وأيد هذه الدراسة من قبل دائرة الصحة العامة منحة AI - 34431 (لداه) من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية وزارة شؤون المحاربين القدامى صناديق البحوث الطبية (لداه).

1. التثبيت من البريمية على الشرائح الزجاجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البريمية interrogans هي فئة BSL2 الممرض. العمل مع الخلايا الحية فإنه يتطلب معالجة مناسبة ، مثل ارتداء القفازات ، معطف المختبر والخطوات pipetting في غطاء العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البريمية تنمو في EMJH medium11 ، على أن تستكمل مع مصل الأرنب 1 ٪ عند 30 درجة مئوية حتى تصل إلى منتصف إلى أواخر سجل في المرحلة (5 × كثافة 07-05 أكتوبر X الخلايا 8 10 / مل) لحوالي 6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الثقافة بواسطة الطرد المركزي في XG 2000 ~ لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مخزنة بواسطة الطموح وطاف resuspend بلطف بيليه في الفوسفات الملحي (PBS) -5 ملي MgCl 2 ، pH7.2 إلى التركيز النهائي للخلايا 5 × 8 10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من اثنين وكذلك الشرائح الزجاجية واحتضان الغرفة في 30 دقيقة لمدة 80 درجة مئوية للسماح للخلايا التمسك به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية السائلة التي تحتوي على الخلايا غير منضم بواسطة الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإصلاح البكتيريا المتبقية سليمة على الشرائح الزجاجية وذلك بإضافة 1 مل / بئر بارافورمالدهيد 2 ٪ في PBS - 5 MgCl 2 مم. احتضان لمدة 40 دقيقة حتى 30 درجة مئوية وهذه الشرائح ستكون لتقييم المياه السطحية المعرضة للبروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للشرائح السيطرة شبه السطحية تقييم البروتينات ، permeabilize الغشاء الخارجي عن طريق تحديد مع 1 مل / 100 ٪ جيدا الجليد الباردة الميثانول. في احتضان -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الميثانول الأعمال بطرق عدة : فهو permeabilizes الغشاء الخارجي ، denaturates البروتينات ، والخلايا الإصلاحات على الشرائح الزجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيت الوكلاء بحسب الطموح. </li></ol> 2. وسم مع الاجسام المضادة المحددة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غير محددة وملزمة وذلك بإضافة 1 مل / جيدا العازلة حظر (Difco البريمية EMJH التخصيب). في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الضد معينة (أو الأرانب الأمصال المناعية الأضداد وحيدة النسيلة الماوس ، الأرنب النسائل المتعددة هنا الأمصال محددة لOmpL54 10 ، FlaA1 12 و 13 OmpL1) وقبل الأمصال المناعية التقشف أو الماوس السوائل التي لا تحتوي على الأضداد الأرنب (عند استخدامها على النحو ضوابط السلبية) في حظر العازلة. التخفيفات لكل الأجسام المضادة يجب أن تكون مصممة وفقا تجريبيا في عيار الأضداد ، مستضد الضد التفاعل وفرة من البروتين في الخلية. النطاق المعتاد هو 1:50 إلى 1:600. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحجب العازلة التي تطلع وإضافة 1 مل / بئر الأضداد الأولية المخففة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند درجة 30 ل1H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السائل بواسطة الشفط ، ويغسل ثلاث مرات الآبار مع برنامج تلفزيوني (1 مل / جيد). </li></ol> 3. تصور leptospires <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل / بئر اليكسا فلور 488 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إما الماعز المضادة للأرنب مفتش أو الماعز المضادة للمفتش الماوس) المخفف 1:2000 والحمض النووي الفلورسنت وصمة عار ، 4&#39;6 - diamidino - 2 - فينيل الأندول هيدروكلوريد ( دابي) المخفف إلى التركيز النهائي من 0.25 ميكروغرام / لتر في عرقلة العازلة. هذه الخطوة يضمن الكشف عن الأجسام المضادة وملزم بحضور جميع اللولبيات مستقلة عن الضد ملزمة ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السائل بواسطة الشفط ، ويغسل الآبار مرتين ومرة ​​واحدة مع برنامج تلفزيوني مع الماء المقطر (1 مل / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغرف وإزالة الشريط اللاصق من شرائح الزجاج والهواء الجاف عن 10 دقيقة ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إطالة الذهب لمكافحة تصاعد تتلاشى المتوسطة (2 × 20 ميكرولتر لكل شريحة) وتغطي 24 × 50 مم زلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام. هذه الخطوة كانت ضرورية للسماح متوسطة متزايدة لعلاج (تصلب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق الغطاء زلة مع طلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور تلطيخ بواسطة المجهر مضان باستخدام سماوي / الزرقاء تصفية الكشف عن دابي وكشف الاخضر لتصفية فلور اليكسا 488. لضمان أن يتم تمثيل دقيق للعينات ، وتأكد من تقييم كامل للمنطقة الغرفة كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل البيانات عن طريق التصوير حقل ممثل عن كل عينة. عند التصوير اليكسا فلور 488 مضان ، استخدم نفس وقت التعرض لجميع العينات. وسوف تستخدم وقت التعرض متناسقة تسمح المقارنة أكثر دقة النتائج مع مستضدات اختبار مقابل الضوابط. </li></ol> 4. ممثل النتائج : وترد أمثلة على النتائج مع الخلايا السطحية ايفا interrogans البريمية باستخدام أجسام مضادة ضد السطح وتحت السطح البروتينات في الشكل 2. ويعتبر الاختبار إيجابيا عندما تم الكشف عن مضان كبيرة في عينات مع leptospires سليمة لبروتين من الربا إن سطح مكشوف (الشكل 2A). عادة ، في اختبار ايجابية (هنا ، السطحية المعرضة للOmpL54) ، لوحظ كثافة مضان نفسها تقريبا في كل من خلايا سليمة وpermeabilized (الشكل 2A) ومن الضروري أن تشمل مراقبة سلبية على سلامة الغشاء الخارجي ، باستخدام أجسام مضادة ضد الجوفية ، محيط بالجبلة يفضل البروتين (مثل البريميات FlaA1 ، الشكل 2B). فقط عندما تظهر البيانات أن الغشاء الخارجي ظلت على حالها الدورينانوغرام التجربة ، أي الأجسام المضادة ضد بروتين تحت السطح لا تتفاعل لخلايا سليمة (لا مضان أو مضان أضعف بكثير بالمقارنة مع عينة permeabilized كما في الشكل 2B) ، يمكن استنتاج أن بروتين (ق) من الفائدة سطح مكشوف. ادراج تجارب ما قبل الأمصال المناعية (في حالة الأجسام المضادة النسائل المتعددة) ، والسيطرة على سلبية إضافية أمر ضروري للبيانات لا لبس فيها ، وينبغي ألا تسفر مضان كبيرة في خلايا سليمة أو permeabilized (الشكل 2A ، 2C). دابي وصمة عار لا بد من تصور leptospires عندما لاحظ نتائج سلبية (لا فلور اليكسا مضان 488). Counterstaining مع يوديد propidium هو بديل مقبول لدابي. هذا الأسلوب هو نوعية أكثر منها كمية وأكثر إشراقا مضان قد يكون راجعا إلى سطح متعددة تتعرض الحواتم مستضدي يتم التعرف على مستضد واحد بالنسبة لمستضدات أخرى من وفرة على قدم المساواة ولكن مع الحواتم سطح أقل عرضة للخطر. ولذلك يمكن فقط كثافة مضان يمكن استخدامها لمقارنة تفاعل الأجسام المضادة للنفس ، مثل خلايا سليمة مقابل permeabilized وشدة لا مضان بين مختلف البروتينات. هذا التمييز مهم عندما يتم الحصول على نتيجة غامضة حيث لوحظ مضان أقل بكثير في خلايا سليمة من الخلايا في permeabilized (الشكل 2C). مثل هذه النتيجة تشير إلى أن البروتين هو إما في مكان شبه السطحية (مع بعض تلوين الخلفية غير محددة من خلايا سليمة) ، وأضداد ملزمة بشكل تفضيلي لغير الناطقين الحواتم التي يتم كشفها بعد permeabilization الميثانول أو البروتين قد يكون متعددة مواقع التوطين كما هو موضح لتخطيط موارد المؤسسات والبروتينات ELP أخرى ملتوية ، البورلية burgdorferi 14. في كلتا الحالتين ، وهي نتيجة التباس ايفا مثل هذا النهج يتطلب بديلة مثل biotinylation السطحية أو التحلل البروتيني السطح لتحديد ما إذا كان البروتين الفائدة على هذه السطحية المعرضة للأم لا 10. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> مخطط تدفق الرقم 1. السطح للمقايسة المناعية مضان من اللولبيات interrogans البريمية. أولا ، يتم إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من الشرائح الغرفة بشكل جيد لمدة (اثنين على الأقل لكل الشرائح التجربة) والمحتضنة لleptospires التمسك به. المقبل ، يتم إصلاح leptospires على الشرائح غرفة بإضافة 1 مل / بئر بارافورمالدهيد 2 ٪ (PFA) للعينات مع الغشاء الخارجي سليمة (OM) و 1 مل / 100 بئر الميثانول ٪ الباردة للعينات مع OM permeabilized. المقبل ، يتم تحضين leptospires مع الاعتراف الأضداد السطحية المعرضة للبروتينات الأضداد جنبا إلى جنب مع الرقابة على البروتينات السطحية (الابتدائي وآب) حتى 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية التي الحضانة مع 1 مل / فلور جيدا الأضداد اليكسا 488 مترافق الثانوية. أخيرا ، الخلايا التي تصور المجهري مضان. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> التحليل السطحي الرقم 2. المناعي للبروتينات البريميات. وقد بحث البريمية interrogans اللولبيات مع الأمصال المناعية وقبل المناعي ، وكانت النتائج السلبية المقترنة مع دابي ملون مباين لإثبات وجود اللولبيات. واستخدمت مخضر تصفية للكشف عن الأجسام المضادة اليكسا فلور 488 الثانوية المسمى ملزمة لسطح البروتينات المكشوفة وأزرق / سماوي مضان تصفية للكشف عن الحمض النووي ملزمة لدابي الخلية. أ) بحث مع الأضداد Leptospires الاعتراف بروتين سطح مكشوف ، OmpL54 10. ب) بحث مع خلايا أجسام مضادة ضد بروتين محيط بالجبلة الجوفية ، FlaA1 (مراقبة سلبية). C) بحث مع أجسام مضادة ضد خلايا porin البريميات ، OmpL1. تم الكشف عن ملزم الأمصال الأرانب إلى leptospires مع فلور اليكسا 488 شظايا الماعز مترافق مفتش الحكومة المضادة للأرنب. وتتخذ جميع الصور بعد التعرض ثانية 4 طويلة.

<ol>
	<li>Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+facets+of+bacterial+porins.">Multiple facets of bacterial porins.</a> FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).</li><li>Haake, D. A., Matsunaga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+leptospiral+outer+membrane+and+description+of+three+novel+leptospiral+membrane+proteins.">Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.</a> Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+surface+of+Leptospira+interrogans+serovar+grippotyphosa+during+in+vitro+cultivation.">Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation.</a> Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).</li><li>Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+outer+membrane+vesicles+from+a+clinical+isolate+of+Leptospira+interrogans+serovar+Copenhageni.">Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni.</a> Proteomics. 5, 144-152 (2005).</li><li>Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+outer+membrane+and+secreted+proteins+of+Leptospira+interrogans+serovar+pomona.">Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona.</a> Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).</li><li>Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+of+pathogenic+spirochetes.">Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spirochaetal+lipoproteins+and+pathogenesis.">Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis.</a> Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Schulz, G., Benz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The structures of general porins. , (2004).</li><li>Pinne, M., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+approach+to+identification+of+surface-exposed,+outer+membrane-spanning+proteins+of+Leptospira+interrogans.">A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).</li><li>Johnson, R. C., Rogers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+leptospires.+II.+The+action+of+8-azaguanine.">Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine.</a> Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).</li><li>Cullen, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfaceome+of+Leptospira+spp.">Surfaceome of Leptospira spp.</a> Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+sequence+analysis+of+the+gene+encoding+OmpL1,+a+transmembrane+outer+membrane+protein+of+pathogenic+Leptospira+spp.">Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp.</a> J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).</li><li>Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temporal+and+spatial+patterns+of+outer+surface+lipoprotein+expression+generate+population+heterogeneity+and+antigenic+diversity+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).</li><li>Noppa, L., &#214;stberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergstr&#246;m, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P13+an+integral+membrane+protein+of+Borrelia+burgdorferi,+is+C-terminally+processed+and+contains+surface-exposed+domains.">P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains.</a> Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).</li><li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi.">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li><li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence.">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

أسلوبنا ايفا سطح مماثلة لتلك التي تستخدم للتدليل على سطح التعرض borrelial مختلفة 15 و 16 و البريميات 12 و 17 من البروتينات. وصف تفاصيل السطح ايفا الأسلوب هنا صممت للحد من التلاعب في الخلايا وذلك في محاولة للحفاظ على سلامة الغشاء الخارجي مع الاستفادة من اتجاه...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> استمرت كذلك الشرائح غرفة الزجاج </td><td> مختبر تيك </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الأرنب </td><td> Immunochemicals روكلاند </td><td> D209 - 00-0100 </td><td></td></tr><tr><td> البريمية التخصيب EMJH </td><td> دينار بحريني Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L) </td><td> Invitrogen / المسابر الجزيئية </td><td> A - 11034 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا فلور 488 الماعز المضادة للمفتش الماوس (H + L) </td><td> Invitrogen / المسابر الجزيئية </td><td> A - 11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6 - diamidino - 2 - فينيل الأندول هيدروكلوريد (دابي) </td><td> Invitrogen / المسابر الجزيئية </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> إطالة الذهب لمكافحة تصاعد تتلاشى المتوسطة </td><td> Invitrogen / المسابر الجزيئية </td><td> P36930 </td><td> يوازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام </td></tr><tr><td> Fisherfinest زجاج الغطاء بريميوم </td><td> الصياد </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> مضان المجهر </td><td> زايس </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins

وتشارك البروتينات السطحية الجرثومي في اتصال مباشر مع الخلايا المضيفة وامتصاص المغذيات من البيئة 1. لهذا السبب ، لا يمكن توطين الخلوية توفير نظرة ثاقبة لدور وظيفي من البروتينات البكتيرية. توطين سطح البروتينات البكتيرية هي خطوة مهمة نحو تحديد عوامل الفوعة تشارك في آليات المرضية. قد طرق تجزئة البريميات الأغشية 2-5 تكون انتقائية لفئة معينة من الغشاء الخارجي ، البروتينات (خطط إدارة المكاتب) ، مثل البروتينات الدهنية عبر الغشاء مقابل خطط إدارة المكاتب ، وتؤدي بالتالي إلى الخطأ في التصنيف. هذا هو الأرجح بسبب الاختلافات الهيكلية ، وكيف أنها ترتبط إلى الغشاء الخارجي. وترتبط مع البروتينات الدهنية الأغشية عن طريق التفاعل بين مسعور شاردة الدهن N - الطرفي (ثلاثة أحماض الدهنية) ، والدهون الفوسفاتية طبقة ثنائية الدهن 6 ، 7. في المقابل ، عادة ما يتم دمج خطط إدارة المكاتب عبر الغشاء في طبقة ثنائية المادة الدهنية التي متقابلة الزمر β - ترتيب الأوراق في بنية برميل مثل 8 و 9. بالإضافة إلى ذلك ، وجود بروتين في الغشاء الخارجي ، لا يضمن بالضرورة أن يتعرض للبروتين أو المجالات على السطح. ومن المعروف الأغشية الخارجي ملتوياتي أن تكون أساليب هشة ، وبالتالي تنطوي على تلاعب لطيف تتطلب من الخلايا وإدراج الفرعي سطح البروتين ضوابط لتقييم سلامة الغشاء الخارجي. هنا ، ونحن تقديم مقايسة التألق المناعي (IFA) طريقة لتقييم التعرض مباشرة على سطح البروتينات leptospires سليمة. ويستند هذا الأسلوب على الاعتراف البروتينات السطحية البريميات بواسطة أضداد المستضد محددة. هنا ، هي أجسام مضادة محددة لdetetcted OmpL54 10 aftero ملزمة لأصلي الحواتم السطح ، وعرضة للخطر. مقارنة تفاعل الأجسام المضادة لخلايا سليمة مقابل permeabilized تمكن تقييم توزيع الخلوية وجود أو عدم وجود البروتين بشكل انتقائي على سطح البريميات. وينبغي تقييم سلامة الغشاء الخارجي باستخدام أجسام مضادة لبروتين واحد أو أكثر تحت سطح الأرض ، وتقع يفضل أن تكون في الجبلة المحيطية. ويمكن استخدام أسلوب تحليل ايفا سطح سطح التعرض لأي بروتين البريميات التي أضداد محددة متاحة. كلا من فائدة والحد من الأسلوب يعتمد على ما إذا كانت الأجسام المضادة المستخدمة قادرة على ربط الحواتم الأصلي. ربما منذ الأضداد غالبا ما تثار ضد بروتينات المؤتلف ، الحواتم الأصلي من البروتينات السطحية المعرضة لل، لا يمكن الاعتراف بها. ومع ذلك ، فإن الأسلوب ايفا السطح هو أداة قيمة لدراسة مكونات الأسطح البكتيرية سليمة. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب ليس فقط ولكن أيضا لleptospires اللولبيات الأخرى والبكتيريا سالبة الجرام. أقوى الاستنتاجات المتعلقة سطح التعرض للخطط إدارة المكاتب ، فمن المستحسن اتباع نهج شامل تشترك فيه عدة طرق توطين الخلية 10.

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins at JoVE.com

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

وصفت وسيلة فعالة لتقييم التعرض سطح البروتينات البريميات. وهو مصمم خصيصا لطريقة لتجنب اضطراب الغشاء الخارجي للخلايا هشة البريميات. هذا الأسلوب يتطلب العمل من الضوابط سلبية عديدة لتقييم سلامة الغشاء الخارجي ونوعية رد فعل الأجسام المضادة.

المناعية مضان الفحص من البروتينات السطحية المعرضة للالبريميات

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

immuno-fluorescence-assay-of-leptospiral-surface-exposed-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Views.  University of California, Los Angeles. وصفت وسيلة فعالة لتقييم التعرض سطح البروتينات البريميات. وهو مصمم خصيصا لطريقة لتجنب اضطراب الغشاء الخارجي للخلايا هشة البريميات. هذا الأسلوب يتطلب العمل من الضوابط سلبية عديدة لتقييم سلامة الغشاء الخارجي ونوعية رد فعل الأجسام المضادة.

Video: Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

الفحص وحة لنوروفيروس الفئران

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.