Cette étude a été soutenue par Public Health Service subventions AI-34431 (pour DAH) de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses et par VA Fonds de recherche médicale (à la DAH).

1. Fixation des lames de verre Leptospira <ol><li> Leptospira interrogans est une classe BSL2 pathogène. Travailler avec des cellules vivantes elle nécessite la manipulation appropriées, telles que porter des gants, sarrau et les étapes de pipetage dans une hotte stérile. </li><li> Cultivez Leptospira dans EMJH medium11, supplémentés avec du sérum de lapin 1% à 30 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la mi-à fin phase logarithmique (densité de 5 x 10 7 à 5 x 10 8 cellules / ml) pendant environ 6 jours. </li><li> Récolte de la culture par centrifugation à 2000 xg ~ pendant 7 min à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant par aspiration et doucement resuspendre le culot dans un tampon phosphate salin (PBS) -5 mM MgCl 2, pH 7,2 à une concentration finale de 5 x 10 8 cellules / ml. </li><li> Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits de deux lames de verre et de chambre et incuber à 30 ° C pendant 80 min pour permettre aux cellules d&#39;adhérer. </li><li> Retirer délicatement le liquide contenant des cellules non liée par aspiration. </li><li> Fix restantes bactéries intactes des lames de verre en ajoutant 1 ml / puits de paraformaldéhyde à 2% dans du PBS-5 MgCl 2 mM. Incuber pendant 40 min à 30 ° C. Ces lames seront d&#39;évaluation des exposés en surface des protéines. </li><li> Pour évaluer les lames de contrôle de sub-surface des protéines, perméabiliser la membrane externe, en fixant à 1 ml / puits de 100% du méthanol glacé. Incuber à -20 ° C pendant 20 min. Le méthanol agit de plusieurs façons: il perméabilise la membrane externe, denaturates les protéines et les cellules des correctifs pour des lames de verre. </li><li> Retirez la fixation des agents par aspiration. </li></ol> 2. Le marquage avec des anticorps spécifiques <ol><li> Bloc liaison non spécifique en ajoutant 1 ml / puits de tampon de blocage (Difco Leptospira enrichissement EMJH). Incuber à 30 ° C pendant 90 min. </li><li> Diluer l&#39;anticorps spécifique (lapin immunsérums ou d&#39;anticorps monoclonaux de souris, sérums de lapin ici polyclonaux spécifiques pour OmpL54 10, FlaA1 12, et OmpL1 13) et pré-immuns sérums de lapins fluides ascétiques ou la souris ne contenant pas d&#39;anticorps (lorsque utilisé comme contrôle négatif) dans tampon de blocage. Les dilutions pour chaque anticorps doivent être déterminées empiriquement en fonction de titrage d&#39;anticorps, antigène-anticorps de réactivité et de l&#39;abondance de la protéine dans la cellule. La gamme habituelle est de 1:50 à 1:600. </li><li> Retirez le tampon de blocage par aspiration et ajouter 1 ml / puits d&#39;anticorps primaires dilués. </li><li> Incuber à 30 ° C pendant 1h. </li><li> Retirer le liquide par aspiration et laver les puits trois fois avec du PBS (1 ml / puits). </li></ol> 3. Visualisation des leptospires <ol><li> Ajouter 1 ml / puits d&#39;Alexa Fluor 488 anticorps secondaires marqués (soit de chèvre anti-IgG de lapin ou de chèvre anti-IgG de souris) dilué 1:2000 et fluorescentes acide nucléique tache, 4&#39;6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate ( DAPI) dilué à une concentration finale de 0,25 ug / ml dans le tampon de blocage. Cette étape assure la détection de liaison à l&#39;anticorps et la présence de tous les spirochètes indépendant de fixation des anticorps, respectivement. </li><li> Incuber les lames à 30 ° C pendant 45 min. </li><li> Retirer le liquide par aspiration et laver les puits deux fois avec du PBS et une fois avec de l&#39;eau distillée (1 ml / puits). </li><li> Retirez les chambres et la bande adhésive de la lame de verre et d&#39;air sec pendant environ 10 min. </li><li> Ajouter Prolongez Or anti-fade milieu de montage (2 x 20 pi par diapositive) et un 24 x 50 mm lamelle. </li><li> Incuber une nuit à température ambiante dans l&#39;obscurité. Cette étape est nécessaire pour permettre le support de montage pour guérir (durcir). </li><li> Sceau de la lamelle avec du vernis à ongles. </li><li> Visualisez la coloration par microscopie à fluorescence en utilisant une détection cyan / bleu filtre pour DAPI et un filtre de détection vert pour Alexa Fluor 488. Afin de s&#39;assurer que une représentation exacte des échantillons est faite, assurez-vous d&#39;évaluer la zone de la chambre entière pour chaque échantillon. </li><li> Enregistrer les données d&#39;imagerie par un champ représentatif pour chaque échantillon. Quand l&#39;imagerie de fluorescence Alexa Fluor 488, utilisez le même temps d&#39;exposition pour tous les échantillons. L&#39;utilisation d&#39;un temps d&#39;exposition cohérente permettra une comparaison plus précise des résultats avec des antigènes de test par rapport aux témoins. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Exemples de résultats avec des cellules de surface IFA Leptospira interrogans utilisant des anticorps contre la surface et de sub-surface des protéines sont présentées dans la figure 2. Un test est considéré positif lorsque la fluorescence importante est détectée dans les échantillons avec des leptospires intact pour une protéine d&#39;intérêt qui est la surface exposée (figure 2A). Habituellement, lors d&#39;un test positif (ici, la surface exposée OmpL54), environ la même intensité de fluorescence est observée dans des cellules intactes et deux perméabilisées (figure 2A) Il est essentiel d&#39;inclure un contrôle négatif pour l&#39;intégrité des membranes externe utilisant des anticorps contre un sous-sol , de préférence périplasmique des protéines (par exemple leptospires FlaA1, fig. 2B). Ce n&#39;est que lorsque les données montrent que la membrane externe est restée intacte During de l&#39;expérience, à savoir des anticorps contre une protéine de sub-surface ne réagissent pas à des cellules intactes (pas de fluorescence ou fluorescence beaucoup plus faible lorsque comparé à l&#39;échantillon perméabilisées comme dans la Fig. 2B), peut-on conclure que la protéine (s) d&#39;intérêt est surface exposée. L&#39;inclusion d&#39;expériences avec des sérums pré-immuns (dans le cas d&#39;anticorps polyclonaux) comme un contrôle négatif supplémentaire est indispensable pour les données non ambiguë et ne doit pas céder à fluorescence substantiels dans des cellules intactes ou perméabilisées (Fig. 2A, 2C). Tache DAPI est nécessaire pour visualiser les leptospires lorsque les résultats négatifs (pas de fluorescence Alexa Fluor 488) sont observés. Contre-coloration à l&#39;iodure de propidium est une alternative acceptable à DAPI. Cette méthode est qualitative plutôt que quantitative que brillante fluorescence peut être dû à la surface exposée de multiples épitopes antigéniques être reconnue dans un seul antigène par rapport à d&#39;autres antigènes de l&#39;abondance égale, mais avec moins d&#39;épitopes de surface exposée. Par conséquent, les intensités de fluorescence ne peut être utilisé pour comparer la réactivité des anticorps mêmes, telles que des cellules intactes par rapport perméabilisées et des intensités de fluorescence entre pas de protéines différentes. Cette distinction est importante quand un résultat ambigu, où la fluorescence est obtenue significativement moins est observé dans des cellules intactes que dans les cellules perméabilisées (figure 2C). Un tel résultat indique soit que la protéine est dans un endroit du sous-sol (avec une certaine coloration de fond non spécifique des cellules intactes), les anticorps sont obligatoires préférentiellement aux non-autochtones épitopes qui sont exposés après perméabilisation méthanol ou d&#39;une protéine peut avoir plusieurs sites de localisation comme décrit pour les protéines Erp et Elp d&#39;un autre spirochète, Borrelia burgdorferi 14. Dans les deux cas, un résultat ambigu IFA comme celui-ci nécessite des approches alternatives telles que la biotinylation de surface ou la protéolyse de surface pour déterminer si la protéine d&#39;intérêt est exposées à la surface ou non 10. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Organigramme Figure 1. Pour la surface de dosage immuno-fluorescence des spirochètes Leptospira interrogans. Tout d&#39;abord, 1 ml de suspension cellulaire sont ajoutés à chaque puits de diapositives chambre de deux puits (au moins deux lames pour chaque expérience) et incubées pendant les leptospires se conformer. Ensuite, les leptospires sont fixés sur des lames de chambre en ajoutant 1 ml / puits de 2% de paraformaldéhyde (PFA) pour les échantillons avec la membrane externe intacte (OM) et 1 ml / puits de 100% de méthanol à froid pour les échantillons avec perméabilisées OM. Ensuite, les leptospires sont incubées avec des anticorps reconnaissant exposées à la surface des protéines avec des anticorps de contrôle pour les protéines de subsurface (primaire Ab) à 30 ° C pendant 90 min. Ensuite, les anticorps primaires sont détectés par incubation avec 1 ml / puits d&#39;Alexa Fluor 488 anticorps secondaires conjugués. Enfin, les cellules sont visualisées par microscopie à fluorescence. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Analyse de surface Figure 2. Immunofluorescence de protéines de leptospires. Leptospira interrogans spirochètes ont été sondés avec des immunsérums et de pré-immun, et les résultats négatifs ont été jumelés avec une contre-coloration DAPI pour démontrer la présence de spirochètes. Un filtre à fluorescence verte a été utilisée pour détecter Alexa Fluor 488 anticorps secondaire marqué se liant à la surface des protéines exposées et bleu / cyan filtre pour détecter la fluorescence se liant à l&#39;ADN des cellules DAPI. A) Les leptospires sondés avec des anticorps reconnaissant une protéine de surface exposée, OmpL54 10. B) les cellules sondés avec des anticorps contre une protéine périplasmique de subsurface, FlaA1 (contrôle négatif). C) Les cellules sondés avec des anticorps contre la leptospirose porine, OmpL1. La liaison du sérum de lapin aux leptospires ont été détectés avec Alexa Fluor 488 fragments conjugués IgG de chèvre anti-lapin. Toutes les images sont prises après 4 sec longue exposition.

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Notre surface IFA technique est similaire à celui utilisé pour démontrer l&#39;exposition de surface de différentes borrelial 15, 16 et 12 de leptospires, 17 protéines. Les détails de la méthode de la surface IFA décrits ici sont conçus pour minimiser la manipulation de cellules dans un effort pour maintenir l&#39;intégrité de la membrane externe, tout en profitant de la tendance des cellules Leptospira d&#39;adhérer à des lames de verre. La méthode consiste à une concentr...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Deux lames de verre et de chambre </td><td> Lab-Tek </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de lapin </td><td> Immunochemicals Rockland </td><td> D209-00-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira enrichissement EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate (DAPI) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Prolonger d&#39;or anti-fade milieu de montage </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> P36930 </td><td> S&#39;équilibrer à température ambiante avant utilisation </td></tr><tr><td> Fisherfinest verre Couvercle premium </td><td> Fisher </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins

Protéines de surface bactériennes sont impliqués dans le contact direct avec les cellules hôtes et de l&#39;absorption des nutriments provenant de l&#39;environnement 1. Pour cette raison, la localisation cellulaire peut fournir des indications sur le rôle fonctionnel des protéines bactériennes. Localisation à la surface des protéines bactériennes est une étape clé vers l&#39;identification des facteurs de virulence impliqués dans les mécanismes de pathogénicité. Méthodes de fractionnement de leptospires 2-5 membranes peuvent être sélectif pour une certaine classe de protéines de la membrane externe (OMP), telles que les lipoprotéines vs OMP transmembranaire, et donc conduire à une classification erronée. C&#39;est probablement ce qui est dû à des différences structurelles et comment elles sont associées à la membrane externe. Les lipoprotéines sont associés aux membranes par une interaction hydrophobe entre le fragment N-terminal de lipides (trois acides gras) et les phospholipides bicouche lipidique 6, 7. En revanche, les OMP transmembranaires sont généralement intégrés dans la bicouche lipidique par amphipathiques β-feuilles disposées dans une structure en tonneau, comme 8, 9. En outre, la présence d&#39;une protéine dans la membrane externe, ne garantit pas nécessairement que la protéine ou ses domaines sont exposés à la surface. Spirochetal membranes externes sont connus pour être des méthodes fragile et nécessite donc impliquant une manipulation douce des cellules et l&#39;inclusion de sous-surface de la protéine de contrôle pour évaluer l&#39;intégrité de la membrane externe. Ici, nous présentons une technique d&#39;immunofluorescence (IFA) méthode pour évaluer directement l&#39;exposition sur la surface des protéines intactes leptospires. Cette méthode est basée sur la reconnaissance des protéines de surface de leptospires par l&#39;antigène-anticorps spécifiques. Ici, des anticorps spécifiques pour OmpL54 10 sont detetcted aftero se liant à des épitopes natifs de surface, exposée. Comparaison de la réactivité des anticorps aux cellules intactes par rapport perméabilisées permet d&#39;évaluer la distribution cellulaire et si oui ou non une protéine est sélectivement présents sur la surface de leptospires. L&#39;intégrité de la membrane externe devrait être évaluée à l&#39;aide d&#39;anticorps à un ou plusieurs protéines de subsurface, situé de préférence dans le périplasme. La méthode de la surface IFA peut être utilisé pour analyser l&#39;exposition en surface d&#39;une protéine de leptospires à laquelle les anticorps spécifiques sont disponibles. Tant l&#39;utilité et la limitation de la méthode dépend de savoir si les anticorps utilisés sont capables de se lier à des épitopes natifs. Puisque les anticorps sont souvent soulevés contre les protéines recombinantes, les épitopes des indigènes, exposées à la surface des protéines peuvent ne pas être reconnu. Néanmoins, la méthode de la surface IFA est un outil précieux pour l&#39;étude des composantes de la surface intacte bactérienne. Cette méthode peut être appliquée non seulement pour les leptospires, mais aussi d&#39;autres spirochètes et les bactéries gram-négatives. Pour plus fortes conclusions concernant surface d&#39;exposition de OMP, une approche globale impliquant plusieurs méthodes de localisation cellulaire est recommandé 10.

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Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Une méthode efficace pour évaluer l&#39;exposition en surface des protéines de leptospires est décrite. La méthode est spécifiquement conçue pour éviter toute perturbation de la membrane externe des cellules fragiles de leptospires. Cette technique nécessite l&#39;emploi de plusieurs contrôles négatifs pour évaluer l&#39;intégrité de la membrane externe et la spécificité de la réaction d&#39;anticorps.

Immuno-fluorescence Dosage des leptospires exposées à la surface Protéines

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

immuno-fluorescence-assay-of-leptospiral-surface-exposed-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K vues.  University of California, Los Angeles. Une méthode efficace pour évaluer l'exposition en surface des protéines de leptospires est décrite. La méthode est spécifiquement conçue pour éviter toute perturbation de la membrane externe des cellules fragiles de leptospires. Cette technique nécessite l'emploi de plusieurs contrôles négatifs pour évaluer l'intégrité de la membrane externe et la spécificité de la réaction d'anticorps.

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Recherche

Immunologie et infection

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Essai de plaque pour le norovirus murin

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics de phages: approches physiologiques à caractériser de nouvelles protéines virales

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Test très sensible pour la mesure de l&#39;attachement arénavirus-cell

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Ciblage des Thiols de cystéine pour in Vitro in situ Glycosylation des protéines recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.