著者らの研究室では、健康補助R37 - HL041026、R01 - HL086483とR01 - HL056786（SSS）と米国公衆衛生局からF32 - HL097463とT32 - AR048523（PB）での国民の協会によってサポートされています。

1。動物のケアと使用レビューと動物実験と使用委員会の承認に続いて、少なくとも12週齢の雄マウスが使用されます。マウスは、腹腔内（ip）注射を介してペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）で麻酔です。外科的処置および実験的なプロトコルを通じて、麻酔は必要に応じてサプリメント（最初の注射の10-20％は、ip）（;つま先や尾のピンチに撤退の反応によって示される毎に30〜60分）によって維持されています。実験手順の完了後にマウスはペントバルビタール（IP）と頚椎脱臼により安楽死と過剰投与されています。 2。マイクロピペットおよびMicroiontophoresis <ol><li> Microiontophoresisのマイクロピペットは、（内部の先端の直径は、約1ミクロン）水平ピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラス毛細管から調製される。私達のものは剛性のための〜5mmのテーパーを持って、長いテーパーはより柔軟です。 </li><li>マイクロピペットは18.2MΩ水に溶解した1Mアセチルコリン（図1a - C）で充填されています。埋め戻しのために、マイクロキャピラリーチューブは、関心のアゴニスト（図1）を含む注射器に結合さ0.2μmのフィルターに接続されています。これらは容易に作製（下）または商用ベンダーから購入することができます。マイクロキャピラリーチューブは、マイクロピペットのバックエンドに挿入され、マイクロピペットがいっぱいになるにつれてマイクロキャピラリーチューブを引き出しながら、AChのソリューションは、内腔に配信されます。その先端が下向きにマイクロピペットを保持し、気泡が静かにマイクロピペットをフリックすることで削除されます。 </li><li>マイクロピペット、マイクロマニピュレータ（図2）に取り付けられたホルダーに固定されています。ホルダーは、順番にmicroiontophoresisプログラマの正端子に接続された外部ピンにマイクロピペット内AChのソリューションを接続する銀線を持っています。組織調製の端に固定された第二銀線は、マイクロピペットの先端は準備以上の生理食塩液に進出されると回路を完成するために負端子に接続されている。 </li><li>保持電流は、マイクロピペットの先端が動脈壁に隣接して配置されている場合（または蛍光応答）血管拡張を防ぐために適用されます。現在保持すると、マイクロピペットの先端（内径= 1μm）とアゴニストの濃度の大きさによって異なりますが定義されたパラメータ（我々が1Mアセチルコリン、1μmの先端のための〜200 nAを使用する）ための高度に再現可能であるだろう。保持電流は、画像取得の開始と同期して電子トリガ（補足図1）を介して放出電流の配信と一致しなくなります。 </li></ol> 3。マイクロマニピュレーション<ol><li> XY顕微鏡ステージ用のカスタムプラットフォームは、強磁性ステンレス鋼で作製した。プラットフォームの寸法は（1 / 8&quot;X 12&quot;X 13&quot;）、必要に応じて、実験準備の周り位置のマイクロマニピュレータ（図2A）に十分なスペースを有効にしてください。マグネットベースに固定されたマイクロマニピュレーターは、準備が指示として（図2B）の位置決めを可能にする。これらは、興味のあるサイト（図2C）での位置決めマイクロピペットの準備の周り作製プラットフォーム上に直接配置。 </li></ol> 4。代表的な結果<ol><li>マイクロピペットの先端が動脈に隣接して配置して、アセチルコリンに対する蛍光応答は、（AChの漏洩を防止するために調整よりも、現在の保持）があります。閾値刺激の下には効果がありませんでした。しかし、刺激強度が増加すると、内皮細胞のカルシウムの蛍光は、細動脈に沿って徐々に長い距離にわたって増加として刺激の部位（図3）で蛍光強​​度を行いました。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 Microiontophoresisピペットをバックフィルするための方法。 A）マイクロキャピラリーチューブ（緑の矢印）はその後、1Mアセチルコリンで満たされた注射器に接続されている0.2μmのフィルター（紫矢印）に接続された圧縮フィッティング（青矢印）で固定されています。B）マイクロキャピラリーチューブが送り込まれているmicroiontophoresisのバックエンドを介してピペットおよびソリューションは、マイクロピペットの内腔を埋めるために変位する。C）は、ピペットがいっぱいになると、気泡（黒い矢印）を削除するためにダウンし、軽くテーパー上にフリックして先端を保持する。 <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。マイクロマニピュレータを配置するためのカスタムプラットフォーム。 A）強磁性ステンレス鋼のプラットフォームはXY並進ステージを含むカスタムMVX10顕微鏡のベース上に配置されたコンパクトな3軸のマイクロマニピュレータの底面に貼らB）円形マグネットベースはC）は 、実験準備の周りに配置マニピュレーター（関連するプロトコルを参照してください。。：特定の旧跡を研究するためにJoveのは、ID＃2874）。市販IRコンパクトなサイズと汎用性は、複数のマイクロピペットを同時に使用することもできるようになりました。 <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。細動脈のカルシウムの蛍光。細動脈壁の内側を覆う内皮細胞のカルシウムの蛍光は、刺激強度とともに増加した。に対する蛍光応答の画像を示されている最初の3つのパネル）250 NA、B）500 nAとC）、現在の1000年nAの放出（すべての500 msのパルス持続時間）。内皮細胞のカルシウムの蛍光が増加する距離は、AC（それぞれ〜130、270、400μmの、）の括弧で示されます。各パネル内の細動脈間の基準線は、アセチルコリンに対する蛍光応答（F / FO）は刺激の部位で記録した場所を示します。増加するAChの刺激のためのF / FO対時間のD）録音。現在の放出が増加するにつれて、F / FOは、振幅と持続時間に増加した。 100nAの刺激が閾値以下だと効果がないことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="補足図1" /> 補足図1。電子トリガの回路図この回路は、パーソナルコンピュータからのパラレルポートとインタフェースです。それは、5Vの一定のTTLパルスを提供するときに活性化した。 7805チップは9 - 12V DC電源装置（適切な電圧の電池で結構です）に接続して5Vの電圧レギュレータです。 7805からの出力は、クワッドバイラテラルスイッチすると、回路の出力に電力を提供します。 1K抵抗の両端の入力は、コンピュータからです。

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

動物に関わるすべての手順およびプロトコルは、ミズーリ大学の動物実験委員会によって承認され、 実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所のガイドと一致して行われた。この記事の制作は、スタンフォードフォトニクスが主催した。

ここで記述されたプロトコルはmicroiontophoresis用マイクロピペットを準備し実施するための方法を示しています。アセチルコリンの配信を、麻酔下のマウスの動脈にカルシウムシグナリング基礎内皮依存性血管拡張を説明するために使用されます。我々の結果は示しているアセチルコリンはmicroiontophoresisのマイクロピペット（図3）から現在の放出の強さで内皮細胞のカルシウムの蛍光の増加を増加する距離。安静時に蛍光増加の欠如は、マイクロピペットからのアセチルコリンの無視できる漏れを示します。 100nAの刺激の強度（図3、伝説）への応答の欠如は、刺激の閾値強度が増加する内皮細胞のカルシウムが必要であることを示しています。これらの技術は、容易に他の血管作動性薬剤と組織の準備に適応することができます。 実用的な考慮事項：細動脈の反応性を研究するmicroiontophoresisでの作業では、いくつかのことが認識されるべきである。それは納入アゴニストの実際の濃度を決定するために困難であることが判明している一方で、刺激 - 反応曲線は準備中との間で再現性があります。これらは、（;図3例、250、500、1000 nAの）パルス幅を一定に保持している（例えば、500ミリ秒）と現在の放出を変化させることによって行うことができます。また、現在の放出を一定に保つことができる（例えば、500 nAの）とパルス幅様々な（例えば、250、500および1000ミリ秒）。定義されたアゴニストの濃度のアクションへの参照の場合、製剤は、適切なソリューションを5で灌流することができます。溶質放出の駆動力は電荷の運動なので、配信されるエージェントは、マイクロピペットから避難する正味の電荷を運ぶ必要があります。興味のエージェントが一次電荷キャリアであることを保証するために、それは電気浸透を最小限に抑えるために高濃度（例えば、アセチルコリンのための1 M）で溶解される。これはマイクロピペット充填溶液のpHを操作する必要があるときは、車両のコントロールはどの非特異的な影響を把握する必要があります。適切なコントロールがまた単独での電流の通過のために実行する必要があります（例えば、等張生理食塩水で満たされたマイクロピペットを用いて）。リリースのそのサイトからのエージェントの普及のための効果的な距離は知ることが必要とマイクロピペットの位置にあるように最も容易に生理学的な応答（例えば、血管拡張やアセチルコリンの放出時に細胞内カルシウムの上昇）の消失によって経験的に決定され標的部位からの距離を定義する。実際には、効果的な拡散距離が大幅にマイクロピペットの先端が組織にどのように配置するかによって影響され、組織とその先端に押さ先端が閉塞されている場合など、排出が損なわれているよりも。過剰な結合組織は、特に面倒ですし、手術の準備中に、組織の表面から除去されるべきである。注目は、指定されたエージェントの先端を破壊する可能性を考慮する必要があります。これは、比較的短いパルス（例えば、≤1秒）を用いて最小化されます。持続的な電流（例えば、数秒）で、アゴニストは、それがマイクロピペットで、バルク充填溶液からの拡散によって置き換えることができるよりも急速に先端から追放されることがあります。 一つ（例えば、+刺激を脱分極Kを配信するために）localイオン環境を変更しようとしている場合は無視できるボリュームは、microiontophoresisで置換されているので、これは以下にmicroiontophoresisで達成することはできますが、容易に希望をのバルク流体の圧力の排出によって達成される組成物。細動脈の局所的刺激の場合は2〜3μmの内径を持つマイクロピペットの先端には噴射圧力4月5日PSI（28から35 kPa）のと電磁弁10を制御するパルス幅（例えば、1秒）でうまく動作。微小血管へマイクロピペットからのエージェントの持続的な配信が必要な場合には、圧力の取り出しは、適切な内部先端径（例えば、〜10μm）を11,12のマイクロピペットを用いて好適である。活栓バルブの既知の高さの静水圧列には、一定の圧力ヘッドのオン/オフの明確に定義された、安価に提供します。流量は、ピペットチップと駆動圧力の内径によって決定されます。いつものように、車両のコントロールは、圧力放出の非特異的な行動を排除するために不可欠です。

<table><tbody><tr><td> 使用する材料 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> GC120F - 10 </td><td></td></tr><tr><td>水平ピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td>モデルP - 97 </td><td></td></tr><tr><td>塩化アセチルコリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td>ルアーハブ用のアダプタ</td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td>マイクロキャピラリーチューブを保護するには</td></tr><tr><td> 0.2μmのナイロンタイタンフィルター</td><td>日スリランカ</td><td> 42204 - NN </td><td>損失を最小限に抑えるため、低保持容量</td></tr><tr><td> 5 mlのシリンジ</td><td>ベクトンディッキンソン（株） - </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットホルダー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> E45W - M12VH </td><td></td></tr><tr><td>シルバーのワイヤ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> AG10W </td><td> 0.25ミリメートルの直径</td></tr><tr><td> 3軸マニピュレーター</td><td>シスキユーデザインインスツルメンツ</td><td> DT3 - 100、MXB、MXC、MGB / 8 </td><td>示すようにマニピュレータのためのコンポーネント</td></tr><tr><td> microiontophoresis現在のプログラマー</td><td>世界の精密機器</td><td>モデル260 </td><td></td></tr><tr><td>トリガーデバイス</td><td>カスタム</td><td>カスタムの</td><td>回路はすべてCiNiiに用意。図1 </td></tr><tr><td>ステンレス鋼板</td><td>マクマスター - カー</td><td> 1 / 8&quot;X 12&quot;X 12&quot; </td><td>設計によると、 </td></tr><tr><td>激化するデジタルカメラ</td><td>スタンフォードフォトニクス株式会社</td><td> XR/Mega-10 </td><td>パイパー制御ソフトウェアとの統合</td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresisは実験的な準備の中で指定されたサイトでの溶質を提供するためにマイクロピペット先端部を流れる電流の通過を伴います。 Microiontophoresisは再現性ニューロン2の上に神経伝達物質および神経ペプチドを提供することにより、シナプス伝達1をシミュレートすることができます。無視できる量は（流体）の変位は、実験的な準備に機械的な障害を回避することができます。微小循環3にこれらの技術を適応させる血管拡張と血管収縮のメカニズムをin vivoで 4,5 の顕微鏡レベルで検討することが可能になりました。このような局所的輸送の主要な利点は、それによって血管の固有の特性を明らかに、血圧と組織の血流に全身または反射的な変更を想起させることなく、微小血管ネットワーク内で定義されているサイトで勉強する血管運動応答を可能にしています。 microiontophoresisの制限は、興味のあるサイトに配信エージェントの正確な濃度が6を把握することが困難なことです。それにもかかわらず、マイクロピペットの先端からのリリースでは、2,7現在の放出の強さと持続時間に比例する、ように再現性の刺激-反応関係は、容易に定義されている実験条件（後述）の下に決定することができます。 microiontophoretic配信に影響を及ぼすその他の要因は、溶質濃度と溶液中でのイオン化が含まれています。マイクロピペットの先端の内径は、保持電流を相殺することができます拡散&quot;漏れ&quot;を最小限に抑えるために、〜1μm以下にする必要があります。したがって、外側（正）現在は、マイクロピペット内に保持するために使用される陽イオンと負の電流を取り出すために使用されます。 マイクロピペットの作製は、洗練された電子車夫8で促進される。マイクロピペットは、バックエンド（&quot;埋め戻す&quot;）から充填マイクロピペットの先端に&quot;芯&quot;解決策そのフィラメントを含有するガラス毛細管から抜き出されます。これは、マイクロピペットの内腔に関心や取り出しソリューションのソリューションを含むシリンジに接続されているマイクロキャピラリーチューブを挿入することによって行われます。マニピュレーターは、実験準備中マイクロピペットの所望の配置を有効にしてください。可動ベースに搭載されたマイクロマニピュレータは、微小血管ネットワーク（以下開発）の地形に応じて準備の周りに配置することができます。 内皮依存性血管拡張を生成するために：（JoveのIDは＃2874に関連付けられたプロトコルを参照）マウスの精巣挙筋の準備の小動脈に-現在のプロトコルは、アセチルコリン（ACH + Cl）のmicroiontophoresisを示しています。刺激の配信は電子トリガを使用してデジタル化された画像取得と同期しています。 CX40 BAC - GCaMP2トランスジェニックマウス9の使用は、生活の微小循環に細動脈内皮細胞の血管拡張の基盤となる細胞内カルシウム応答の可視化を可能にします。

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresisは、マイクロピペットの内側と外側との間の電位の差に応答して、マイクロピペットからのイオンの動きを伴います。生物学的活性分子は、それによって電流に比例して配信されます。我々は、微小循環の内皮依存性血管拡張を研究するためにマイクロマニピュレーションと連携してアセチルコリンのmicroiontophoresisを示しています。

微小循環の生体内蛍光イメージングのためのMicroiontophoresisとマイクロマニピュレーション

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K ビュー.  University of Missouri. Microiontophoresisは、マイクロピペットの内側と外側との間の電位の差に応答して、マイクロピペットからのイオンの動きを伴います。生物学的活性分子は、それによって電流に比例して配信されます。我々は、微小循環の内皮依存性血管拡張を研究するためにマイクロマニピュレーションと連携してアセチルコリンのmicroiontophoresisを示しています。

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Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

心臓全体のイメージング用蛍光光学投影トモグラフィのために生まれたの正規化

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

生物学

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.