La ricerca in laboratorio, gli autori &#39;è sostenuta dal National Institutes of concede Salute-HL041026 R37, R01-R01-HL086483 e HL056786 (SSS) e da F32-HL097463 e T32-AR048523 (PB) dal Servizio States Public Health.

1. Cura degli animali e Usa A seguito di revisione e approvazione da parte della cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, topi maschi di almeno 12 settimane di età sono utilizzati. Un mouse è anestetizzato con sodio pentobarbital (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) iniezione. In tutto gli interventi chirurgici ei protocolli sperimentali, l&#39;anestesia è gestito da supplementi (10-20% di iniezione iniziale, ip), se necessario (ogni 30-60 minuti; indicato dal ritiro di risposta ai piedi, o stringere la coda). Dopo il completamento della procedura sperimentale, il mouse è sovradosaggio con pentobarbital (ip) e eutanasia da dislocazione cervicale. 2. Micropipette e Microiontophoresis <ol><li> Micropipette Microiontophoresis (diametro interno punta, ~ 1 micron) sono preparati da tubi in vetro borosilicato capillare con un estrattore orizzontale pipetta. Il nostro è un 5 cono mm ~ per la rigidità; più coni sono più flessibili. </li><li> Micropipette sono riempito con 1M ACh (Figure1A-C) disciolto in acqua 18,2 MΩ. Per il riempimento, un tubo microcapillare è collegato al filtro da 0,2 micron accoppiato ad una siringa contenente l&#39;agonista di interesse (Figura 1). Questi possono essere facilmente realizzati (vedi sotto) o acquistati dai fornitori commerciali. Il tubo microcapillare viene inserita nel back-end della soluzione micropipetta e ACh viene consegnato nel lume, mentre il ritiro del tubo microcapillare come la micropipetta riempie. Tenendo la micropipetta con la punta rivolta verso il basso, bolle d&#39;aria vengono rimosse con delicatezza sfogliando la micropipetta. </li><li> La micropipetta è fissato in un supporto montato in un micromanipolatore (Figura 2). Il titolare ha un filo d&#39;argento collega la soluzione ACh all&#39;interno della micropipetta ad un pin esterno, che a sua volta è collegato al terminale positivo di un programmatore microiontophoresis. Un filo d&#39;argento secondo depositati a bordo della preparazione dei tessuti è collegata al terminale negativo per completare il circuito, come la punta della micropipetta è avanzato nella soluzione fisiologica salina sopra la preparazione. </li><li> Una corrente mantenendo viene applicata per impedire la vasodilatazione (o risposta fluorescente), quando la punta micropipetta è posizionato adiacente alla parete arteriolare. Mantenendo corrente varia con le dimensioni della punta micropipetta (diametro interno = 1 micron) e la concentrazione agonista, ma è altamente riproducibile per i parametri definiti (usiamo ~ 200 nA per 1M ACh, 1 punta di micron). La corrente mantenendo cessa in coincidenza con la consegna di espulsione corrente tramite il grilletto elettronica (aggiuntiva Figura 1) sincronizzato con l&#39;inizio di acquisizione delle immagini. </li></ol> 3. Micromanipolazione <ol><li> Una piattaforma personalizzata per un portaoggetti XY è stato realizzato da ferromagnetici in acciaio inox. Dimensioni della piattaforma (1 / 8 &quot;x 12&quot; x 13 &quot;) consentono di spazio sufficiente per micromanipolatori posizione intorno alla preparazione sperimentale Micromanipolatori desiderato (Figura 2A). Fissato alle basi magnetiche (Figura 2B) consentono il posizionamento come dettato dalla preparazione. Si tratta di posizionato direttamente sulla piattaforma fabbricato intorno alla preparazione per micropipette posizionamento in siti di interesse (Figura 2C). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <ol><li> Con la punta della micropipetta in posizione adiacente ad una arteriola, non vi è risposta a fluorescenza per ACh (mantenendo quello attuale regolata per evitare perdite ACh). Sotto di una soglia di stimolo non c&#39;era alcun effetto. Tuttavia, come intensità dello stimolo maggiore, del calcio delle cellule endoteliali fluorescenza maggiore a distanze progressivamente maggiore lungo le arteriole, così come l&#39;intensità della fluorescenza nel sito di stimolazione (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Metodo per Riempimento Pipette Microiontophoresis. A) Un tubo microcapillare (freccia verde) è fissato in un raccordo a compressione (freccia blu) collegato a un filtro da 0,2 micron (freccia viola) che viene poi attaccato ad una siringa piena di 1M ACh. B) Il tubo microcapillare viene immessa nella pipetta microiontophoresis attraverso il back-end e la soluzione è spostato a riempire il lume della micropipetta. C) Una volta che la pipetta è riempito, tenere la punta verso il basso e leggermente sopra il cono flick per rimuovere le bolle (freccia nera). <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Piattaforma personalizzate per il posizionamento Micromanipolatore. .. A) Una piattaforma ferromagnetici in acciaio inox è stato posizionato su un costume MVX10 base del microscopio contenente una fase traslazionale XY B) Circolare basi magnetiche apposta sul fondo della compatta a 3 assi micromanipolatori C) Micromanipolatori posizionati intorno alla preparazione sperimentale (vedi protocollo associato: JOVE ID # 2874) per studiare i siti di interesse specifico. Ilir dimensioni compatte e la versatilità permettono micropipette multiple per essere utilizzati contemporaneamente. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Fluorescenza di calcio nelle arteriole. Fluorescenza di calcio delle cellule endoteliali che rivestono la parete arteriolare aumenta con l&#39;intensità dello stimolo. I primi 3 pannelli mostrato immagini di fluorescenza risposte alla A) 250 nA, B) 500 nA e C) 1000 eiezione nA di corrente (ogni 500 ms durata dell&#39;impulso). La distanza a cui la fluorescenza del calcio delle cellule endoteliali aumento è indicato tra parentesi in AC (~ 130, 270 e 400 micron, rispettivamente). La linea di riferimento attraverso l&#39;arteriola in ogni pannello indica dove le risposte fluorescenza (F / Fo) per ACh sono stati registrati presso il sito di stimolazione. D) Le registrazioni di F / Fo vs tempo per aumentare gli stimoli ACh. Come espulsione correnti è aumentato, F / Fo aumentati in ampiezza e durata. Si noti che 100 nA stimolo era al di sotto della soglia e non ha avuto effetto. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Supplementare Figura 1" /> Supplementare Figura 1. Schema elettrico per innescare elettronici. Questo circuito è interfacciato con una porta parallela di un personal computer. Poi attivato, questo fornisce una costante TTL impulso di 5V. Il 7805 chip è un regolatore di tensione 5V collegato ad un 9-12V DC (una batteria di tensione appropriata è bene). Uscita dal 7805 fornisce l&#39;alimentazione allo switch Quad bilaterali e con l&#39;uscita del circuito. Ingresso ai capi della resistenza 1K è dal computer.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Usa dell&#39;Università del Missouri ed eseguito in accordo con il National Institutes of Health Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. La produzione di questo articolo è stato sponsorizzato da Stanford Photonics.

Il protocollo qui descritto vengono utilizzati dei metodi di elaborazione e attuazione micropipette per microiontophoresis. Consegna di acetilcolina viene utilizzato per illustrare il calcio segnalazione sottostante vasodilatazione endotelio-dipendente nelle arteriole del mouse anestetizzato. I nostri risultati dimostrano che la distanza a cui ACh aumenta cellule endoteliali aumenta la fluorescenza di calcio con l&#39;intensità di corrente di espulsione dal micropipetta microiontophoresis (Figura 3). Il mancato aumento della fluorescenza in condizioni di riposo indica perdita trascurabile di ACh dalla micropipetta. La mancanza di risposta a 100 nA intensità dello stimolo (Figura 3, la leggenda), mostra che una soglia di intensità di stimolazione è necessaria per il calcio delle cellule endoteliali ad aumentare. Queste tecniche possono essere facilmente adattato ad altri agenti vasoattivi e preparati tessuti. Considerazioni di ordine pratico: in collaborazione con microiontophoresis per studiare la reattività arteriolare, molte cose devono essere riconosciuti. Mentre si è rivelato difficile determinare la concentrazione effettiva della agonista consegnato, stimolo-risposta curve sono riproducibili all&#39;interno e tra i preparativi. Queste possono essere eseguite tenendo durata dell&#39;impulso costante (ad esempio, 500 ms) e regolare la corrente di espulsione (ad esempio, 250, 500 e 1000 nA; Figura 3). In alternativa, l&#39;espulsione di corrente può essere mantenuta costante (ad esempio, 500 nA) e durata dell&#39;impulso varia (ad esempio, 250, 500 e 1000 ms). Per un riferimento alle azioni di una concentrazione definito agonista, la preparazione può essere superfused con la soluzione appropriata 5. Poiché la forza trainante per l&#39;espulsione soluto è movimento carica elettrica, l&#39;agente da consegnare deve portare un onere netto per essere spostato dalla micropipetta. Per garantire che l&#39;agente di interesse è la portatori di carica primaria, si scioglie ad alta concentrazione (ad esempio, 1 M per ACh) per minimizzare elettro-osmosi. Quando questo richiede manipolare il pH della soluzione di riempimento micropipetta, comandi del veicolo sono tenuti ad accertare eventuali effetti non specifici. Controlli appropriati dovrebbe essere eseguita anche per il passaggio di corrente da solo (ad esempio, usando micropipette riempite con soluzione salina isotonica). La distanza efficace per la diffusione dell&#39;agente dal suo luogo di rilascio dovrebbe essere accertata ed è più facilmente determinata empiricamente dalla scomparsa di una risposta fisiologica (ad esempio, vasodilatazione o un aumento del calcio intracellulare su espulsione di ACh), come la micropipetta è posizionato al definito distanze dal sito di destinazione. In pratica, la distanza effettiva diffusione è fortemente influenzato da come la punta della micropipetta è posizionato nel tessuto, ad esempio, se la punta premuto nel tessuto e la sua punta è occluso, che l&#39;espulsione è compromessa. Eccessiva del tessuto connettivo è particolarmente fastidioso e deve essere rimosso dalla superficie del tessuto durante la preparazione chirurgica. Bisogna anche tenere in considerazione la possibilità di esaurire la punta di un agente designato. Questo viene minimizzato l&#39;uso di impulsi relativamente brevi (ad esempio, ≤ 1 s). Con correnti sostenute (ad esempio, alcuni secondi), l&#39;agonista può essere espulso dalla punta più rapidamente di quanto può essere sostituito per diffusione dalla soluzione di massa compilando la micropipetta. Perché il volume trascurabile è spostato con microiontophoresis, se si sta cercando di cambiare l&#39;ambiente locale ionico (ad esempio, per fornire una K depolarizzante stimolo +), questo non può essere efficacemente realizzato con microiontophoresis ma è facilmente ottenuta con l&#39;espulsione di pressione del liquido sfuso avere il desiderato composizione. Per la stimolazione locale di un arteriola, consigli micropipetta con diametro interno di 2-3 micron funzionano bene con la pressione di eiezione 4-5 psi (28-35 kPa) e durata dell&#39;impulso (ad esempio, 1 secondo) controllata con una valvola a solenoide 10. Qualora la consegna costante di un agente da una micropipetta su un microvasi è necessaria, l&#39;espulsione di pressione è preferibile utilizzare micropipette di adeguati punta diametro interno (ad esempio, ~ 10 micron) 11,12. Una colonna idrostatica di altezza noto con una valvola rubinetto fornisce un poco costoso, ben definito on / off testa pressione costante. Le portate sono determinate dal diametro interno del puntale e la pressione di guida. Come sempre, comandi del veicolo sono essenziali per escludere azioni aspecifiche di espulsione pressione.

<table><tbody><tr><td> Il materiale usato </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Tubi di vetro borosilicato Capillari </td><td> Warner Instruments </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Orizzontale Pipettare Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> modello P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Acetilcolina cloruro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> adattatore per Luer hub </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Per proteggere tubi microcapillare </td></tr><tr><td> 0,2 micron nylon Titan filtro </td><td> Dom Sri </td><td> 42204-NN </td><td> Volume di ritenzione basso per minimizzare la perdita di </td></tr><tr><td> Siringa da 5 ml </td><td> Becton, Dickinson Co. </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta Holder </td><td> Warner Instruments </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Filo d&#39;argento </td><td> Warner Instruments </td><td> AG10W </td><td> Diametro di 0,25 millimetri </td></tr><tr><td> 3-assi micromanipolatore </td><td> Siskiyou Progettazione Instruments </td><td> DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> Componenti per manipolatore come mostrato </td></tr><tr><td> microiontophoresis programmatore corrente </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> Modello 260 </td><td></td></tr><tr><td> dispositivo di innesco </td><td> Costume </td><td> costume </td><td> circuitale fornito in Suppl. Figura 1 </td></tr><tr><td> piastre in acciaio inox </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;x 12&quot; x 12 &quot; </td><td> Secondo il disegno </td></tr><tr><td> Intensificato Fotocamera Digitale </td><td> Stanford Photonics Inc </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Integrato con il software di controllo Piper </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis comporta passaggio di corrente attraverso una punta micropipetta per fornire un soluto in un luogo designato all&#39;interno di una preparazione sperimentale. Microiontophoresis in grado di simulare la trasmissione sinaptica 1 fornendo neurotrasmettitori e neuropeptidi sui neuroni riproducibile 2. Volume non trascurabile (fluido) spostamento evita disturbo meccanico alla preparazione sperimentale. Adattare queste tecniche per la microcircolazione 3 ha attivato meccanismi di vasodilatazione e vasocostrizione da studiare a livello microscopico in vivo 4,5. Uno dei principali vantaggi di tale erogazione localizzata è che permetta una reazione vasomotoria da studiare a siti definiti all&#39;interno di una rete microvascolare senza evocare cambiamenti sistemici o riflessivo della pressione sanguigna e il flusso di sangue dei tessuti, rivelando così le proprietà intrinseche dei microvasi. Una limitazione di microiontophoresis è che la concentrazione precisa di agenti consegnato al sito di interesse è difficile da accertare 6. Tuttavia, la sua uscita dalla punta micropipetta è proporzionale alla intensità e la durata della espulsione attuale 2,7, in modo tale che riproducibile stimolo-risposta può essere facilmente determinata nelle condizioni sperimentali ben definite (descritta sotto). Altri fattori influenzano la consegna microiontophoretic comprendono concentrazione di soluto e la sua ionizzazione in soluzione. Il diametro interno della punta micropipetta dovrebbe essere ~ 1 micron o meno di ridurre al minimo diffusionale &#39;fuga&#39;, che possono essere contrastati con una corrente di fissaggio. Così un verso l&#39;esterno (positivo) di corrente viene utilizzato per espellere un catione e una corrente negativa utilizzata per conservarlo all&#39;interno della micropipetta. Fabbricazione di micropipette è facilitata con sofisticate estrattori elettronico 8. Micropipette sono tirati da tubi di vetro capillari contenenti un filamento che la soluzione &#39;stoppini&#39; nella punta della micropipetta quando riempito il back-end (&quot;riempito&quot;). Questo viene fatto inserendo un tubo microcapillare collegato ad una siringa contenente la soluzione di interesse e di espellere la soluzione nel lume della micropipetta. Micromanipolatori consentono il posizionamento desiderato delle micropipette all&#39;interno della preparazione sperimentale. Micromanipolatori montato su una base mobile può essere posizionato intorno alla preparazione in base alla topografia della rete microvascolare (sviluppato sotto). Il protocollo attuale dimostra microiontophoresis di acetilcolina (ACh + Cl -) su una arteriola della preparazione del mouse muscolo cremastere (Cfr. il protocollo: ID JOVE # 2874) per produrre vasodilatazione endotelio-dipendente. Consegna stimolo è sincronizzato con l&#39;acquisizione di immagini digitalizzate mediante un trigger elettronico. L&#39;uso di BAC-CX40 GCaMP2 topi transgenici 9 consente la visualizzazione delle risposte intracellulari di calcio sottostante vasodilatazione arteriolare in cellule endoteliali del microcircolo viventi.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis comporta movimento di ioni da una micropipetta in risposta ad una differenza di potenziale elettrico tra l&#39;interno el&#39;esterno della micropipetta. Molecole biologicamente attive sono quindi consegnati in proporzione alla corrente elettrica. Illustriamo microiontophoresis acetilcolina in collaborazione con micromanipolazione per studiare vasodilatazione endotelio-dipendente nel microcircolo.

Microiontophoresis e Micromanipolazione per intravitale Imaging di fluorescenza del microcircolo

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Views.  University of Missouri. Microiontophoresis comporta movimento di ioni da una micropipetta in risposta ad una differenza di potenziale elettrico tra l'interno el'esterno della micropipetta. Molecole biologicamente attive sono quindi consegnati in proporzione alla corrente elettrica. Illustriamo microiontophoresis acetilcolina in collaborazione con micromanipolazione per studiare vasodilatazione endotelio-dipendente nel microcircolo.

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Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

La normalizzazione nata per fluorescenza Tomografia Ottica proiezione per l&#39;imaging tutto il cuore

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Ricerca

Biologia

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

La preparazione muscolare mouse Cremaster for Imaging intravitale del microcircolo

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Microiontophoresis e Micromanipolazione per intravitale Imaging di fluorescenza del microcircolo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

La normalizzazione nata per fluorescenza Tomografia Ottica proiezione per l'imaging tutto il cuore

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

La preparazione muscolare mouse Cremaster for Imaging intravitale del microcircolo

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l'analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine fluorescenti

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

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