מחקר זה נתמך על ידי השירות לבריאות הציבור מענק AI-34431 (ל DAH) מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות VA ועל ידי קרנות מחקר רפואי (כדי DAH).

1. קיבוע של Leptospira על שקופיות הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Leptospira interrogans הוא פתוגן בכיתה BSL2. עבודה עם תאים חיים זה דורש טיפול מתאים, כגון כפפות, מעבדה מעיל צעדים pipetting במנדף סטרילי-a. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Leptospira ב EMJH medium11, בתוספת סרום ארנבת 1% ב 30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים אמצע לשלב מאוחר-log (צפיפות של 5 x 07-05 אוקטובר 10 x 8 תאים / מ&quot;ל) כ 6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את התרבות על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 ~ 7 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ​​ידי שאיפה בעדינות resuspend את הכדור בתוך בופר פוספט (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 לריכוז סופי של 5 x 10 8 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של השעיה התא היטב כל שני גם שקופיות הזכוכית קאמרית לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 80 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את נוזל המכיל תאים מאוגד על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חיידקים שלמים שנותרו כדי שקופיות הזכוכית על ידי הוספת 1 ​​מ&quot;ל / היטב paraformaldehyde 2% PBS-5 mM MgCl 2. דגירה של 40 דקות בקצב של 30 ° C. אלו שקופיות יהיה הערכה של השטח נחשפו חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שקופיות בקרה להערכת בתת הקרקע חלבונים, permeabilize הממברנה החיצונית על ידי קיבוע עם% 1 מ&quot;ל / 100 היטב קר כקרח מתנול. דגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מתנול פועל בכמה דרכים: היא permeabilizes הממברנה החיצונית, denaturates את החלבונים, ומתקן התאים שקופיות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לתקן סוכני ידי שאיפה. </li></ol> 2. סימון נוגדנים ספציפיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הלא ספציפית מחייב ידי הוספת 1 מ&quot;ל / היטב חיץ חסימה (Difco Leptospira העשרה EMJH). לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את נוגדן ספציפי (ארנב סרה החיסון או נוגדנים חד שבטיים עכבר, ארנב סרה polyclonal כאן ספציפית OmpL54 10, FlaA1 12, OmpL1 13) מראש החיסונית סרה עכבר או ארנבת סגפן נוזל המכיל אין נוגדן (כאשר נוצלו כפקדי שלילית) חסימת חיץ. דילולים עבור כל נוגדן צריך להיקבע באופן אמפירי בהתאם כייל נוגדנים, אנטיגן נוגדן ריאקטיביות שפע של חלבונים בתא. הטווח המקובל הוא 1:50 עד 1:600. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ חסימת ידי שאיפה ולהוסיף 1 מ&quot;ל / טוב של נוגדנים העיקרי בדילול מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 1h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוזל על ידי שאיפה לשטוף שלוש פעמים בארות עם PBS (1 מ&quot;ל / טוב). </li></ol> 3. ויזואליזציה של leptospires <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל / טוב של אלקסה פלואוריד 488 שכותרתו נוגדנים משני (או אנטי IgG ארנבת עז או עז אנטי עכבר IgG) מדולל 1:2000 ו חומצות גרעין הניאון כתם, 4&#39;6-diamidino-2-פניל-אינדול dihydrochloride ( DAPI) מדולל לריכוז סופי של 0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​חסימת חיץ. צעד זה מבטיח זיהוי של נוגדן מחייב ואת הנוכחות של כל שהחיידקים עצמאית של נוגדן מחייב, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוזל על ידי שאיפה לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS ופעם עם מים מזוקקים (1 מ&quot;ל / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חדרי ואת רצועת דבק מן שקופיות זכוכית ואוויר יבש דקות 10 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף להאריך בינוני זהב אנטי לדעוך הרכבה (2 x 20 μl לכל שקופית) ו 24 x 50 מ&quot;מ לכסות להחליק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בטמפרטורת החדר בחושך. צעד זה הכרחי על מנת לאפשר הרכבה בינונית לרפא (להקשות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הפתק לכסות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את מכתים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ציאן / כחול זיהוי לסנן DAPI ומסנן זיהוי ירוק אלקסה פלואוריד 488. כדי להבטיח ייצוג מדויק של הדגימות הוא עשה, ודא שאתה להעריך את שטח החדר כולו מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הנתונים על ידי הדמיה שדה נציג עבור כל דגימה. כאשר הדמיה אלקסה 488 פלואוריד פלואורסצנציה, לנצל את הזמן חשיפה זהה עבור כל הדגימות. באמצעות זמן חשיפה עקבית יאפשר השוואה מדויקת יותר של תוצאות הבדיקה עם אנטיגנים לעומת שולטת. </li></ol> 4. נציג תוצאות: דוגמאות לתוצאות משטח IFA עם תאים Leptospira interrogans באמצעות נוגדנים כנגד פני השטח בתת הקרקע החלבונים שמוצג באיור 2. הבדיקה נחשבת חיובית כאשר הקרינה משמעותית זוהה בדגימות עם leptospires שלם של חלבון עניין זה נחשף משטח (איור 2 א). בדרך כלל, בבדיקת חיובי (כאן, פני השטח חשופים OmpL54), עוצמת הקרינה אותו כ הוא ציין גם בתאים שלמים permeabilized (איור 2 א) זה חיוני לכלול שליטה שלילי שלמות הקרום החיצוני באמצעות נוגדנים כנגד מתחת לפני הקרקע , periplasmic עדיף חלבון (למשל leptospiral FlaA1, איור. 2B). רק כאשר הנתונים מראים כי הקרום החיצוני נותר ללא שינוי דוריng את הניסוי, כלומר נוגדנים נגד חלבון משטח משנה לא מגיבים תאים שלמים (לא הקרינה או הקרינה חלשה בהרבה בהשוואה מדגם permeabilized כמו באיור. 2B), ניתן להסיק כי חלבון (ים) של הריבית משטח חשוף. הכללה של ניסויים עם סרה מראש החיסונית (במקרה של נוגדנים polyclonal) כפקד שלילי נוסף הוא חיוני נתונים חד משמעי ולא צריך להיכנע הקרינה משמעותית תאים שלמים או permeabilized (איור 2A, 2C). DAPI כתם יש צורך לדמיין leptospires כאשר תוצאות שליליות (ללא פלואוריד פלואורסצנציה אלקסה 488) הם נצפו. Counterstaining עם יודיד propidium מהווה חלופה מקובלת DAPI. שיטה זו היא איכותית ולא כמותית כמו הקרינה בהיר יכול להיות בגלל משטח מרובים חשוף epitopes antigenic להיות מוכר אנטיגן אחד ביחס אנטיגנים אחרים של שפע שווה אבל עם epitopes משטח פחות חשוף. לכן בעוצמות הקרינה ניתן להשתמש רק להשוות את התגובה של נוגדנים אותו, כגון תאים שלמים מול permeabilized ועוצמות לא הקרינה בין חלבונים שונים. הבחנה זו חשובה כאשר תוצאה מעורפלת מתקבל שבו הקרינה באופן משמעותי פחות נצפה בתאים שלמים מאשר בתאים permeabilized (איור 2C). כאלה מכך עולה כי גם החלבון נמצא במיקום בתת הקרקע (עם כתמים שאינם ספציפיים קצת רקע של תאים שלמים), הנוגדנים מחייבים מעדיפים שאינם ילידי epitopes חשופים לאחר permeabilization מתנול או חלבון יכול להיות מספר אתרים לוקליזציה כפי שתואר עבור חלבונים ERP ו ELP של החיידק אחר, Borrelia burgdorferi 14. בכל מקרה, התוצאה IFA מעורפלים כגון זה דורש גישות חלופיות כגון biotinylation פני השטח או proteolysis פני השטח כדי לקבוע אם החלבון של עניין הוא משטח חשוף או לא 10. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. תרשים זרימה תרשים עבור השטח חיסונית הקרינה assay של שהחיידקים Leptospira interrogans. ראשית, 1 מ&quot;ל של השעיה תא מתווסף גם כל אחד שני גם שקופיות קאמרית (לפחות שתי שקופיות עבור כל ניסוי) ו מודגרות עבור leptospires לדבוק. בשלב הבא, leptospires קבועים לשקופיות קאמרית על ידי הוספת 1 מ&quot;ל / היטב paraformaldehyde 2% (PFA) עבור דגימות עם הממברנה החיצונית שלם (OM) ו - 1 מ&quot;ל / גם של 100% מתנול קר דגימות עם permeabilized OM. בשלב הבא, leptospires מודגרת עם נוגדנים להכיר משטח חשוף החלבונים יחד עם נוגדנים בקרה חלבונים מתחת לפני הקרקע (Primary א.ב.) בשעה 30 ° C במשך 90 דקות. לאחר מכן, נוגדנים העיקרי מזוהים על ידי הדגירה עם מ&quot;ל 1 / טוב של אלקסה פלואוריד 488 נוגדנים משני מצומדות. לבסוף, התאים הם דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="איור 2"/> 2. איור Surface ניתוח immunofluorescence של חלבונים leptospiral. Leptospira שהחיידקים interrogans נבדקו עם סרה החיסונית מראש החיסונית, והתוצאות היו שליליות יחד עם counterstain DAPI להפגין נוכחות שהחיידקים. ירוק מסנן הקרינה היה בשימוש כדי לזהות אלקסה פלואוריד 488 נוגדנים משני שכותרתו מחייב משטח חלבונים חשוף כחול / טורקיז מסנן הקרינה לזהות DAPI מחייב את ה-DNA בתא. א) נחקר Leptospires עם נוגדנים להכיר חלבון משטח חשוף, OmpL54 10. ב) חקר תאים עם נוגדנים כנגד חלבון periplasmic מתחת לפני הקרקע, FlaA1 (שליטה שלילי). ג) תאים נחקר עם נוגדנים נגד leptospiral porin, OmpL1. עקידת סרה ארנב אל leptospires התגלו עם אלקסה פלואוריד 488 מצומדות נגד ארנב שברי עז IgG. כל התמונות נלקחות לאחר חשיפה 4 שניות ארוכות.

<ol>
	<li>Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+facets+of+bacterial+porins.">Multiple facets of bacterial porins.</a> FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).</li><li>Haake, D. A., Matsunaga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+leptospiral+outer+membrane+and+description+of+three+novel+leptospiral+membrane+proteins.">Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.</a> Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+surface+of+Leptospira+interrogans+serovar+grippotyphosa+during+in+vitro+cultivation.">Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation.</a> Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).</li><li>Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+outer+membrane+vesicles+from+a+clinical+isolate+of+Leptospira+interrogans+serovar+Copenhageni.">Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni.</a> Proteomics. 5, 144-152 (2005).</li><li>Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+outer+membrane+and+secreted+proteins+of+Leptospira+interrogans+serovar+pomona.">Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona.</a> Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).</li><li>Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+of+pathogenic+spirochetes.">Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spirochaetal+lipoproteins+and+pathogenesis.">Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis.</a> Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Schulz, G., Benz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The structures of general porins. , (2004).</li><li>Pinne, M., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+approach+to+identification+of+surface-exposed,+outer+membrane-spanning+proteins+of+Leptospira+interrogans.">A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).</li><li>Johnson, R. C., Rogers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+leptospires.+II.+The+action+of+8-azaguanine.">Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine.</a> Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).</li><li>Cullen, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfaceome+of+Leptospira+spp.">Surfaceome of Leptospira spp.</a> Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+sequence+analysis+of+the+gene+encoding+OmpL1,+a+transmembrane+outer+membrane+protein+of+pathogenic+Leptospira+spp.">Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp.</a> J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).</li><li>Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temporal+and+spatial+patterns+of+outer+surface+lipoprotein+expression+generate+population+heterogeneity+and+antigenic+diversity+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).</li><li>Noppa, L., &#214;stberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergstr&#246;m, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P13+an+integral+membrane+protein+of+Borrelia+burgdorferi,+is+C-terminally+processed+and+contains+surface-exposed+domains.">P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains.</a> Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).</li><li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi.">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li><li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence.">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

משטח IFA שלנו היא טכניקה דומה לזה המשמש כדי להדגים את חשיפת פני השטח של borrelial שונים 15, 16 ו leptospiral 12, 17 חלבונים. הפרטים של השיטה משטח IFA שתוארו כאן נועדו למזער את המניפולציה של תאים, במטרה לשמור על שלמות הממברנה החיצונית תוך ניצול הנטייה של תאים Leptospira לדבוק שקופ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> שני היטב זכוכית תא שקופיות </td><td> Lab-Tek </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב בסרום </td><td> רוקלנד Immunochemicals </td><td> D209-00-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira העשרה EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 נגד ארנב עז IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / בדיקות מולקולריות </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר עז IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / בדיקות מולקולריות </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-פניל-אינדול dihydrochloride (DAPI) </td><td> Invitrogen / בדיקות מולקולריות </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך בינוני זהב אנטי לדעוך הרכבה </td><td> Invitrogen / בדיקות מולקולריות </td><td> P36930 </td><td> לאזן לטמפרטורת החדר לפני השימוש </td></tr><tr><td> Fisherfinest כיסוי זכוכית Premium </td><td> דיג </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins

חלבונים חיידקיים משטח מעורבים בקשר ישיר עם תאים המארח ספיגת חומרים מזינים מן הסביבה 1. מסיבה זו, לוקליזציה הסלולר יכולים לספק תובנות על תפקיד פונקציונלי של חלבונים חיידקיים. לוקליזציה Surface של חלבונים חיידקיים היא צעד מפתח לקראת זיהוי של גורמים ארסיות מעורבים מנגנונים של pathogenicity. שיטות fractionating leptospiral 2-5 ממברנות עשוי להיות סלקטיבי לסוג מסוים של הממברנה החיצונית, חלבונים (OMPs), כגון ליפופרוטאינים לעומת OMPs הטרנסממברני, ולכן להוביל misclassification. סביר זאת בשל הבדלים מבניים ואיך הם קשורים אל הממברנה החיצונית. ליפופרוטאינים הקשורים ממברנות באמצעות אינטראקציה הידרופובי בין מחצית N-מסוף השומנים (שלושה חומצות שומן) לבין פוספוליפידים bilayer השומנים 6, 7. לעומת זאת, OMPs הטרנסממברני משולבים בדרך כלל על ידי amphipathic β גיליונות מסודרים במבנה דמוי חבית 8, 9 לתוך bilayer השומנים. בנוסף, הנוכחות של חלבון בקרום החיצוני אינה מבטיחה בהכרח כי חלבון או תחומים שלו חשופים על פני השטח. הקרומים החיצוניים Spirochetal ידועים להיות שיטות שביר ולכן מחייבים מעורבים מניפולציה עדינה של תאים הכללת חלבון משטח משנה שולט על מנת להעריך את שלמות הממברנה החיצונית. כאן, אנו מציגים assay immunofluorescence (IFA) שיטה ישירות להעריך את החשיפה של חלבונים על פני השטח leptospires ללא פגע. שיטה זו מבוססת על ההכרה של חלבונים פני השטח leptospiral ידי אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים. בזאת, נוגדנים ספציפיים עבור OmpL54 10 הם detetcted aftero מחייב, epitopes יליד משטח חשוף. השוואה של תגובתיות נוגדנים לתאי שלם לעומת permeabilized מאפשר הערכה של התפלגות סלולרית והאם החלבון מצוי באופן סלקטיבי על פני השטח leptospiral. שלמות של הממברנה החיצונית יש לבחון באמצעות נוגדן אחד או יותר חלבונים מתחת לפני הקרקע, הממוקמת רצוי periplasm. השיטה משטח IFA ניתן להשתמש כדי לנתח את החשיפה פני השטח של כל חלבון leptospiral שבה נוגדנים ספציפיים זמינים. גם את התועלת והגבלה של השיטה תלויה בשאלה אם הנוגדנים המועסקים מסוגלים להיקשר epitopes הילידים. מאז נוגדנים לעתים קרובות מועלות כנגד חלבונים רקומביננטי, epitopes של הילידים, משטח חשוף חלבונים לא יכול להיות מוכר. עם זאת, שיטת משטח IFA הוא כלי רב ערך ללימוד מרכיבי משטחי חיידקים שלמים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לא רק עבור leptospires אלא גם שהחיידקים אחרים חיידקים גראם שליליים. לקבלת מסקנות חזקה לגבי משטח החשיפה של OMPs, גישה מקיפה הכוללת מספר שיטות לוקליזציה תא מומלץ 10.

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins at JoVE.com

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

שיטה יעילה כדי להעריך את פני חשיפה של חלבונים leptospiral מתואר. השיטה היא תוכננה במיוחד כדי למנוע שיבוש של הממברנה החיצונית של התאים leptospiral שביר. טכניקה זו דורשת עבודה של בקרות שלילי מספר להעריך את היושרה של הממברנה החיצונית הספציפיות של תגובת הנוגדנים.

חיסונית פלואורסצנציה Assay של משטח חשוף חלבונים Leptospiral

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

immuno-fluorescence-assay-of-leptospiral-surface-exposed-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Views.  University of California, Los Angeles. שיטה יעילה כדי להעריך את פני חשיפה של חלבונים leptospiral מתואר. השיטה היא תוכננה במיוחד כדי למנוע שיבוש של הממברנה החיצונית של התאים leptospiral שביר. טכניקה זו דורשת עבודה של בקרות שלילי מספר להעריך את היושרה של הממברנה החיצונית הספציפיות של תגובת הנוגדנים.

Video: Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Assay רובד לnorovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.