وقد وضعت هذه الأساليب التي كتبها ثعبان البحر خلال إجازة البحوث في مختبر JT وقدم الدعم من قبل مجلس جامعة ديبول البحوث والمعاهد الوطنية للصحة / NIDCR R01 منحة لJT (DE016678). نحن الامتنان لجهود هنتر كارولين والحيوان فني الرعاية الأساسية في CMRC مرفق الزرد وبولينا Pawluczuk مساعد مختبر لدينا في المرحلة الجامعية.

تربية الزرد ويضم الزرد وتربيتها وفقا للأساليب القياسية 1. الفترة الماضية من اليرقات في وقت متأخر ، ويمكن قياس المرحلة التنموية التي من الزرد طوله القياسي (SL) ، أو على مسافة خط مستقيم في ملليمتر من وجهة anteriormost من الشفة العليا إلى قاعدة الزعنفة الذيلية (لوحة hypural تأخرا) 2. في حوالي شهر واحد آخر الإخصاب (10-12 ملم SL) ، والأنف والفكين barbels تظهر براعم الظهارية شفافة وحفر بالقرب من حاسة الشم ، وعلى الزوايا الخلفية للفك ، على التوالي. كما ينضج الزرد ، وتمتد إلى barbels ضيقة تشبه الزوائد الطولي. لأن بربل الفك العلوي أكبر (2-3 ملم) وأسهل في التعامل معها ، لدينا بروتوكول ينطبق فقط على هذا أطرافهم خاصة ، وتقنيات مشابهة ، ومع ذلك ، يمكن تكييفها لبربل أصغر الأنف. بربل قطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الزرد الكبار في المرحلة المطلوبة (على سبيل المثال. ، 1،5-2،5 سم SL ، ~ 3-6 أشهر بعد الإخصاب) من قبل الانغماس في 0،015 ٪ MS - 222 (3 - إيثيل أمينوبنزوات methanesulfonate) مخزنة إلى 7.0 درجة الحموضة في المياه النظام. مراقبة حركات السباحة حتى وقف والتهوية الخيشومية تصبح بطيئة ومنتظمة. تبعا لحجم الأسماك ، والتخدير الكامل يستغرق حوالي 2-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شبكة صيد السمك حوض السمك ، ونقل الأسماك 1-3 في وقت لقطعة مطوية من منشفة ورقية مبللة في طبق بتري. باستخدام ملعقة حادة ، توجيه السمك بحيث تكون موازية للجانب كل الأطراف الأخرى وتركها. أضعاف جزء من منشفة ورقية مبللة على جزء الذيلية للأسماك ، الذي يغطي الجسم كله حتى الوصاد (الخيشومية يغطي) للحفاظ على الجلد والخياشيم رطبة أثناء العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض لوحة بيتري تحت stereomicroscope ، وذلك باستخدام المنخفضة زاوية ضوء الحادث لإلقاء الضوء على منطقة الرأس. التركيز على قاعدة باربيل في الفك العلوي الأيسر ، الذي يبرز من الزاوية بطني الخلفي من الفك العلوي (الشكل 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم بإحكام رمح من بربل البعيدة قليلا إلى حافة الفك العلوي. رفع رمح باربيل وتدرج بين فكي مقص الربيع الجميلة ذات الرؤوس القريبة عادل للملقط. ويمكن لمس مقص للملقط لتحقيق الاستقرار. انزلاق فكي مقص على طول رمح من بربل حتى حافة القطع تقترب من حافة الفك العلوي. إغلاق المقص لقطع طريق رمح باربيل. وبترت باربيل ، لا تزال في قبضة الملقط ، يمكن إزالة التثبيت أو لمزيد من المراقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور إلى خزان الأسماك الصغيرة من المياه النظيفة نظام (~ 500 مل) تحتوي على قطرة واحدة من الميثيلين الأزرق لمكافحة العدوى الفطرية السطحية. السماح للأسماك لاسترداد بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، وعودة الأسماك إلى نظام التربية. بربل التجدد هو القصوى بعد 2 أسابيع. </li></ol> التضمين آغار من أزواج بربل متطابق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع السمك بواسطة تقنية القتل الرحيم المناسبة والإصلاح في أنبوب 50 مل من 4 ٪ بارافورمالدهيد فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الهياج عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ينبغي أن يكون حجم تثبيتي ، لا يقل عن عشرة أضعاف حجم الأنسجة. بعد التثبيت ، والتخلص من النفايات في حاوية بارافورمالدهيد المعتمدة وشطف جيدا في أنسجة عدة تغييرات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد في زجاج مل 250 مل 150 قارورة من 2 ٪ agarose (T م ~ 37 درجة مئوية) في الماء المقطر. الحرارة مع الميكروويف أو صفيحة ساخنة ، تهييج دوريا حتى تتفكك. يوازن الحل المنصهر في حمام ماء 50-60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع هلام إستشراد القياسية تلاعب بوضع الصغيرة العفن هلام gasketed (10 × 10 سم ، ~ جل 100 مل الحجم) بحزم ضد جانبي الغرفة العازلة. إضافة 2-4 صغير ذو أسنان المشط العينة (4 × 1.5 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سطح مستو ، صب agarose ذاب في القالب فقط لتغطية قاعدة أمشاط ، وتشكيل الآبار الضحلة جدا. وضعت على الفور agarose بقايا العودة الى حمام ماء دافئ ، وسيتم استخدامها لاحقا لتضمين هذا النسيج (خطوات 9-12). وضع الزجاج طويلة ماصة باستور في قارورة للحفاظ على ماصة للحرارة نفس agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للهلام لتتصلب لمدة 20-30 دقيقة. إزالة كومز ، ثم إزالة العفن الذي يحتوي على هلام هلام صلابة من الغرفة العازلة. الشريط بقوة الجانبين مفتوحة من العفن هلام مع الشريط المختبر حتى الجل لا تنزلق. وينبغي توسيع نطاق هذا الشريط عدة مليمترات على سطح agarose بحيث يمكن إضافة agarose إضافية في وقت لاحق (الخطوة 13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف العفن هلام على مرحلة من مراحل stereomicroscope. تكبير بئر فارغة وتقديمهم إلى حواف التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سطح من agarose المتاخمة للبئر ، ماصة قطرة ماء أو العازلة التي تحتوي على عينات بربل الثابتة (على سبيل المثال ، تجديد والتحكم). USIدبابيس عازمة نانوغرام الحشرات ، وسحب العينات رطبة في البئر ودفعهم الى القاع. توجيه مهاوي بربل موازية لبعضها البعض والانحياز ضد حواف طويلة العكس من البئر. وسوف يعقد التوتر السطحي مساعدة النسيج في الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصبح مستعدة لتضمين ، استخدام غيض ماصة الغرامة أو زاوية مختبر الانسجة لازالة السوائل الزائدة من البئر. العمل بسرعة حتى لا السماح للنسيج تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستير حرارة الزجاج ، ماصة بلطف agarose المنصهرة جديدة داخل وحول عينات الأنسجة لختم باربيل في المكان. لا يفيض. قبل agarose يصلب ، وجعل تعديلات في اللحظة الاخيرة مع دبابيس الحشرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة مرقمة عينة التسمية بجوار البئر وآمن مع هبوط صغير من agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 6 إلى 10 لكل بئر من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك لمعايرة الصور ، اضافة الى وجود قطعة من الورق مع مقياس ميكرومتر المطبوعة (على سبيل المثال ، <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) في أسفل فارغة أيضا. تتسطح الورقة إلى قاع البئر ، وتغطي مع agarose الدافئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هي جزء لا يتجزأ من جميع العينات ، وعلى سطح هلام يكون غير منتظم ، مع قطرات من تصلب agarose. وضع الجل على سطح مستو وتصب بلطف في agarose ذاب اضافية حتى السطح العلوي هو موحد. استخدام أقل قدر من agarose اللازمة للحصول على سطح أملس ؛ الكثير agarose سوف يحجب الضوء ينتقل التصوير الفوتوغرافي. تسمح هذه الطبقة العليا لتتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن للهلام يتم تصويرها على المسرح لstereomicroscope لتسجيل مورفولوجيا الإجمالي لكل زوج باربيل. يتم الحصول على ذلك عن طريق تصوير صورة معايرة مقياس ميكرومتر المضمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين الجل بأكمله ملفوفة في ورقة المناشف المبللة ومختومة في كيس من البلاستيك عند 4 درجة لعدة أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيد من التحليل ، يمكن خفض آغار كتل تحتوي على زوج متطابق من barbels من هلام بشفرة حلاقة ومشرط أو المجهزة للالبارافين أو الأنسجة cryosectioning بالطرق العادية 3،4. بدلا من ذلك ، يمكن تشريح barbels الفرد من agarose الإبر مع غرامة ، وتشطف في الماء ، وتجهيزها لتطبيقات المصب الأخرى (على سبيل المثال ، كلها أو جبل المناعية مبائر المجهري). </li></ol>

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+General+Methods+for+Zebrafish+Care.">Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+length:+Not+quite+so+standard.">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning.">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+8.3+Agar+Embedding+for+Cryostat+Sectioning+of+Embryos+or+Larvae.">Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+bud+development+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li></ol>

في الفك العلوي الزرد بربل هو نظام الأنسجة غير المستغلة لدراسة النمو وصيانة وتجديد العديد من أنواع الخلايا في الزرد. على الرغم من أن ليس لديه ذيل بربل التناظرية الإنسان ، والحفاظ عاليا أنواع الخلايا التي يحتوي عليها ، مما يجعل من الممكن دراسة الجلد والغدد والأوعية الدموية الصباغية ، والأعصاب في بنية أسطوانية واضحة وبسيطة بصريا تشريحيا. مشابهة للزعنفة الذيلية مدروسة ، ويمكن أن يكون ذلك حافزا لتجديد أنسجة بربل بواسطة البتر. به حدود الفك ومعلما التشريحية ، يمكن وضع الطائرة بتر بدقة ، وتسهيل إعادة نمو قياس باربيل. لعامل الخبرة ، كل جراحة يستغرق سوى بضع ثوان. الانتعاش السريع ، وليس لدينا حتى الآن الكشف عن أي آثار قصيرة أو طويلة الأجل على سلوك الأسماك. الزرد مع واحدة تسبح بربل الفك العلوي ، وتناول الطعام وتتكاثر بشكل فعال كما غير الجراحية الضوابط ، ويكون البقاء للمقارنة إلى الوقت لجمع الأنسجة ، وتصل إلى 6 أشهر بعد الجراحة. وتوقع الأثر الفسيولوجية لهذه الجراحة أن يكون الحد الأدنى ل1) تم العثور أيضا على براعم الذوق خارج الفم محمولا على بربل على أجزاء أخرى كثيرة من الأسماك ظهارة ، بما في ذلك الشفاه والخدين والرأس 5 ، و 2) براعم الذوق التفريق تظهر على بربل وتجديد في غضون 72 ساعة (وكلير وآخرون ، بيانات غير منشورة.) وهذا يجعل من نظام الفك العلوي بربل مينيملي لدراسة التئام الجروح ، وعودة التوعي ، وعودة التعصيب ضمن سياق الفقاريات الكبار. بعد تحريض الجراحية للتجديد ، يمكن جمعها على فترات barbels لقياس morphometric و / أو التحليل المجهري للانسجة محددة. مريح ، والفك العلوي بربل تقريبا طول (2-3 ملم) وقطرها (100-200 ملم) من جنين الزرد ، وتسهيل تطبيق البروتوكولات القياسية عديدة ، بما فيها الأنسجة البارافين ، cryosectioning ، المناعية كلها جبل ، وفي الموضع التهجين. أخذت معا ، وهذه الميزات تجعل من الفك العلوي بربل خيارا ممكنا للغاية في الجسم الحي نموذج لدراسة إصلاح الأنسجة وتجديدها.

مجهر معدات مطلوب مجهر تشريح ستيريو مع الحادث وأحال إضاءة من الألياف الضوئية لقطة باربيل وتضمينها آغار. بربل قطة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأسماك نظام المياه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 الزرد عبور الدبابات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MS - 222 (3 - إيثيل أمينوبنزوات methanesulfonate ؛ سيغما الكيميائية # E10521 - 10G) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبق بتري معقمة من عيار 120 ملم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناشف ورقية مبللة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملعقة معدنية حادة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 55 دومون بيو INOX الملقط (أدوات العلوم الجميلة # 11255-20) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصغرة Vannas مقص الربيع (العلوم أدوات الجميلة # 15000-00) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عامل مضاد للفطريات الميثيلين الأزرق (Drs. فوستر أند سميث # CD - 905781) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شبكة صيد السمك حوض السمك الصغير </li></ul> جمع الأنسجة وتضمينها آغار <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ٪ في بارافورمالدهيد 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PF - PBS) ، حتى aliquoted في أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها في المجمد -20 درجة مئوية استخدام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X الفوسفات مخزنة المالحة (الرقم الهيدروجيني 7،27-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارورة 250 مل زجاج </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ٪ agarose في الماء المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معيار صغيرة agarose هلام إستشراد تلاعب (هلام حجم = ~ 10 سم مربع) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشط ذو أسنان صغيرة عينة الكهربائي (مشط حجم 4 × 1.5 مم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام دافئ الماء (50-60 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مختبر الشريط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلي بالمينا السوداء دبابيس الحشرات ، وحجم 000 (العلوم أدوات الجميلة # 26000-25) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أصحاب دبوس 1-2 (أدوات العلوم الجميلة # 26016-12) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 بوصة زجاج ماصة باستير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمبة أو مضخة ماصة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مختبر الأنسجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملصقات ورقية صغيرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) معايرة مقياس المطبوعة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناشف ورقية مبللة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الرمز البريدي كيس من البلاستيك </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشرط / شفرة الحلاقة (لقطع كتل آجار) </li></ul>

methods for the study of the zebrafish maxillary barbel

Barbels والزوائد الجلدية الحسية الموجودة في الأسماك والزواحف والبرمائيات. والزرد ، دانيو rerio وتطوير اثنين من أزواج من barbels - زوجا الأنف القصير وزوج يعد الفك العلوي. بربل الأنسجة يحتوي على خلايا الأدمة ، وأديمي متوسطي المنشأ العصبية العرف ، بما في ذلك خلايا الجلد والغدد وبراعم الذوق ، الخلايا الصباغية ، الأوعية الدموية والاعصاب الحسية. خلافا لمعظم أنسجة البالغين ، وبربل الفك العلوي واضح بصريا ، مما يسمح لنا تصور تطوير وصيانة هذه أنواع الأنسجة في جميع مراحل الحياة. هذا الفيديو يبين التطور المبكر للبربل الفك العلوي (بداية شهر واحد تقريبا بعد الإخصاب) ، ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد في أطرافهم الكبار (&gt; 3 أشهر بعد الإخصاب). باختصار ، هو ارتفاع في بربل الفك العلوي الأيسر من سمكة تخدير مع ملقط معقم القاصي فقط إلى الحافة الذيلية للفك العلوي. يتم وضع غرامة ، مقص الربيع العقيمة ضد ملقط لخفض رمح بربل على هذا المستوى ، وإنشاء المعالم التشريحية للطائرة البتر. ويمكن قياس النمو التجديدي مع الاحترام لهذه الطائرة ، وبالمقارنة مع بربل المقابل. بربل الأنسجة تتجدد بسرعة ، وقد يصل الحد الأقصى إعادة نمو في حدود 2 اسابيع من الاصابة. تقنيات لتحليل مجدد بربل تشمل تشريح وتضمينها أزواج متماثلة لbarbels (تجديد والسيطرة) في الآبار من هلام DNA الكهربائي القياسية. يتم تصويرها بسهولة العينات جزءا لا يتجزأ من تحت stereomicroscope عن مورفولوجيا الإجمالي وقياس الأشكال ، ويمكن تخزينها لمدة أسابيع قبل التطبيقات المصب مثل الأنسجة البارافين ، cryosectioning ، و / أو كليا جبل المناعية. هذه الأساليب إنشاء بربل الفك العلوي كما في رواية نظام الأنسجة الحية لدراسة القدرة على التجدد من أنواع خلايا متعددة في سياق الجيني للالزرد.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel at JoVE.com

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

في الفك العلوي الزرد بربل هو هيئة المعنى غلافي تحتوي الأدمة ، أرومية متوسطة ومشتقاتها قمة العصبية. الأهم من ذلك ، يمكن تجديد بربل الكبار بعد بتر القريبة. يقدم هذا الفيديو الفك العلوي بربل التنمية ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد ، تليها التصوير جمع ودمج والمصب من العينات باربيل.

طرق لدراسة بربل الفكين اسماك الزرد

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

methods-for-the-study-of-the-zebrafish-maxillary-barbel

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  DePaul University. في الفك العلوي الزرد بربل هو هيئة المعنى غلافي تحتوي الأدمة ، أرومية متوسطة ومشتقاتها قمة العصبية. الأهم من ذلك ، يمكن تجديد بربل الكبار بعد بتر القريبة. يقدم هذا الفيديو الفك العلوي بربل التنمية ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد ، تليها التصوير جمع ودم?...

Video: Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء<em&gt; بيميسيا تاباسي</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...