك الحمار الوحشي المستزرع RGC. جسم الخلية، محور عصبي، ومخاريط النمو مرئية بوضوح في الخلايا العصبية الفردية.
إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى وسائل الإعلام الثقافة يزيد من قيم النسبة، مما يدل على أنه يمكن الكشف عن التغيرات في الوقت الحقيقي مع هذا النظام. يظهر القياس الكمي لمستويات بيروكسيد الهيدروجين في لوحة B.To تحديد مستويات بيروكسيد الهيدروجين في أجنة حمار وحشي كاملة ، تم حقن الحمض النووي الريبي خلال مرحلة الخلية الواحدة ، مما تسبب في تعبير جميع الأنسجة عن جهاز الاستشعار الحيوي roGFP2-Orp1. تظهر منطقة رأس يرقات حمار وحشي في نقطتين زمنيتين مختلفتين ، مع التركيز على مستويات بيروكسيد الهيدروجين في شبكية العين.
تم قياس المستويات القاعدية لبيروكسيد الهيدروجين في أجنة حمار وحشي في يومين بعد الإخصاب وخمسة أيام بعد الإخصاب. وفي اليومين التاليين للتخصيب، كانت قيم النسبة أقل بكثير مما كانت عليه في خمسة أيام بعد الإخصاب. وعلاوة على ذلك، أظهر كل مستوى مختلف من الزيادة في محتوى بيروكسيد الهيدروجين الشبكية.
استخدام ملقط ناعم لإزالة العينين وتفكك لطيف للعيون مع ماصة هي الخطوات الأكثر أهمية في هذا الإجراء. يمكن أن يتبع هذا البروتوكول علاجات المخدرات للتحقيق في العوامل التي ينطوي عليها إشارة ROS.
