Diese Studie wurde vom Public Health Service gewähren unterstützt AI-34431 (bis DAH) vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases und VA Medical Research Funds (bis DAH).

1. Fixation von Leptospira auf Glasplättchen <ol><li> Leptospira interrogans ist eine Klasse BSL2 Erregers. Arbeiten mit lebenden Zellen erfordert angemessene Behandlung, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, Labor-Mantel und Pipettierschritte in einem sterilen-Haube. </li><li> Wachsen Leptospira in EMJH medium11, ergänzt mit 1% Kaninchenserum bei 30 ° C bis sie Mitte bis Ende der Log-Phase (Dichte von 5 x 07 bis 5 Oktober x 10 8 Zellen / ml) für ca. 6 Tage. </li><li> Ernte der Kultur durch Zentrifugation bei ~ 2000 xg für 7 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und sanft das Pellet in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) -5 mM MgCl 2, pH 7,2 zu einer Endkonzentration von 5 x 10 8 Zellen / ml. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung von zwei-well Kammer Glasträger und Inkubieren bei 30 ° C für 80 min, damit Zellen zu haften. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit ungebundenen Zellen durch Aspiration. </li><li> Fix intakten Bakterien Glasträger durch Zugabe von 1 ml / well 2% Paraformaldehyd in PBS-5 mM MgCl 2. Inkubieren für 40 min bei 30 ° C. Diese Folien werden für die Beurteilung der Oberflächen-exponierten Proteine. </li><li> Für die Steuerung Dias Beurteilung sub-Oberflächenproteine, permeabilisieren die äußere Membran durch Fixierung mit 1 ml / well aus 100% eiskaltem Methanol. Inkubation bei -20 ° C für 20 min. Methanol wirkt in mehrfacher Hinsicht: es permeabilizes der äußeren Membran, die Proteine ​​denaturiert und fixiert Zellen auf Glasplättchen. </li><li> Entfernen Fixiermittel durch Aspiration. </li></ol> 2. Die Markierung mit spezifischen Antikörpern <ol><li> Block nicht-spezifische Bindung durch Zugabe von 1 ml / Vertiefung Blocking-Puffer (Difco Leptospira Enrichment EMJH). Inkubation bei 30 ° C für 90 min. </li><li> Verdünnen Sie die spezifischen Antikörper (Immun Kaninchenseren oder monoklonalen Maus-Antikörper, hier polyklonalen Kaninchen-Seren spezifisch für OmpL54 10, FlaA1 12 und OmpL1 13) und pre-immune Kaninchenseren oder Maus asketischen Flüssigkeit, die keine Antikörper (wenn sie als negative Kontrollen verwendet) in Blockierungspuffer. Verdünnungen für jeden Antikörper müssen empirisch ermittelt je nach Antikörper-Titer, Antigen-Antikörper-Reaktivität und Fülle des Proteins in der Zelle. Die übliche Strecke ist 1:50 bis 1:600. </li><li> Entfernen Sie die Blocking-Puffer durch Absaugen und Zugabe von 1 ml / well des verdünnten primären Antikörper. </li><li> Inkubation bei 30 ° C für 1h. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und Waschen der Vertiefungen dreimal mit PBS (1 ml / well). </li></ol> 3. Visualisierung von Leptospiren <ol><li> 1 ml / well des Alexa Fluor 488-markierten sekundären Antikörper (entweder Ziege Anti-Kaninchen-IgG oder Ziege anti-Maus IgG) verdünnt 1:2000 und fluoreszierende Nukleinsäure Fleck, 4&#39;6-diamidino-2-phenyl-indol dihydrochlorid ( DAPI), um eine endgültige Konzentration von 0,25 g / ml in Blocking-Puffer verdünnt. Dieser Schritt stellt sicher Detektion von Antikörper-Bindung und die Anwesenheit aller Spirochäten unabhängig von Antikörper-Bindung, bzw.. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger bei 30 ° C für 45 min. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und Waschen der Wells zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem Wasser (1 ml / well). </li><li> Entfernen Sie die Kammern und die Klebestreifen von den Glasplatten und an der Luft trocknen für ~ 10 min. </li><li> Add ProLong Gold-anti-fade Eindeckmedium (2 x 20 ul pro Folie) und einem 24 x 50 mm Deckglas. </li><li> Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dieser Schritt ist notwendig, damit die Montage Medium zu heilen (verhärten). </li><li> Seal das Deckglas mit Nagellack. </li><li> Visualisieren Sie die Färbung mittels Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem cyan / blau-Erkennung Filter für DAPI und einem grünen Filter zur Erkennung von für Alexa Fluor 488. Um sicherzustellen, dass eine genaue Darstellung der Proben vorgenommen wird, stellen Sie sicher, bewerten die gesamte Kammer-Bereich für jede Probe. </li><li> Notieren Sie die Daten durch bildgebende einer repräsentativen Bereich für jede Probe. Bei der Abbildung Alexa Fluor 488 Fluoreszenz, die gleiche Belichtungszeit für alle Proben. Mit einer konsequenten Belichtungszeit erlaubt genaueren Vergleich der Ergebnisse mit Testantigene Vergleich zu den Kontrollen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für oberflächenaktive IFA Ergebnisse mit Leptospira interrogans Zellen mit Antikörpern gegen Oberfläche und Untergrund-Proteine ​​sind in Abbildung 2 dargestellt. Ein Test gilt als positiv, wenn wesentliche Fluoreszenz in den Proben mit intakten Leptospiren für ein Protein von Interesse, dass Oberfläche ausgesetzt ist (Abb. 2A) erkannt. Üblicherweise wird bei einem positiven Test (hier OmpL54 Oberfläche exponiert), ist ungefähr dieselbe Fluoreszenzintensität in beiden intakten und permeabilisierten Zellen beobachtet werden (Abb. 2A) Es ist wichtig, eine negative Kontrolle für die äußere Membran Integrität mit Hilfe von Antikörpern gegen einen Untergrund sind , vorzugsweise periplasmatischen Proteins (z. B. Leptospira FlaA1, Abb.. 2B). Nur wenn die Daten zeigen, dass die äußere Membran ist intakt geblieben During des Experiments, dh Antikörper gegen ein sub-Oberflächenprotein nicht an intakte Zellen (keine Fluoreszenz oder viel schwächere Fluoreszenz, wenn sie permeabilisierten Probe wie in Abb. verglichen. 2B) zu reagieren, kann gefolgert werden, dass das Protein (e) von Interesse ist Oberfläche. Einbeziehung von Experimenten mit Prä-Immunseren (im Falle der polyklonale Antikörper) als zusätzliche negative Kontrolle ist unerlässlich zur eindeutigen Daten und sollten nicht nachgeben erhebliche Fluoreszenz in intakten oder permeabilisierten Zellen (Abb. 2A, 2C). DAPI-Färbung ist notwendig, um Leptospiren visualisieren, wenn negative Ergebnisse (keine Alexa Fluor 488 Fluoreszenz) beobachtet werden. Gegenfärbung mit Propidiumiodid ist eine akzeptable Alternative zu DAPI. Diese Methode ist eher qualitative als quantitative als hellere Fluoreszenz kann auf mehrere ausgesetzte Oberfläche antigene Epitope in einem einzigen Antigen im Vergleich zu anderen Antigenen gleicher Fülle, aber mit weniger exponiert Epitope erkannt. Deshalb ist die Fluoreszenz-Intensitäten können nur verwendet werden, um die Reaktivität des gleichen Antikörper, wie intakt gegenüber permeabilisierten Zellen und nicht Fluoreszenzintensitäten zwischen verschiedenen Proteinen zu vergleichen. Diese Unterscheidung ist wichtig, wenn ein zwiespältiges Ergebnis erzielt wird, wo deutlich weniger Fluoreszenz in intakten Zellen als in permeabilisierten Zellen (Abb. 2C) beobachtet. Ein solches Ergebnis deutet darauf hin, dass entweder das Protein in einer Sub-Surface-Standort ist (mit einigen nicht-spezifische Hintergrundfärbung von intakten Zellen), sind die Antikörper binden vorzugsweise an nicht-native Epitope, die nach Methanol Permeabilisierung oder ein Protein ausgesetzt sind möglicherweise mehrere Lokalisierung Websites für Erp und Elp Proteine ​​eines anderen Spirochäten, Borrelia burgdorferi 14 beschrieben. In jedem Fall erfordert eine zweideutige IFA Ergebnis wie diese alternative Ansätze wie Oberfläche Biotinylierung oder Oberfläche Proteolyse um festzustellen, ob das Protein von Interesse Oberfläche exponiert sind oder nicht 10 ist. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Ablaufschema für die Oberfläche Immun-Fluoreszenz-Assay von Leptospira interrogans Spirochäten. Zuerst wird 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung von zwei-und Kammer-Objektträgern aufgenommen (mindestens zwei Rutschen für jedes Experiment) und inkubiert Leptospiren zu halten. Als nächstes werden Leptospiren zu Kammer-Objektträgern durch Zugabe von 1 ml / well 2% Paraformaldehyd (PFA) für Proben mit intakten äußeren Membran (OM) und 1 ml / well aus 100% kaltem Methanol für Proben mit permeabilisierten OM fixiert. Als nächstes werden Leptospiren mit Antikörpern, die Oberflächen-exponierten Proteine ​​zusammen mit Kontroll-Antikörper für die unterirdische Proteine ​​(Primary AB) bei 30 ° C für 90 min inkubiert. Dann werden die primären Antikörper durch Inkubation mit 1 ml / well des Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären Antikörpern nachgewiesen. Schließlich werden die Zellen visualisiert durch Fluoreszenzmikroskopie. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Oberfläche Immunfluoreszenz Analyse von Leptospira-Proteine. Leptospira interrogans Spirochäten wurden mit Immun-und Prä-Immunseren sondiert und negativen Ergebnisse wurden mit einer DAPI Gegenfärbung gepaart, um das Vorhandensein von Spirochäten nachweisen. Eine grüne Fluoreszenz-Filter verwendet wurde, um Alexa Fluor 488 markierten sekundären Antikörper-Bindung an exponierten Proteine ​​und blau / cyan Fluoreszenzfilter Oberfläche DAPI Bindung an Zell-DNA erkennen zu erkennen. A) Leptospiren sondiert mit Antikörpern, die eine Oberfläche ausgesetzt Protein, OmpL54 10. B) Zellen sondiert mit Antikörpern gegen ein periplasmatischen Untergrund Protein, FlaA1 (negative Kontrolle). C) Die Zellen sondiert mit Antikörpern gegen Leptospiren Porin, OmpL1. Die Bindung von Kaninchenseren auf Leptospiren wurden mit Alexa Fluor 488 konjugierten Ziege anti-Kaninchen-IgG-Fragmente nachgewiesen werden. Alle Bilder sind nach 4 Sek. langen Belichtungszeiten aufgenommen.

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	<li>Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+facets+of+bacterial+porins.">Multiple facets of bacterial porins.</a> FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).</li><li>Haake, D. A., Matsunaga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+leptospiral+outer+membrane+and+description+of+three+novel+leptospiral+membrane+proteins.">Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.</a> Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+surface+of+Leptospira+interrogans+serovar+grippotyphosa+during+in+vitro+cultivation.">Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation.</a> Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).</li><li>Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+outer+membrane+vesicles+from+a+clinical+isolate+of+Leptospira+interrogans+serovar+Copenhageni.">Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni.</a> Proteomics. 5, 144-152 (2005).</li><li>Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+outer+membrane+and+secreted+proteins+of+Leptospira+interrogans+serovar+pomona.">Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona.</a> Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).</li><li>Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+of+pathogenic+spirochetes.">Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spirochaetal+lipoproteins+and+pathogenesis.">Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis.</a> Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Schulz, G., Benz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The structures of general porins. , (2004).</li><li>Pinne, M., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+approach+to+identification+of+surface-exposed,+outer+membrane-spanning+proteins+of+Leptospira+interrogans.">A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).</li><li>Johnson, R. C., Rogers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+leptospires.+II.+The+action+of+8-azaguanine.">Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine.</a> Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).</li><li>Cullen, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfaceome+of+Leptospira+spp.">Surfaceome of Leptospira spp.</a> Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+sequence+analysis+of+the+gene+encoding+OmpL1,+a+transmembrane+outer+membrane+protein+of+pathogenic+Leptospira+spp.">Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp.</a> J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).</li><li>Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temporal+and+spatial+patterns+of+outer+surface+lipoprotein+expression+generate+population+heterogeneity+and+antigenic+diversity+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).</li><li>Noppa, L., &#214;stberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergstr&#246;m, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P13+an+integral+membrane+protein+of+Borrelia+burgdorferi,+is+C-terminally+processed+and+contains+surface-exposed+domains.">P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains.</a> Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).</li><li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi.">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li><li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence.">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li></ol>

Unsere Oberfläche IFA-Technik ist ähnlich, mit dem die Oberfläche Exposition verschiedener Borrelien 15, 16 und Leptospira 12, 17 Proteine ​​zu demonstrieren. Die Details der Oberfläche IFA hier beschriebene Methode sollen die Manipulation von Zellen in dem Bemühen um äußere Membran Integrität zu erhalten minimieren und gleichzeitig die Vorteile der Tendenz der Leptospira Zellen auf Glas-Objektträger haften. Das Verfahren beinhaltet eine niedrigere Konzentration (2% versus 4%) Paraform...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Zwei-well Kammer Glasträger </td><td> Lab-Tek </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchenserum </td><td> Rockland Immunochemicals </td><td> D209-00 bis 0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira Enrichment EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold-anti-fade Eindeckmedium </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> P36930 </td><td> Äquilibrieren auf Raumtemperatur vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium-Deckglas </td><td> Fischer </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins

Bakterielle Oberflächenproteine ​​in direktem Kontakt mit Wirtszellen und in Aufnahme von Nährstoffen aus der Umwelt 1 beteiligt. Aus diesem Grund können zelluläre Lokalisation Einblicke in die funktionelle Rolle der bakteriellen Proteine ​​liefern. Oberflächen-Lokalisation von bakteriellen Proteinen ist ein wichtiger Schritt in Richtung Identifizierung von Virulenzfaktoren in Mechanismen der Pathogenität beteiligt. Verfahren zur Fraktionierung von Leptospira-Membranen Mai 02 bis 05 werden selektiv für eine bestimmte Klasse von äußeren Membranproteinen (OMPs), wie Lipoproteine ​​vs transmembrane OMPs und damit zu Fehlklassifikation führen. Dies dürfte sich aufgrund der strukturellen Unterschiede und wie sie sich an die äußere Membran verbunden. Lipoproteine ​​sind mit Membranen über eine hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den N-terminale Lipid-Einheit (drei Fettsäuren) und der Lipid-Doppelschicht Phospholipide 6, 7 verbunden sind. Im Gegensatz dazu sind transmembrane OMPs typischerweise in die Lipid-Doppelschicht von amphipathischen β-Blätter in einem Fass-ähnliche Struktur 8, 9 angeordnet integriert. Darüber hinaus bedeutet Anwesenheit eines Proteins in der äußeren Membran nicht unbedingt gewährleistet, dass das Protein oder seine Domänen auf der Oberfläche ausgesetzt sind. Spirochäten äußeren Membranen sind dafür bekannt, fragil und erfordern daher Methoden, bei denen sanfte Manipulation von Zellen und die Einbeziehung von Sub-Surface-Protein kontrolliert, um die Integrität der äußeren Membran zu beurteilen. Hier präsentieren wir ein Immunfluoreszenztest (IFA)-Methode, um direkt zu bewerten Oberfläche Exposition von Proteinen auf intakten Leptospiren. Diese Methode beruht auf der Anerkennung von Leptospira-Oberflächenproteine ​​von Antigen-spezifischen Antikörpern. Hierbei werden Antikörper, die spezifisch für OmpL54 10 detetcted aftero Bindung an native, ausgesetzte Oberfläche Epitope. Vergleich der Antikörper-Reaktivität auf intakte gegenüber permeabilisierten Zellen ermöglicht die Evaluierung der zellulären Verteilung und ob ein Protein selektiv präsentieren auf Leptospira-Oberfläche ist. Die Integrität der äußeren Membran sollten anhand Antikörper gegen ein oder mehrere unterirdische Proteine, vorzugsweise im Periplasma lokalisiert werden. Die Oberfläche IFA-Methode kann verwendet werden, um Oberflächen Exposition von Leptospira-Protein, an das spezifische Antikörper zur Verfügung zu analysieren. Sowohl die Nützlichkeit und die Einschränkung des Verfahrens hängt davon ab, ob die eingesetzten Antikörper sind in der Lage, auf native Epitope binden. Da Antikörper oft gegen rekombinante Proteine, Epitope des nativen, Oberflächen-exponierten Proteine ​​ausgelöst werden, darf nicht angesetzt werden. Dennoch ist die Oberfläche IFA-Methode zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung Komponenten des intakten Bakterien Oberflächen. Diese Methode kann nicht nur für Leptospiren, aber auch andere Spirochäten und Gram-negativen Bakterien angewendet werden. Für eine stärkere Rückschlüsse auf Oberflächen-Exposition von OMPs, ist ein umfassender Ansatz mit mehreren Zell-Lokalisation Methoden 10 empfohlen.

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Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Eine effiziente Methode, um Oberflächen-Exposition von Leptospira-Proteine ​​zu beurteilen ist beschrieben. Die Methode ist speziell für die Störung des empfindlichen äußeren Membran von Leptospira-Zellen zu vermeiden. Diese Technik erfordert Beschäftigung von mehreren negativen Kontrollen, um die Integrität der äußeren Membran und eine Spezifität von Antikörper-Reaktion zu beurteilen.

Immuno-Fluoreszenz-Assay von Leptospira-Surface-exponierten Proteine

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Eine effiziente Methode, um Oberflächen-Exposition von Leptospira-Proteine ​​zu beurteilen ist beschrieben. Die Methode ist speziell für die Störung des empfindlichen äußeren Membran von Leptospira-Zellen zu vermeiden. Diese Technik erfordert Beschäftigung von mehreren negativen Kontrollen, um die Integrität der äußeren Membran und eine Spezifität von Antikörper-Reaktion zu beurteilen.

Serie: Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Hochempfindliches Verfahren zur Messung von Arenavirus-Zell-Anlage

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.