ويدعم البحوث في المختبر المؤلفين من المعاهد الوطنية للصحة منح R37 - HL041026 ، R01 - R01 HL086483 وHL056786 - (SSS) وHL097463 - F32 و- T32 AR048523 (PB) من خدمة الولايات المتحدة الصحة العامة.

1. رعاية الحيوان واستخدام بعد مراجعتها والموافقة عليها من رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم اللجنة ، وتستخدم الفئران الذكور لا يقل عن 12 أسابيع من العمر. فأر هو تخدير بنتوباربيتال مع الصوديوم (60 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن (IP) داخل الصفاق. في جميع أنحاء العمليات الجراحية التجريبية والبروتوكولات ، يتم الاحتفاظ التخدير بواسطة ملاحق (10-20 ٪ من الحقن الأولى ، IP) حسب الحاجة (كل دقيقة 30-60 ، وأشار ، ردا الانسحاب إلى أخمص القدمين أو قرصة الذيل). بعد الانتهاء من إجراء التجارب هو جرعة زائدة من الفأر مع بنتوباربيتال (IP) ، والموت الرحيم بواسطة الخلع عنق الرحم. 2. وMicropipettes Microiontophoresis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدون micropipettes Microiontophoresis (الداخلية القطر تلميح ، ~ 1 ميكرون) من أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية باستخدام ماصة مجتذب الأفقي. بلدنا يملك ~ تفتق 5 مم لصلابة ؛ يعد التناقص التدريجي أكثر مرونة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم ردم Micropipettes مع أدن تشافيز 1M (Figure1A - C) الذائب في الماء 18.2 MΩ. لردمها ، يتم توصيل أنبوب microcapillary لتصفية 0.2 ميكرومتر بالإضافة إلى حقنة تحتوي على ناهض الفائدة (الشكل 1). يمكن أن تكون هذه ملفقة بسهولة (أدناه) ، أو تم شراؤها من الباعة التجاريين. يتم إدخال الأنبوب في نهاية microcapillary الخلفي من يتم تسليم الحل micropipette وأدن تشافيز في التجويف بينما سحب أنبوب microcapillary كما micropipette يملأ. عقد micropipette مع طرفها مشيرا إلى الأسفل ، يتم إزالة فقاعات الهواء عن طريق التحريك بلطف micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تأمين micropipette في حامل محمل في micromanipulator (الشكل 2). حامل فضية وسلك ربط الحل أدن تشافيز داخل micropipette إلى دبوس الخارجية ، التي هي بدورها مرتبطة الموجب لمبرمجا microiontophoresis. تم توصيل سلك من الفضة second المضمون على حافة إعداد الأنسجة إلى السالب لاستكمال الدائرة المتقدمة كما هو غيض من micropipette الى الحل ملحي الفسيولوجية خلال التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويطبق الحالية في الابقاء على منع توسع الأوعية (أو استجابة الفلورية) عندما يتم وضع الطرف micropipette المحاذية للجدار تصلب. وسوف تحتفظ الحالية تختلف مع حجم رأس micropipette (القطر الداخلي = 1 ميكرون) ، ولكن تركيز استنساخه ناهض للغاية لمعايير محددة (نستخدم ~ 200 غ لأدن تشافيز 1M ، 1 غيض ميكرومتر). ويتوقف الاحتفاظ الحالية تتزامن مع تسليم طرد الحالي عن طريق تحريك الإلكترونية (الشكل التكميلي 1) تزامن مع بداية الحصول على الصور. </li></ol> 3. المجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت ملفقة منصة مخصصة لمرحلة المجهر XY من الفولاذ المقاوم للصدأ المغناطيسية. أبعاد المنصة (1 / 8 &quot;X 12&quot; X 13 &quot;) تتيح مساحة كافية لmicromanipulators الموقف حول إعداد التجريبية كما Micromanipulators المطلوب (الشكل 2A). المضمون قواعد المغناطيسي (الشكل 2B) تمكين لتحديد المواقع وفقا لما تمليه التحضير ، وهذه هي وضعها مباشرة على منصة ملفقة حول التحضير لmicropipettes المواقع في المواقع المهمة (الشكل 2C). </li></ol> 4. ممثل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع طرف micropipette المتمركزة المتاخمة لشرين ، هناك استجابة لمضان أدن تشافيز (الاحتفاظ الحالي من تعديلها لمنع تسرب أدن تشافيز). تحت عتبة حافزا كان هناك أي تأثير. ومع ذلك ، وزيادة الكالسيوم الخلية البطانية مضان كما زادت كثافة التحفيز ، عبر مسافات أكبر تدريجيا على طول شرين ، وكذلك كثافة مضان في موقع التحفيز (الشكل 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. طريقة لردم الماصات Microiontophoresis. أ) يتم تأمين أنبوب microcapillary (السهم الأخضر) في تركيب ضغط (السهم الأزرق) موصولة إلى 0.2 ميكرون فلتر (السهم الأرجواني) الذي يعلق بعد ذلك إلى حقنة مليئة أدن تشافيز 1M. B) أنبوب microcapillary وتغذي غير ماصة المشردين microiontophoresis حتى نهاية الظهر والحل لملء التجويف من micropipette جيم) حالما يتم تعبئة ماصة ، وعقد قمة لأسفل ونفض الغبار برفق فوق تفتق لإزالة الفقاعات (السهم الأسود). <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. منهاج مخصص Micromanipulator الموضع. .. A) وضعت منصة المغناطيسية والفولاذ المقاوم للصدأ على قاعدة العرف المجهر MVX10 تتضمن المرحلة XY متعدية ب) قواعد المغناطيسي التعميم الملصقة على الجزء السفلي من micromanipulators من 3 محاور المدمجة C) Micromanipulators المتمركزة حول إعداد التجريبية (انظر بروتوكول المرتبطة بها : إن الرب رقم # 2874) لدراسة مواقع محددة من الاهتمام. والأشعة تحت الحمراء مدمجة الحجم والتنوع يمكن أن تستخدم micropipettes متعددة في وقت واحد. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الكالسيوم في الشرايين الإسفار. مضان زيادة الكالسيوم في الخلايا البطانية المبطنة للجدار مع شدة تصلب التحفيز. أول 3 لوحات لوحات معروضة للردود مضان إلى A) 250 B ، NA) 500 غ و C) 1000 NA طرد الحالية (500 مللي كل نبضة مدة). يشار إلى أن المسافة التي البطانية مضان الكالسيوم بنسبة خلية في ميلانو بين قوسين (~ 130 ، 270 و 400 ميكرون ، على التوالي). خط المرجعية عبر شرين في كل لوحة تشير إلى حيث سجلت ردود مضان (F / FO) لأدن تشافيز في موقع التحفيز. D) تسجيلات من الوقت مقابل F / FO لزيادة المحفزات أدن تشافيز. كما طرد الحالي زيادة ، وزيادة F / FO في السعة والمدة. علما أن 100 NA التحفيز كانت أقل من الحد الأدنى وليس لها أي تأثير. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="الشكل 1 التكميلية" /> الشكل 1 التكميلية. مخطط الرسم البياني لالزناد الإلكترونية. هذه الدائرة هي تفاعل مع المنفذ المتوازي من جهاز كمبيوتر شخصي. عند تنشيطه يوفر ثابت TTL نبض 5V. رقاقة 7805 هو الجهد المنظم 5V موصلة بمصدر 9 - 12V العاصمة السلطة (بطارية من الجهد المناسب على ما يرام). الإخراج من 7805 يوفر القدرة على تبديل الثنائية رباعية والإخراج من الدائرة. المدخلات عبر المقاوم هو 1K من الكمبيوتر.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

تمت الموافقة على كافة الإجراءات والبروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان ، واستخدم من جامعة ميسوري والتي أجريت في الاتفاق مع المرشد لمعاهد الصحة الوطنية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. رعاها الإنتاج من هذه المادة الضوئيات ستانفورد.

بروتوكول الموصوفة هنا يوضح الأساليب لإعداد وتنفيذ micropipettes لmicroiontophoresis. يستخدم تسليم أستيل لتوضيح الإشارات الكامنة الكالسيوم البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية في الشرايين من الفأرة تخدير. نتائجنا توضح أن المسافة التي أدن تشافيز زيادات الزيادات مضان الخلية البطانية الكالسيوم مع كثافة طرد الحالي من micropipette microiontophoresis (الشكل 3). عدم وجود زيادة في ظل ظروف يستريح مضان يشير ضئيلة من التسرب من micropipette أدن تشافيز. عدم استجابة إلى 100 كثافة التحفيز NA (الشكل 3 ، أسطورة) يوضح أن هناك حاجة إلى كثافة عتبة تحفيز الخلايا البطانية للكالسيوم في الزيادة. هذه التقنيات يمكن تكييفه بسهولة لعوامل أخرى والاستعدادات فعال في الأوعية الأنسجة. الاعتبارات العملية : في العمل مع microiontophoresis لدراسة التفاعلات شريني ، ينبغي الاعتراف بها العديد من الأشياء. في حين أنه قد ثبت من الصعب تحديد تركيز ناهض الفعلي للتسليم ، التحفيز على الاستجابة المنحنيات واستنساخه داخل وبين الاستعدادات. لا يمكن أن يؤديها من خلال عقد هذه المدة نبض ثابت (على سبيل المثال ، 500 مللي ثانية) ، وطرد متفاوتة الحالية (على سبيل المثال ، 250 ، 500 و 1000 NA ؛ الشكل 3). بدلا من ذلك ، يمكن عقد قذف تيار مستمر (على سبيل المثال ، 500 غ) ، ومدة نبض متنوعة (على سبيل المثال ، 250 ، 500 و MS 1000) للإشارة إلى إجراءات محددة تركيز ناهض ، يمكن إعداد superfused مع الحل المناسب 5. لأن القوة الدافعة للطرد المذاب هو اتهام الحركة الكهربائية ، يجب على الوكيل أن يتم تسليم تحمل شحنة الصافية إلى أن النازحين من micropipette. للتأكد من أن وكيل لمصلحة الناقل هو المسؤول الأساسي ، يتم حله في تركيز عال (على سبيل المثال ، 1 م لACH) للحد من التناضح الكهربائية. عندما يتطلب هذا التلاعب في الرقم الهيدروجيني للmicropipette حل التعبئة والضوابط اللازمة للتأكد من المركبات أي تأثيرات غير محددة. وينبغي أيضا أن يتم تنفيذ الضوابط المناسبة لمرور الحالية وحدها (على سبيل المثال ، باستخدام micropipettes مليئة المالحة متساوي التوتر). وينبغي أن المسافة الفعالة لنشر وكيل من موقعه الإفراج يجب التثبت منها والأكثر بسهولة تحديد تجريبيا قبل اختفاء الاستجابة الفسيولوجية (على سبيل المثال ، توسع الأوعية أو ارتفاع في الكالسيوم داخل الخلايا على طرد ACH) حيث يتم وضع في micropipette مسافات محددة من الموقع المستهدف. في الممارسة العملية ، ويتأثر كثيرا المسافة نشر فعالة من قبل كيف يتم وضع غيض من micropipette في الأنسجة ، على سبيل المثال إذا المغطي غيض الضغط إلى أسفل داخل الأنسجة وطرفها ، مما هو ضعف الإخراج. النسيج الضام المفرط مزعجة للغاية وينبغي إزالتها من سطح الأنسجة أثناء إعداد الجراحية. كما ينبغي إيلاء الاهتمام لإمكانية أوزون غيض من الوكيل المعين. تم تصغير هذه باستخدام نبضات قصيرة نسبيا (على سبيل المثال ، ≤ 1 ق). مع التيارات مستمرة (على سبيل المثال ، عدة ثوان) ، قد يكون طرد من طرف ناهض بسرعة أكبر مما يمكن استبداله نشر الجزء الأكبر من الحل في ملء micropipette. لأن المشردين حجم ضئيل مع microiontophoresis ، إذا واحد هو محاولة لتغيير بيئة المحلية الأيونية (على سبيل المثال ، لتقديم K depolarizing + الحوافز) ، فإن هذا لا يتحقق على نحو فعال مع microiontophoresis لكن يتحقق بسهولة مع طرد ضغط السوائل السائبة وجود المطلوب التكوين. لتحفيز المحلي لشرين ، نصائح micropipette بأقطار داخلية من 2-3 ميكرون تعمل بشكل جيد مع الضغوط طرد 4-5 رطل (28-35 كيلو باسكال) ومدة النبضة (على سبيل المثال ، 1 ثانية) التي تسيطر عليها مع صمام الملف اللولبي 10. حيث يتم تسليم المطلوب مستمرة من وكيل micropipette من الصعود إلى microvessel ، يفضل الضغط قذف به micropipettes المناسبة قطر الحافة الداخلية (على سبيل المثال ، ~ 10 ميكرون) 11،12. عمود الهيدروستاتي من ارتفاع معروفة مع صمام محبس يوفر غير مكلفة ، واضحة المعالم على / قبالة رأس الضغط المستمر. ويتم تحديد معدلات التدفق القطر الداخلي للطرف ماصة والضغوط الدافعة. كما هو الحال دائما ، والضوابط مركبة ضرورية لاستبعاد الإجراءات غير محدد من طرد الضغط.

<table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المواد المستعملة </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> أنابيب الزجاج البورسليكات شعرية </td><td> نذير الآلات </td><td> GC120F - 10 </td><td></td></tr><tr><td> أفقية الماصة بولير </td><td> سوتر الآلات </td><td> نموذج P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> أستيل كولين الكلوريد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> محول لمحور Luer </td><td> مارتش </td><td> AC1343 </td><td> لتأمين أنابيب microcapillary </td></tr><tr><td> 0.2 ميكرومتر نايلون تيتان التصفية </td><td> أحد لانكا </td><td> 42204 - NN </td><td> انخفاض حجم الاحتفاظ لتقليل الخسائر </td></tr><tr><td> 5 مل حقنة </td><td> بيكتون ديكنسون ، شركة </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> حامل ماصة </td><td> نذير الآلات </td><td> E45W - M12VH </td><td></td></tr><tr><td> أسلاك الفضة </td><td> نذير الآلات </td><td> AG10W </td><td> 0.25mm قطر </td></tr><tr><td> 3 المحور micromanipulator </td><td> Siskiyou تصميم الآلات </td><td> DT3 - 100 ، MXB ، MXC ، MGB / 8 </td><td> مكونات لتتلاعب كما هو موضح </td></tr><tr><td> مبرمج microiontophoresis الحالي </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> نموذج 260 </td><td></td></tr><tr><td> تحريك الجهاز </td><td> عرف </td><td> عرف </td><td> قدمت الدائرة في ملحق. الشكل 1 </td></tr><tr><td> الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة </td><td> ماكماستر ، كار </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> وفقا للتصميم </td></tr><tr><td> كثفت كاميرا رقمية </td><td> شركة ستانفورد الضوئيات </td><td> XR/Mega-10 </td><td> تتكامل مع برامج التحكم بايبر </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis يستلزم مرور الحالي خلال قمة micropipette لتقديم المذاب في موقع معين ضمن إعداد التجريبية. ويمكن محاكاة Microiontophoresis انتقال متشابك 1 من خلال تقديم العصبية والخلايا العصبية على نيوروببتيد بتكاثر 2. حجم ضئيل (السائل) التشريد تتجنب الاضطرابات الميكانيكية في إعداد التجريبية. تكييف هذه التقنيات إلى دوران الأوعية الدقيقة 3 مكن أن تدرس آليات توسع الأوعية وتضيق الأوعية على المستوى المجهري 4،5 في الجسم الحي. والميزة الرئيسية لمثل هذا التسليم المترجمة تمكين ردود حركي لدراستها في مواقع محددة داخل الشبكة الاوعية الدموية الدقيقة من دون إثارة أو تغييرات منهجية انعكاسية في ضغط الدم والأنسجة تدفق الدم ، مما يكشف عن الخصائص الجوهرية للmicrovessels. وجود قيود على microiontophoresis هو أن تركيز دقيق وكيل تسليمها إلى موقع الاهتمام من الصعب التأكد من 6. ومع ذلك ، فإن صدوره من طرف micropipette يتناسب مع كثافة ومدة طرد 2،7 الحالية ، يمكن أن تكرار مثل هذه الحوافز والاستجابة بسهولة تحديد العلاقات في ظل ظروف تجريبية محددة (موضح أدناه). عوامل إضافية تؤثر على تسليم microiontophoretic تشمل تركيز المذاب وتأين في الحل. وينبغي أن القطر الداخلي للطرف micropipette تكون ~ 1 ميكرون أو أقل لتقليل diffusional &#39;تسرب&#39; ، والتي يمكن تصدى الحالي مع الاحتفاظ. وهكذا يتم استخدام الخارجي (إيجابية) الحالي لإخراج الموجبة والسلبية الحالية المستخدمة في الاحتفاظ بها داخل micropipette. ومما يسهل تلفيق micropipettes مع جر إلكترونية متطورة 8. يتم سحبها من Micropipettes أنابيب زجاجية تحتوي على خيوط شعري أن &quot;فتائل&quot; الحل في غيض من micropipette عندما شغله من النهاية الخلفية (&quot;ردم&quot;). يتم ذلك عن طريق إدخال أنبوب microcapillary متصلة حقنة تحتوي على محلول من الاهتمام وإخراج الحل في لمعة من micropipette. Micromanipulators تمكين الموضع المطلوب من خلال إعداد micropipettes التجريبية. يمكن وضعه Micromanipulators التي شنت على قاعدة متحركة حول إعداد وفقا لتضاريس شبكات الاوعية الدموية الدقيقة (المتقدمة أدناه). ويوضح البروتوكول microiontophoresis للأستيل كولين (ACH + CL --) على شرين an عضلة الماوس إعداد المشمرة (انظر المرتبطة بروتوكول : إن الرب رقم # 2874) لإنتاج البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية. يتزامن التسليم مع التحفيز الحصول على الصور الرقمية باستخدام الزناد الالكترونية. استخدام BAC - GCaMP2 Cx40 9 الفئران المعدلة وراثيا يمكن تصور ردود الكالسيوم داخل الخلايا الكامنة في توسع الأوعية تصلب الخلايا البطانية في دوران الأوعية الدقيقة الحية.

Watch this Scientific Journal Video about Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation at JoVE.com

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis يستتبع حركة الأيونات من micropipette ردا على الفرق في الجهد الكهربائي بين داخل وخارج micropipette. وبذلك يتم تسليم الجزيئات النشطة بيولوجيا في نسبة إلى تيار كهربائي. نحن لتوضيح microiontophoresis أستيل بالتزامن مع المجهرية لدراسة البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية في دوران الأوعية الدقيقة.

Microiontophoresis والمجهرية للتصوير الإسفار Intravital للدوران الأوعية الدقيقة

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Views.  University of Missouri. Microiontophoresis يستتبع حركة الأيونات من micropipette ردا على الفرق في الجهد الكهربائي بين داخل وخارج micropipette. وبذلك يتم تسليم الجزيئات النشطة بيولوجيا في نسبة إلى تيار كهربائي. نحن لتوضيح microiontophoresis أستيل بالتزامن مع المجهرية لدراسة البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية في دو...

Video: Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

ولد لتطبيع الإسفار التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية للتصوير القلب الجامع

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

العضلة المشمرة ماوس التحضير لتصوير Intravital للدوران الأوعية الدقيقة

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

تقنيات ميكرومانيبوليشن يسمح تحليل الديناميات Morphogenetic ودوران للمنظمين سيتوسكيليتال

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

والعزلة وتصوير الأسفار لتعمير واحد-الجسيمات Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...