ويتم تمويل البحوث في المختبرات من قبل مؤسسة فريتز بندر، ميونيخ، ألمانيا (لTD) وجامعة ويتن / Herdecke منحة بحثية الداخلي (لجورج-KL). نود أن نشكر الأستاذ الدكتور الدكتور فرانك Thévenod (معهد علم وظائف الأعضاء، الفيزيولوجيا المرضية والسموم بجامعة ويتن / Herdecke) للحصول على اقتراحات مفيدة.

1. إعداد الكواشف وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول هانك لتعديل ومتوازن الملح (HBSS) (في ملي: 136.9 كلوريد الصوديوم، بوكل 5.37، 0.34 نا 2 هبو 4، 0.44 KH 2 PO 4، 4.17 NaHCO 3، ودرجة الحموضة 7.2، لا أحمر الفينول). تخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 1.5 M CaCl 2 و 2 M 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (الرقم الهيدروجيني 7.2) حلول الأسهم باستخدام الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 250 ملم مخزون البروبينسيد. لشكل الحامض الحر (غالبا ما يشار إليها باسم المياه غير قابلة للذوبان)، ويحل مسحوق البروبينسيد في 1 N هيدروكسيد الصوديوم، وملء ثلاثة أرباع الحجم النهائي بالماء المقطر ويعاير إلى الرقم الهيدروجيني ببطء 7.4 مع 1 N حمض الهيدروكلوريك. تخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل نفاذية الغشاء الفلورسنت صبغة ملزمة الكالسيوم اللامائية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى تركيز الأسهم من 1 ملم. تخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل كل تجربة، وإعداد الطازجة التي تحتوي على H البروبينسيدBSS تدفق (هوكي) عازلة من خلال الجمع بين HBSS مع تعديل (في تركيزات النهائي) 1.5 ملي CaCl 2، 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.2 و 5٪ مصل بقري جنيني، 2 مم البروبينسيد، و 5.55 ملي الجلوكوز. الحارة إلى 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 2.5 × 10 5 خلايا الكلى القريبة أنبوب صغير (WKPT-0293 Cl.2) لكل بئر من صحن 6 لوحة جيدا أو 35 مم القياسية في مستنبت وتنمو لمدة 2 أيام التوصل إلى confluency من حوالي 70٪. </li></ol> 3. الكالسيوم صبغ تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل طبق بشكل جيد، أو مزيج 1 مل مستنبت تحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني، 4 ميكرومتر نفاذية الخلية الكالسيوم صبغة ملزمة و2 مم البروبينسيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الثقافة المتوسطة مع 1 مل خليط الصبغة تحميل في كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. تغطية لوحة بورق الألمنيوم لمنع تبييض مؤشر الفلورسنت. </li></ol> 4. إعداد سيLLS عن التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دافئ 0.05٪-التربسين ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA) حل إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الكالسيوم محلول الصبغة تحميل من كل بئر وإضافة 1 مل التربسين على طول جدار البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل كل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل وبيليه بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge في 10000 ز لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل عازلة PHF و resuspend pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 10000 ز لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4.6. و 4.7. مزيد من مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا resuspend في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر عازلة PHF واستخدام الخلايا للتجريب في حدود 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: خلايا العد لتحديد تركيز الخلية واستخدام 5 × 04-1 أكتوبر × 10 5 خلايا لكل قياس. </li></ol> 5. تدفق CYTإعداد ometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تدفق عداد الكريات، فتح درج FLUIDICS والوجه تنفيس صمام التبديل تبديل لزيادة ضغط الهواء من خزان السائل غمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;رئيس&quot; أداة لإزالة فقاعات الهواء الإقامة المحتملة من داخل الأنابيب الداخلية وغرفة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرنامج التدفق الخلوي، وفتح نافذتين مؤامرة نقطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتطلب مؤامرة نقطة الأولى إلى الأمام الضوء المتناثرة (FSC) لX المعلمة والجانب الضوء المتناثرة (SSC) للمعلمة Y للسيطرة على نوعية الخلايا داخل العينة من خلال حجمها وتحبب، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقيس مؤامرة النقطة الثانية كثافة مضان من صبغ ملزمة الكالسيوم. حدد القناة كشف مضان المناسبة للمعلمة Y باستخدام مقياس لوغاريتمي والوقت بالثواني لX المعلمة على مقياس خطي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط معدل تدفق إلى &quot;مرتفع&quot;. </li></ol> 6. التدفق الخلوي Measurement <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء القياسات في RT. في التدفق الخلوي أنبوب العينة (11.5 × 75 ملم)، وإضافة 480 ميكرولتر عازلة PHF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر تعليق الخلية لفترة وجيزة دوامة لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك الذراع دعم أنبوب إلى الجانب ووضع أنبوب العينة على أنبوب حقن العينة حتى يتم تشكيل ختم مشددة. العودة الذراع دعم أنبوب إلى موقعها الأصلي محورها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين القياس عن طريق ضبط قناة مضان مثل أن متوسط ​​كثافة مضان من العينة في حوالي 10 2 على المحور الصادي. حفظ واستخدامه في التجارب اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء التجربة، كرر الخطوات من 6،1-6،3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضان خط الأساس القياسي لمدة 50 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقفة القياس، إزالة أنبوب عينة، إضافة مجمع المصالح، ودوامة لفترة وجيزة والعودة إلى أنبوب حقن العينة. هذه الخطوة يجب أن لا يستغرق أكثر من 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف القياس ويستمر لمدة ما مجموعه 204.8 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ط الكالسيومonophore، مثل ionomycin (10 ميكرومتر)، وخالب من الكالسيوم، مثل جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic (EGTA)، MnCl 2 أو 2 كوكلي (2 ملم)، عن الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي. </li></ol> 7. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات باستخدام برمجيات مخصصة التدفق الخلوي للتحليل غير متصل، مثل WinMDI (واجهة ويندوز متعددة وثيقة للالتدفق الخلوي)، مجموعة من البرامج المجانية التي وضعها جو تروتر في معهد سكريبس، مرفق التدفق الخلوي الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مؤامرة نقطة مع SSC FSC والمعلمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة الخلايا لتحليلها باستخدام &quot;المناطق&quot; أداة (انقر بالزر الايمن على الصورة) لاستبعاد الخلايا الميتة أو الحطام الخلية الموجودة في الزاوية السفلية اليسرى من تحليل البيانات (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل رباعي (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مؤامرة كثافة مع الوقت على محور س وكثافة مضان على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لناالبريد نفس المنطقة النابضة كما في 7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس البيانات باستخدام &quot;كوادرانت&quot; أداة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط فواصل رباعي بحيث يوضع خط عمودي عند إضافة مركب ويتم وضع خط أفقي في وسط مضان خط الأساس في الضوابط. تأكد من أن المواقع من فواصل رباعي يساوي في جميع العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم عرض النسبة المئوية للخلايا في كل رباعي في كل ركن (الشكل 2). مقارنة الربع العلوي الأيمن (UR) بين العينات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الرسم البياني (الشكل 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح بيانات التحكم في نافذة الرسم البياني مع كثافة مضان على محور س والأحداث على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمحة تصويرية، إضافة بيانات الاختبار ليتم مقارنة مؤامرة السيطرة كما المؤامرات تراكب (اذهب إلى ملف فتح ملف → → → حدد ملف التراكب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحليل الكمي، رسم بياني واحد يفوزيجب استخدام دوز. بوابة السكان الخلية باستخدام المنطقة R1 من الخطوة 7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في السيطرة غير المعالجة، واستخدام وظيفة علامة (&quot;العلامات&quot;) لتحديد المنطقة لتحليل بدءا من نقطة الوسط بين الحد الأدنى والحد الأقصى لمضان ذروة السيطرة وتنتهي في أقصى كثافة مضان. يتم حساب النسبة المئوية للخلايا في هذا المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد البيانات من نافذة الإحصائيات. أكرر للبقاء ملفات البيانات باستخدام نفس المنطقة ملحوظة للتحليل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل كثافة مضان (الشكل 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مؤامرة نقطة مع الوقت على محور س وكثافة مضان على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمكين &quot;وضع حركية&quot; و &quot;تراكب حركية الخط&quot;. سوف يظهر الخط الأزرق في مؤامرة نقطة الذي يمثل متوسط ​​كثافة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تدفق الكالسيوم النسبي من خلال خلق مناطق مستطيلة متعددة. ينبغي أن يكون لكل منطقة فصيل عبد الواحدidth حوالي &quot;50&quot;، وهو ما يعادل &quot;10 ثانية&quot;. تحديد ما يصل إلى 15 مناطق مستطيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الكمي من نافذة الإحصاءات ونسخ في جدول بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البيانات ذ يعني لتحليلها. حساب متوسط ​​R2 إلى R6، وهو ما يعادل 20 إلى 50 ثانية. هذه هي القيمة الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الفترة الزمنية المناسبة لتحليل تدفق الكالسيوم (يعتمد على بداية ومدة وشدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب إشارات الكالسيوم من كل منطقة في غضون هذا الوقت الفاصل الزمني النسبي لقيمة أساسية المتوسط، أي إشارة مضان قبل إضافة مركب، والتي تم تعيينها إلى 100٪. تحديد المتوسط ​​والانحراف المعياري من المناطق إضافة إلى ذلك المركبة؛ هذا هو إشارة الكالسيوم يعني حركها المجمع. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+pumps+in+health+and+disease.">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger,+inositol+1,4,5-trisphosphate.">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li><li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores.">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li><li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM+proteins:+dynamic+calcium+signal+transducers.">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li><li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake.">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li><li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+and+pumps+in+cancer:+changes+and+consequences.">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li><li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+in+the+heart:+when+it's+good,+it's+very+very+good,+but+when+it's+bad,+it's+horrid.">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li><li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry.">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li><li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration.">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li><li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization.">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li><li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+Ca2++flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry.">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li><li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li><li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP.">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li><li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats.">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li><li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benemid,'+p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic+acid;+its+renal+affinity+and+its+elimination.">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li><li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells.">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li><li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations,+anions+and+zwitterions.">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li><li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+superfamily.">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li><li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes.">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li><li>Th&#233;venod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis.">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li><li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells.">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102 (2010).</li><li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry.">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li><li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM.">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الكالسيوم هو الحدث الرئيسي في العمليات الخلوية متعددة بوصفها الثاني جزيء رسول الإشارات وأيضا كوسيلة للتواصل بين ER والميتوكوندريا. القدرة على قياس التغيرات في تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي الحر هو تقنية مفيدة يمكن أن تنطبق على جميع مجالات بيولوجيا الخلية. هناك عدة ط?...

الكالسيوم هو رسول الثاني المهم مسؤولة عن نقل الإشارات الخلوية والفسيولوجية المرضية 1. يتم الاحتفاظ تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي منخفض من خلال نشاط مضخات الكالسيوم والمبادلات الكالسيوم. و/ هيولي باطني أتباز شبكية الهيولى العضلية الكالسيوم (SERCA) الغيارات الشبكة الإندوبلازمية (ER) تخزين الكالسيوم كجزء من نظام &quot;تسرب مضخة&quot; في حين أن أتباز الكالسيوم غشاء البلازما (PMCA) يقذف الكالسيوم إلى الخلية مقصورة، سواء في الأدب ATP التي تعتمد على 2. رسل الفسيولوجية، مثل الهرمونات أو الناقلات العصبية، نقل إشارات من خلال مستقبلات البروتين G-جانب، وتفعيل فسفوليباز C، والتي تتحلمأ فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate (PIP2) في الغشاء البلازمي لتوليد مادة ال diacylglycerol واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) 3. في حين لا تزال مادة ال diacylglycerol في غشاء البلازما، IP3 ينشر في العصارة الخلوية وتربط لمستقبلات IP3يتم تحريرها ل (IP3Rs)، والتي يتم تفعيلها يجند قنوات الكالسيوم، وجدت في الغشاء ER والكالسيوم من مخزن ER اللمعية وبلغت ذروتها في زيادة تركيز الكالسيوم عصاري خلوي 4. طريق بديل للكالسيوم للوصول إلى العصارة الخلوية هو من خلال قنوات الكالسيوم والمبادلات موجودة في غشاء البلازما. وقد وصفت الحديث المتبادل بين هذين القسمين: الإفراج الكالسيوم الناجم عن الكالسيوم (CICR) حيث يدفع الكالسيوم خارج الخلية إطلاق الكالسيوم من ER 5 مخازن، ومتجر يعمل دخول الكالسيوم (SOCE) حيث تفريغ مخازن ER هو الذي تشعر به STIM ويسبب افتتاح Orai قنوات الكالسيوم في غشاء البلازما لتعزيز إعادة تعبئة مخازن ER 6. في ظل الظروف المرضية في جسم المريض، والاستجابة الخلوية هي زيادة الكالسيوم الكالسيوم تحرير سعر وعصاري خلوي في غياب محفزات الفسيولوجية 1. قد تتأثر الاستجابة الكالسيوم في عدد من الطرق: لفترة طويلة الكالسيومإشارة، تأخر إزالة الكالسيوم من العصارة الخلوية، ونضوب مخازن الكالسيوم أو تغيرات محلية في الكالسيوم. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا تأخذ على دور مركزي في التخزين المؤقت والإفراج عن الكالسيوم 7. لفترات طويلة و / أو فوق الأعظمي زيادة الكالسيوم عصاري خلوي يؤدي إلى موت الخلايا. في الحقيقة، الكالسيوم هو في كثير من الأحيان لا تشارك في الاستجابة المرضية الخلوية ويعد حدثا رئيسيا في مجموعة واسعة من الأمراض، مثل أمراض الاعصاب، أمراض القلب، والسرطان، وأمراض العظام وأمراض الكلى، والتي ترتبط بشكل رئيسي مع موت الخلايا وفقدان أو تغيير الجهاز أو الأنسجة ظيفة 8-10. وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط اضطراب الإشارات الكالسيوم إلى التكيف الخلوي والتغيرات في الوظائف الخلوية والاستجابات. تقليديا، يتم قياس اشارات الكالسيوم مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت سالبة الشحنة التي يتم تحميلها إلى الخلايا في خلية acetoxymethyl نفاذية (AM) شكل استر. مرة واحدة من قبل المشقوق esteras الخلويةوفاق، لا تزال المؤشرات الفلورسنت داخل حجرة داخل الخلايا وتزيد في كثافة مضان عندما يرتبط الكالسيوم. مؤشر الكالسيوم أكثر من المعروف جيدا والمستخدم هو ratiometric FURA-2 التي وضعها روجر تسين وزملاؤه 11. مؤشرات الكالسيوم مع اختلاف الانتماءات للكالسيوم تسمح حمامات الكالسيوم مختلفة ليتم رصدها. وتشمل طرق الكشف التصوير الخلية الحية، ومضان قارئ صفيحة ميكروسكوبية والتدفق الخلوي. حركية سريعة نسبيا من إشارات الكالسيوم (عادة في غضون بضع ثوان إلى دقائق) يجعل الخلية الحية التصوير أفضل طريقة لكسب أكبر قدر من المعلومات عن خصائص إشارة الكالسيوم. وبصرف النظر عن حركية السريعة للإشارات الكالسيوم (داخل ميلي ثانية)، تصوير الخلايا الحية هو أفضل طريقة لدراسة التقسيم الخلوي للإشارات الكالسيوم داخل خلية واحدة (12). ويمكن حساب تركيز الكالسيوم المطلقة من خلال تحديد الحد الأدنى والحد الأقصى مضان من الكالسيوم الصناعيةicator بإضافة الكالسيوم وخالب permeabilizing الخلايا، على التوالي، كما وصفها Grynkiewicz وآخرون 11. وقد تم تطوير استخدام التدفق الخلوي لقياس اشارات الكالسيوم الأول في 1980s في الخلايا المناعية حيث الفرصة لقياس معلمات متعددة، مثل سلامة الغشاء والفصل بين سكان الخلية، وشرط من الخلايا في تعليق جنبا إلى جنب مع تطور الطول الموجي واحد مؤشرات الكالسيوم جعلت التدفق الخلوي وسيلة مثالية وconvenientdetection 13-15. في الخلايا الملتصقة، ويوفر تصوير الخلايا الحية على معظم المعلومات عن إشارات الكالسيوم، والأهم من حركية، ولكن يتطلب الإعداد معقدة تضم المجهر مضان، نظام نضح، والحفاظ على البيئة الخلوية، مثل درجة الحرارة، والبرمجيات المجهر المتخصص لاكتساب وتحليل البيانات. طرق بديلة مثل قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية أو pharmacolوسائل ogical من خلال استخدام chelators الكالسيوم هي لا تضاهى من حيث المعلومات المكتسبة. التدفق الخلوي أصبح أكثر استخداما لمراقبة الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الملتصقة مع ذلك، في معظم الدراسات، وتجرى القياسات فقط نقطة النهاية. باستخدام طريقة تم تطويرها في البداية من قبل جيرجيلي آخرون في الخلايا البائية المناعية 16، وقد تم قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي مجانا عن طريق التدفق الخلوي مع حركية في الوقت الحقيقي ورصد كثافة مضان في الخلايا الفردية من سكان العينة بنجاح في سرطان الخلايا الظهارية والخلايا الجذعية السرطانية الهجينة 17. هذه الطريقة تم تكييفها للاستخدام في مزيد من الخلايا الظهارية ملتصقة، التي يصعب تحميل مع مؤشرات الكالسيوم 18. هنا، وذلك باستخدام خط الخلايا الظهارية ملتصقة خلد المستمدة من قطاع S1 من النبيبات الدانية الكلى الفئران (WKPT-0293 Cl.2) 19، وصفنا لم مبسطة الأمثلethod لقياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي من خلال التدفق الخلوي. منذ العديد من الخلايا الظهارية تمتلك عددا من شركات النقل للمركبات الأيونية العضوية وتحميل خلايا مع مؤشر الكالسيوم يمكن ان يكون تحديا. لمنع هروب رأس المال من المؤشرات الكالسيوم، البروبينسيد، والمانع من تنميط النقل أنيون العضوية وضعت في الأصل لتقليل إفراز الكلى من البنسلين 20، يتم تطبيقها في وقت واحد في المتوسط ​​الحضانة. تتم المحافظة على الخلايا في الطبقات الوحيدة لتحميل مؤشر الكالسيوم، وجلبت الى تعليق والكالسيوم إشارات يمكن الكشف عنها على الفور بعد إضافة مركب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

زيادة الكالسيوم عصاري خلوي، طبقت اثنين من المركبات الدوائية إلى الخلايا الكلوية القريبة أنبوب صغير (WKPT-0293 Cl.2) محملة صبغة نفاذية الخلية الكالسيوم ملزمة، فلوو-3-AM. تم تحميل عينات السيطرة Nontreated مع الكالسيوم صبغة ملزمة بحضور البروبينسيد وكانت مختلطة ولكن من دون إضافة أي ...

Watch this Scientific Journal Video about Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

ويشارك الكالسيوم في العديد من مسارات الإشارات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. تصوير الخلايا الحية يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون مضيعة للوقت. تم تحسين A، طريقة بسيطة سريعة باستخدام عداد الكريات تدفق لتحديد التغيرات النسبية في الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية ملتصقة جلبت الى تعليق.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Views.  University of Witten/Herdecke.  ويشارك الكالسيوم في العديد من مسارات الإشارات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. تصوير الخلايا الحية يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون مضيعة للوقت. تم تحسين A، طريقة بسيطة سريعة باستخدام عداد الكريات تدفق لتحديد التغيرات النسبية في الكال?...

Video: Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

قياس اندوريدوبليكيشن بقياس التدفق الدرنات المعزولة بروتوبلاستس

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

قياس الإنتاجية العالية من ماكروبينوسيتوسيس ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "التدفق الخلوي"

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

الكشف عن وتوصيف البروتين التجميع الذاتي في الجسم الحي عن طريق قياس التدفق

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

قياس الكتلة المتقدريه والاغشيه المحتملة في الخلايا الجذعية التي تكون الدم وخلايا T بواسطة التدفق الخلوي

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...