نشكر أعضاء المختبر لاجراء مناقشات مفيدة Wingert البيولوجيا آكي الزرد والتقنيات ، وديب جيم لتبادل وصفته methylcellulose. الكتاب كما أود أن أعرب عن امتناننا للموظفين في مركز نوتردام للبحوث اسماك الزرد لتوفير الرعاية الممتازة تربية الجارية لمستعمرة الزرد لدينا. يؤيد التمويل من منح الجائزة NIH - NIDDK DK083512 ، ومختبر السخي البدء بتمويل من جامعة نوتردام ، وهذا العمل.

1. Microinjection الداخلي لتسمية الزرد سليفة الكلوة القريبة ظهارة نبيب لهذا الإجراء ، ونحن نستخدم نظام microinjection (هارفارد Appartus ، PLI90) ، مع توفير الهواء المضغوط عن طريق ضاغط الهواء (يونيو الهواء ، نموذج 6-4) ، وأجهزة micromanipulator (Narishege أجزاء MN151 ، IP3 ، وGJI) التي يتم تجميعها في محطة stereomicroscope (نيكون ، SMZ التكبير 645) كما في تعليمات الشركة الصانعة. وتقارن ديكستران endocytosed بسهولة من قبل نبيب نفرون القريبة ، مما يتيح وضع العلامات التفضيلية لهذه الفئة من السكان الخلايا الظهارية 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن التعرض للزرقة الميثيلين إبراز تألق ذاتي من الكيس المحي ويجعل من التصور نفرون الأنابيب أكثر صعوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة المخصبة في 28.5 إلى timepoint التنموي بين 48-55 ساعة بعد الإخصاب (HPF) درجة مئوية. هذه هي المرحلة المثالية لأداء microinjections اليرقات بسبب سهولة التي يمكن أن يؤديها microinjection العضلي ، ولأن وظيفة الكلى يبدأ في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي المشيماء من الزرد لم يفقس باستخدام زوج من ملقط الغرامة. شطف الحطام المشيماء من طبق بتري وإعادة ملء الطبق مع 30 مل من محلول تعديل E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد علبة الحقن للأجنة. يتم حقن القالب المفضل لدينا 1.5 ٪ agarose/E3 ، والتي تتشكل المنخفضات الثلاثي بحيث يمكن وضعه داخل الجنين عن طريق الحقن. لجعل حقن القالب ، ونحن تعويم قالب من البلاستيك مع نتوءات على شكل وتد (بالتفصيل 11 سابقا) في طبق بتري مليئة قاعدة agarose 1.5 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الإبر microinjection الزجاج عن طريق سحب الأنابيب الشعرية مع مجتذب الإبرة ، كما هو موضح في كتاب اسماك الزرد 10. باختصار ، سحب أنابيب زجاجية الشعرية ثم استخدم ملقط معدني غرامة لقطع رأس الإبرة microinjection لجعل غيض مع نقطة حادة أثناء عرض غيض إبرة تحت stereomicroscope. تخزين مغطاة بقطع الإبر في طبق بتري وضعه على الملاعب الرملية لحماية النمذجة حافة قطع ومنع تراكم الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الحقن لتسمية نبيب القريبة. حل 40 دينار ديكستران - فلوريسئين المتقارن (Invitrogen ، D1845) بتركيز 1 ملغ / مل في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتخدير الأسماك ، وإضافة 5 مليليتر من 0.2 درجة الحموضة 7.0 ٪ Tricaine إلى طبق بتري تحتوي على يرقات الزرد في 30 مليليتر من E3. الأسماك هي تخدير عندما لم يعد يحمل استجابة اللمس. فمن الأهمية بمكان أن يتم تخدير السمكة تماما أو أنها سوف تحاول نشل على ضخها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأسماك إلى حقنة تخدير علبة العفن باستخدام الماصة نقل من البلاستيك. موقف الحيوانات مع رئيسها في أعمق جزء من الاكتئاب الثلاثي جيدا ، وعلى جانبها بحيث يكون الجذع يستريح على طول الجانب من زاوية البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء microinjection العضلي. تحميل إبرة قطع 2-3 مع ميكرولتر من فلوريسئين دكستران ، وحقن الحيوان في الجسيدة الجذع مع ما يقرب من 1 NL من الحل. الهدف للجزء العلوي من الجسيدة ، وتجنب تمديد كيس المح. هذا يضمن أن لا يتم نبيبات نفرون تعطل ميكانيكيا بواسطة عملية microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزرد لحقن طبق بتري نظيفة ، وإضافة محلول E3 تعديلها. شطف الحيوانات 3 مرات مع E3 جديدة لإزالة كل آثار Tricaine. تغطية غطاء طبق بتري مع رقائق الألومنيوم الخفيف لتوفير الحماية للدكستران ، والعودة إلى الحيوانات الحاضنة 28 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> 2. استهدفت التذرية الليزر من الخلايا القريبة نبيب لهذا الإجراء ، ونحن مع استخدام stereomicroscope epifluorescence ليسجل مع الحيوانات المنوية فلوريسئين ديكستران القريبة الزاهية التي تحمل علامات وحدد لهذه التذرية الليزر. ثم ، ونحن نستخدم ليزر نابض micropoint النظام (الآلات الضوئية ، المؤتمر الوطني العراقي) التي تم تركيبها على مجهر مركب (نيكون الكسوف 80i epifluorescent مع المرفقات) ، ومعايرة لاستخدامها في تعليمات الشركة الصانعة ، لأداء نفرون الاجتثاث الخلية. كان لدينا أكثر نجاحا في خلية التذرية باستخدام فلتر FITC التي تمكن الباحث لعرض المناطق تحت الإضاءة الفلورسنت نبيب brightfield. مقدما من هذا الإجراء ، وإعداد وسائل الاعلام لاجتثاث الشلل عن طريق إذابة methylcellulose 1.5 ٪ في tricaine/E3 0.02 ٪. aliquots مخزن للmethylcellulose للاستخدام الفوري في درجة حرارة الغرفة ، أو على 4 درجات مئوية على المدى الطويل التخزين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الزرد HPF بإضافة 5 72 مليليتر من 0.2 ٪ إلى 7.0 درجة الحموضة Tricaine طبق بتري تحتوي على يرقات الزرد في 30 مليليتر من E3. الأسماك هي تخدير عندما لم يعد يحمل استجابة اللمس. فمن الأهمية بمكان أن يتم تخدير السمكة تماما أو أنها سوف تحاول نشل على أداء التذرية الليزر. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الحيوانات حقنها تحت وضع الفلورسنت المناسب وحدد الحيوانات التي يمكنك بسهولة تصور الأنابيب القريبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة لاختيار طبق منفصل يحتوي tricaine. يمكن للحيوانات أن تخدير لمدة تصل إلى 30 دقيقة قبل تنفيذ الاجتثاث الخلية. إذا كنت النتيجة&gt; 15 الحيوانات ، والعودة إلى تلك التي تحتوي على صحن منفصل الطازجة E3 في انتظار تعديل الاجتثاث حيث أن كل خلية التذرية تستغرق عدة دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء التذرية ، نقل أحد الزرد لتخدير طبق بتري صغيرة تحتوي على 1.5 ٪ tricaine methylcellulose/0.02 ٪ لمدة 2 دقيقة لغسل الأجنة في وسائل الإعلام الشلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، ونقل الجنين الى الشريحة الزجاجية التي تحتوي على الاكتئاب بنسبة انخفاض قدرها 1.5 ٪ methylcellulose/0.02 tricaine ٪. موقف الحيوانات برفق مع لجنة التحقيق ان هذه الغرامة جانبها تواجه الشريحة البطنية والجانبية الظهرية يكون مواجها لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشريحة على المسرح compund المجهر ، والتركيز على الجانب الظهري من الحيوان. أداء الاقتلاع من الخلايا تحت نفرون التركيز بالضغط على دواسة القدم. سترى تشتت مضان كما هي الخلايا الكلوية ablated الظهارية (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات برفق ablated إلى بئر في صحن رفاه 12 لزراعة اللاحقة. شطف E3 2-3 مرات لغسل بعيدا methylcellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، ورفع الحيوان إلى timepoint المطلوب وإجراء التحليل المطلوب وفقا للوضع تقنيات النسيجية والجزيئية للأجنة الزرد الشباب (الشكل 2). </li></ol> 3. ممثل النتائج : البيانات التي تظهر في الشكل 1 يبين timecourse الاجتثاث. بعد الحقن العضلي مع ديكستران - تقارن ، هو المسمى تفضيلي نبيب القريبة. تم استخدام حقن ديكستران - FITC لتسمية الكلى للالتذرية الليزر ، وكان يعاد ضخ الحيوانات ablated مع ديكستران - رودامين في أحد الاجتثاث timepoint الإضافية التالية لreimage السكان نبيب القريبة. ويمكن استخدام تقنيات تحليل التعبير في مثل تهجين الموقع لتحليل التغييرات في عينات ثابتة في timepoints احد الاجتثاث الخلية التالية ، كما هو مبين في الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 : ويتبع الإجراء الليزر التذرية التي التجديد السريع للظهارة نبيب (AC) Timecourse التغيرات الخلوية أثناء وبعد الاستئصال بالليزر نبيبات اليرقة الزرد الداني في وقت الاجتثاث (يوم 3 ، لوحة أ) ، أو واحد أو ثلاثة. آخر أيام التذرية (يوم 4 ، لوحة باء ؛ يوم 7 ، لوحة C). (الأعلى) تظهر الرسومات موقف نفرون ، مع ديكستران - FITC (الخضراء) وديكستران رودامين - (الحمراء) ، و (القاع). الصور الحية عن السيطرة والليزر ablated النيفرون (لوس انجليس) <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : تحليل الجينات التعبير التالي التذرية الليزر التذرية الليزر على بعد 3 أيام ، كانت ثابتة الأجنة ومعالجتها بواسطة جبل بأكمله في الموقع التهجين للكشف عن النصوص slc20a1a التي بمناسبة الدانية الجزء نبيب الملتوية للنفرون. (أ) الجنين السيطرة التي كانت لا تخضع لالتذرية الليزر ، (B) في جنين الذي كان ablated مساحة كبيرة من ظهارة أنبوبية ، و (C) في جنين الذي كان ablated فاصل زمني قصير من ظهارة نبيب. الخط الأسود يدل على مدى نبيب والداني في تقديم خدمات مرجعية والخطوط الزرقاء تدل على مدى التذرية الليزر في الألواح قبل الميلاد ، ويدل على سيطرة * (غير ablated) نفرون المقابل في لوحات ق.

<ol>
	<li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure.">Acute renal failure.</a> New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+surviving+epithelial+cells+in+acute+renal+failure.">Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.</a> J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+kidney+development.">The cellular basis of kidney development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).</li><li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).</li><li>Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+to+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).</li><li>Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125, 4655-4657 (1998).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).</li><li>Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+kidney+repair.">Contribution of stem cells to kidney repair.</a> Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).</li><li>Devarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+mechanisms+of+ischemic+acute+kidney+injury.">Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kid. Int. , (2010).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

والزرد هو كائن النموذج المستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء العديد من جوانب العلم ، والتطبيقات التي تنمو 6. وقد أدى توظيف في النظام النموذجي الزرد في دراسة أمراض الكلى مثل الفشل الكلوي الحاد على الملاحظات الهامة وسوف تستمر في أن تكون نموذجا جيدا لدراسة إصابة الكلى 7،8. مع الجينوم الذي تم التسلسل والبروتوكولات الجزيئية كثيرة في المكان ، أصبح من السهل على نحو متزايد لتنفيذ البحوث المتطورة التي تستخدم الزرد النماذج المعدلة وراثيا ، ضربة قاضية الجينات ودراسات misexpression. والزرد لديه دورة حياة قصيرة مع الأحجام الكبيرة وجيل محددة جيدا المراحل التنموية. وعلاوة على ذلك ، والمراحل الجنينية الزرد واليرقات وشفافة إلى حد كبير ، مما يجعل دراسات التصوير ممكنا من دون تشريح للكائن. طوال المراحل الجنينية واليرقات ، والزرد والكلى سليفة تتألف من اثنين من النيفرون ، التي تبقى واضحة خلال هذه timepoints التنموية. الزرد النيفرون سليفة هي مشابهة في التركيب والوظيفة لنظرائهم من الثدييات ، مما يجعلها نموذجا جيدا للدراسات الفشل الكلوي الحاد 4،5. الكلى أمر حاسم لبقاء البشر والفقاريات الأخرى ، بوصفه الجهاز الذي يطهر الجسم من النفايات السائلة الأيض. هذه المهمة تقع على التطهير قدرة النيفرون الكلى لتصفية الدم ، ومن ثم تعديل رشاحة يقوم بجمع النفايات النتروجينية لإفراز والحفاظ في نفس الوقت توازن السوائل والكهارل. وتتألف النيفرون لتصفية الدم ، أنبوبية الظهارية ، وتصب في قناة و. السلامة الهيكلية والوظيفية لجميع الأجزاء الثلاثة جزء لا يتجزأ من وظيفة نفرون. يمكن الشتائم المختلفة إلى الكلى ، بما في ذلك التعرض للnephrotoxins ، نقص التروية ، أو عرقلة تدفق البول نتيجة مساحات في AKI 1. وكثيرا ما يرتبط في علم الأمراض من AKI مع 1،2 نخر أنبوبي حاد. وقد أظهرت الدراسات السريرية التي تلت ذلك الفشل الكلوي لديها معدل وفيات الأطفال التي يمكن أن تتراوح في أي مكان 7-80 ٪ اعتمادا على سبب وسياق الفشل الكلوي. ومع ذلك ، يرتبط على نحو متزايد التشخيص السريع وعكس السبب الكامن وراء الانتعاش مع AKI عبر تجديد نبيبات نفرون نخرية. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن تعيين مصير السكان الخلية الرئيسية التي repopulates نبيبات نفرون معطوبة الخلايا الظهارية التي تنشأ من المناطق المجاورة لم يصب 12. هذه النتائج لم تكن قد قضت على احتمال أن الكلوي الجذعية / السلف الخلايا يمكن أن تشارك في هذه العملية ، وتقارير مستقلة اشارت الى ان خلايا نخاع العظام المستمدة يمكن أن تسهم في تجديد الكلوي 13. فمن الواضح أن هناك حاجة لاستمرار التحقيقات في حل أفضل مصادر التجدد الخلوي الظهارية الكلوية. كلا نفرون التجدد والتنمية حصة ظاهرة تبديل في ولاية الخلوية بين الظواهر الوسيطة والظهارية. أثناء تطوير نفرون ، وخلايا اللحمة المتوسطة السلف التمايز إلى النمط الظاهري ثابتة ، لربط الغشاء القاعدي لتشكيل الظهارة الأنبوبية 3. وتكهنت ظاهرة هجرة الخلايا الظهارية في أعقاب فشل كلوي حاد يستوجب فقد التمايز إلى النمط الظاهري الوسيطة. ومن المثير للاهتمام ، فإن الدراسات الحديثة تشير الى ان خلايا اللحمة المتوسطة في الكلى التالفة يحمل ملف تعريف التعبير مماثلة إلى خلية الوسيطة خلال التنمية 14. وقد كشفت تقارير مختلفة التغييرات في خلية التصاق جزيئات البروتينات المصفوفة ، والسيتوكينات chemokines. بعد الوسيطة المقترحة للانتقال الظهارية وخلايا يحشدوا على الغشاء القاعدي ومعاودة نشاطات الظهارية الأنبوبية. تحديد الجينات المهم في هذه العملية لا تزال موضوعا للبحث عن المختبر وغيرها. الكثير من العمل لتوضيح العوامل الرئيسية في هذه العملية لا يزال يتعين القيام به ، ولكن تم بشرت تقدما كبيرا في المجال من خلال دراسة آثار الجنتاميسين. AKI والفشل الكلوي الناجم عن جنتاميسين وثيق الصلة بالنظر إلى انتشار مجمعات كلى تستخدم في الطب 15. تستخدم كعلاج للسالبة الجرام الالتهابات البكتيرية ، وإقامة الأمينوغليكوزيد يؤدي الى الاصابة الحادة في 10-25 ٪ من الحالات. هذا الدواء يسبب مجموعة كبيرة من الآثار السلبية الخلوية ، مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج معا أو نخر في خلايا أنبوبية عديدة. وقد وجدت الدراسات المخدرات لربط تفضيلي لمجمع شكلتها megalin cubulin والتي تشارك في الإلتقام. تم العثور على هذه الجزيئات في وفرة في الخلايا الظهارية للنبيب القريبة ، على الرغم من أنها لا تقتصر على التعبير في هذه الخلايا. من خلال الإشارات الخلوية مما أدى إلى تحريض الاكسدة ، وإطلاق سراح vasoconstrictors ، ونضوب ATP الخلوية ، ونقص الأكسجين ، وتثبيط phospholipases ، والمضادات الحيوية وجنتاميسين تسبب مماثلةموت الخلايا المبرمج ونخر في الخلايا الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، والمضادات الحيوية يؤدي الانكماش مسراق الكبيبة في تصفية الدم نفرون (الكبيبة) ، مما أدى إلى انخفاض في معدل الترشيح الكبيبي وتغيير سلبا على قدرة الكلى على تصفية الدم. إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية ، والجزيئات immunostimulatory ، وتفعيل phospholipases آثار منتشر في نفرون ، وخلق أمراض الكارثية التي تؤدي إلى فشل كلوي حاد. في حين أن دراسات مشابهة للمضادات الحيوية والجنتاميسين كانت وستظل أدوات مهمة للبحوث التجديد الكلى ، وأنها تفتقر إلى الدقة التي يمكن أن تكون مفيدة في معالجة بعض المسائل. نظامنا باستخدام الزرد بالتزامن مع الليزر التذرية طريقة المبينة في هذا البروتوكول يجيب على الحاجة لمثل هذا أداة بحث دقيقة. الليزر التذرية يسمح للباحثين للحث على تدمير خلايا في المناطق المحورية للنبيب كلوي ، بدءا من الصغيرة (2-3) إلى السكان (&gt; 5-10) كبير ، مع دقة لا تضاهى. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم طريقة تم تطويرها من قبل التعرض لديكستران - تقارن تفضيلي لتسمية السكان نبيب القريبة الظهارية. بدلا من ذلك ، يمكن أن تستخدم خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء في واحدة أو أكثر من المناطق نبيب. على سبيل المثال ، cadherin17 : eGFP المعدلة وراثيا يحمل الزرد مضان قوي في المناطق البعيدة نبيب (على الرغم من ضعف في السكان القريبة) ، ويمكن أن تكون ذات قيمة للدراسات التجديد في قطاعات أخرى نبيب 16. سيتم تسليط الضوء على تمكين نفرون الوقت الفاصل بين تسجيل الفيديو من التغيرات الخلوية مع مرور الوقت. عندما يقترن دراسات التعبير الجيني مثل جبل بأكمله في الموقع التهجين أو المناعية ، يمكن للباحثين الكشف عن التغيرات الجزيئية في نفرون مع مرور الوقت. أخذت معا ، يمكن أن تبدأ مثل هذه الاستراتيجيات لصياغة فهم أكثر ديناميكية من الأحداث التي ترشح عندما يتم تدمير الخلايا الظهارية الكلوية. التحذير الرئيسية لدينا نموذج الليزر التذرية هي أنه قد ألخص جوانب جزئية من الظروف الفسيولوجية التي ترشح في AKI الإنسان. وفاة الخلية من خلال الأضرار المادية الناجمة عن حظية يختلف عن سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى نخر في الخلايا ، وعلى هذا النحو العوامل الخلطية في هذه microenvironments مختلفة قد لا تكون متطابقة. بالإضافة إلى ذلك ، توجد أدلة على موت الخلايا المبرمج بفعل الاصابة خلال الكلى ، وليس من المعروف ما إذا كانت هذه الآثار ارشح إهانة التالية مع الليزر. ومع ذلك ، تماما كما خلية ثقافة هو أداة أفضل إجابات بعض الأسئلة التي تتطلب بيئة محكومة إلى حد كبير ، التذرية الليزر ستكون بمثابة رقابة شديدة A في الجسم الحي من طراز AKI. على هذا النحو ، حصل على رؤى من الدراسات الكلوي الاجتثاث الظهارية في الزرد سيعزز احتمال اكتشاف الأفكار الأساسية التي يمكن تطبيقها على التحقيقات عن وقوع اصابات الكلوي الأخرى والتي يحتمل استخدامها لخلق أفضل التشخيص لدى البشر.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> جنين الأطباق </td><td> صقر </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> تشريح ملقط </td><td> Roboz </td><td> RS - 5010 </td></tr><tr><td> حقن الابر </td><td> سوتر Intruments </td><td> BF100 - 50-10 </td></tr><tr><td> عالى النقاء agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (دينار) ، ديكستران فلوريسئين </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> البلاستيك نقل الماصة </td><td> سامكو العلمية وفيشر </td><td> 204 ، 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> سيغما </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> سيغما </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> الاكتئاب الشريحة </td><td> الصياد </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12 طبق جيدا </td><td> كورنينج </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

يتميز إصابة الكلى الحاد (كونا) عن طريق ارتفاع معدلات الوفيات من تدهور وظائف الكلى على مدى ساعات أو أيام والذي يبلغ ذروته في الفشل الكلوي 1. يمكن أن يكون سبب الفشل الكلوي الحاد من جانب عدد من العوامل من بينها نقص التروية سمية الدواء ومقرها ، أو إصابات معوقة 1. هذه النتائج في عدم القدرة على الحفاظ على توازن السوائل والكهارل. في حين لوحظ AKI لعقود ، والعلاجات السريرية فعالية ما زال يتعين تطويرها. يثير الاهتمام والفضول ، وبعض المرضى الذين يعانون من استعادة وظائف الكلى آكي مع مرور الوقت ، وهي ظاهرة الغامضة التي تم rudimentally تتميز فقط 1،2. وقد أظهرت الأبحاث باستخدام نماذج من الثدييات AKI أن نقص تروية الكلى أو جرح ، nephrotoxin تجربة موت الخلايا الظهارية في نبيبات نفرون 1،2 ، وحدات وظيفية في الكلى التي تتكون من سلسلة من المناطق المتخصصة (شرائح) من أنواع الخلايا الظهارية 3 . في غضون النيفرون ، موت الخلايا الظهارية هو أعلى في الخلايا نبيب القريبة. هناك أدلة توحي بأن يتبع تدمير الخلية فقد التمايز ، والانتشار ، وهجرة الخلايا الظهارية المحيطة بها ، والتي يمكن تجديدها بالكامل نفرون 1،2. ومع ذلك ، هناك الكثير من علامات الاستفهام حول آليات التجديد الظهارية الكلوية ، بدءا من الاشارات التي تعدل هذه الأحداث لأسباب الاختلاف واسعة من القدرات بين البشر لتجديد الكلى الجرحى. والزرد اليرقات يقدم نموذجا ممتازا لدراسة تجديد الكلى الظهارية ويتكون من الكلى لسليفة النيفرون التي يتم حفظها مع ارتفاع 4،5 الفقاريات بما فيها الثدييات. يمكن لليرقات النيفرون الزرد يمكن تصور مع تقنيات مضان بسبب الشفافية النسبية للالزرد الشباب 6. وهذا يوفر فرصة فريدة لخلية الصور والتغيرات الجزيئية في الوقت الحقيقي ، على النقيض من نماذج الثدييات النيفرون حيث لا يمكن الوصول إليها بسبب الكلى والنظم المعقدة هيكليا منضوية تحت لواء الحيوانية. استخدمت الدراسات التي أجريت مؤخرا في جنتاميسين أمينوغليكوزيد كوكيل أعمال للالسامة المسببة لدراسة آكي والفشل الكلوي لاحقا : لقد ثبت جنتاميسين والمضادات الحيوية الأخرى لسبب AKI في البشر ، والباحثين قد وضعت وسائل لاستخدام هذا العامل لتحريك تلف الكلى في الزرد 7 (8). ومع ذلك ، فإن التأثيرات السمية أمينوغليكوزيد اليرقات في الزرد كارثية وقاتلة ، مما يشكل صعوبة عند دراسة تجديد الظهارية وظيفة مع مرور الوقت. أسلوبنا يعرض استخدام الاجتثاث الخلية المستهدفة كأداة لدراسة الرواية الإصابة الظهارية في الزرد. الليزر التذرية يعطي الباحثين القدرة على إحداث موت الخلايا في مجموعة سكانية محدودة من الخلايا. يمكن استهداف مناطق مختلفة من الخلايا بناءا على الموقع الصرفية ، وظيفة ، أو حتى التعبير عن النمط الظاهري خلوي معين. وبالتالي ، فإن الاقتلاع بالليزر زيادة خصوصية ما يمكن للباحثين دراسة ، ويمكن أن يكون طريقة فعالة جديدة لتسليط الضوء على آليات التجدد الظهارية الكلوية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع لاستهداف السكان الخلية في الأجهزة الأخرى في الجنين الزرد لدراسة الإصابات والتجدد في أي عدد من سياقات الفائدة.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration at JoVE.com

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

إصابة الكلى الحاد (كونا) في البشر مشكلة شائعة السريرية الناجمة عن الأضرار التي لحقت الخلايا الظهارية التي تشكل النيفرون الكلى ، ويرتبط آكي مع ارتفاع معدلات الوفيات من 50-70 ٪<sup&gt; 1</sup&gt;. بعد تدمير الخلايا الظهارية ، النيفرون لديهم قدرة محدودة على التجدد ، على الرغم من تبقى غير مفهومة تماما الآليات والقيود التي توجه هذه الظاهرة. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن لدينا وصف تقنية الليزر التذرية التي تستهدف خلايا الكلى نفرون في الكلى الجنين الزرد ، أو سليفة الكلوة. يمكن استخدام الأسلوب الجديد لاستكمال الكلوي الناجم عن النماذج من AKI ، واكتساب فهم عالية الدقة من الخلية والتعديلات الجزيئية التي ترتبط مع التجدد الظهارية في نفرون الكلوي.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

laser-ablation-zebrafish-pronephros-to-study-renal-epithelial

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Views.  University of Notre Dame. إصابة الكلى الحاد (كونا) في البشر مشكلة شائعة السريرية الناجمة عن الأضرار التي لحقت الخلايا الظهارية التي تشكل النيفرون الكلى ، ويرتبط آكي مع ارتفاع معدلات الوفيات من 50-70 ٪ 1. بعد تدمير الخلايا الظهارية ، النيفرون لديهم قدرة محدودة على التجدد ، على الرغم...

Video: Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

قشري الخلايا العصبية : الانتقال من التقدم في مختبر لخلية القاعدة العلاجات

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

فأري إجراء زراعة الكلى

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

طرق لدراسة بربل الفكين اسماك الزرد

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

تطبيق حمض الريتينويك الحصول الثقافات Osteocytes من الابتدائية ماوس خلايا الأوستيوبلاستس

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...