وأيد هذا العمل عن طريق التمويل من منحة الطب والصحة أبحاث من مدينة باريس ، والجمعية الوطنية الفرنسية منحة ANR - 09 - JCJC - 0118 - 1 ، والمنسق بدء المشروع RNAvirusPopDivNVax المنحة لا. 242719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

اختيار خط الخلية. نجاعة النظير قاعدة المطفرة RNA كما يرتبط امتصاص النسبية من خلال أنواع مختلفة من الخلايا 11. إذا كان خط الخلية التي تستخدم عادة لمرور الفيروس ثبت أن صهر لامتصاص مطفر أو حساسة جدا (عالية السمية الخلية) ، فإنه قد يكون من الضروري استخدام خط آخر الخلية التي تلبي هذه الاحتياجات ، ولا تزال متساهلة لتكاثر الفيروس. بمجرد أن يتم عزل المقاومة المتغير المغير ، يمكن تنفيذ ما تبقى من خصائص في النص الأصلي ، خط خلية المفضل. في تجربتنا ، تأخذ خلايا هيلا بسهولة حتى المغير ؛ خلايا BHK تتطلب تصل إلى 10 أضعاف تركيزات أعلى وخلايا فيرو وصهر لامتصاص المغير. اختيار المغير. وفي محاولة لعزل المتغيرات الإخلاص المغير عن طريق العلاج ، واحتمال للنجاح هو زيادة إذا تم استخدام أكثر من نوع واحد من المغير. والمطفرة قاعدة تمثيلية مختلفة من الهيكل ، التي أدرجت خطأ في الجينوم أثناء النسخ المتماثل في الغالب نتيجة حمل في مجموعة فرعية محددة من الطفرات في تكرار دورات لاحقة : ريبافيرين العلاج تفضل GtoA والطفرات التي تمر بمرحلة انتقالية CtoU 12 ؛ 5 - آزاسيتيدين لديه تحيز مماثلة ، مع إضافة CtoG وtransversions GtoC 13 ؛ 5 فلورويوراسيل تفضيلي يدفع التحولات AtoG وUtoC 14. بدلا من ذلك ، تركيزات أعلى من المغنيسيوم أو 2 + 2 + يمكن المنغنيز أن تستكمل في المتوسط ​​إلى زيادة وتيرة الطفرة الشاملة لفيروسات الحمض النووي الريبي دون تحيز 12 المذكورة أعلاه. تبعا لتسلسل الفيروس رامزة ، والتغييرات المطلوبة لتوليد كودون متغير الإخلاص ، وبعض هذه الشروط سيكون في صالح ظهور هذا الخيار على الآخرين. للأعلى G64S فيروس شلل الأطفال والإخلاص كوكساكي A372V الفيروس ، ريبافيرين العلاج الأكثر بسهولة المختارة للمتغيرات التي تمر بمرحلة انتقالية بسبب AtoG المطلوبة في موقع كودون مساويا لالطفرات الناتجة في الغالب عن طريق هذه ريبافيرين. وزارة الداخلية مقابل حجم السكان في علم الفيروسات ، وبروتوكولات للعدوى الأنسجة تولي اهتماما خاصا لتعدد العدوى (وزارة الداخلية) ، لتجنب تراكم الجزيئات التالفة التدخل (منخفضة وزارة الداخلية) ، أو لتشجيع إعادة التركيب بين الفيروسات (عالية وزارة الداخلية) ، ل مثال على ذلك. لتحديد مدى ظهور لأحداث المسلسل الركض ، فمن المهم أيضا النظر في حجم السكان الفيروس. منذ الطافرة المقاومة موجودة في البداية في التردد المنخفض ، فمن الأفضل لنقل كبيرة مثل حجم السكان ممكن من العبور إلى التالي (5 -10 الفيروسات 6 10 ، على سبيل المثال) لتجنب فقدان هذه المتغيرات المستجدة في كل عبور. قد زيادة حجم البئر أو قارورة (عدد الخلايا المصابة) يساعد على الحد من الزيادة في وزارة الداخلية اذا كان هذا هو القلق. من ناحية أخرى ، لإجراء التجارب التي يجري فيها اختبار حساسية الفيروس إلى المغير ، يتم تنفيذ العدوى المنخفضة وزارة الداخلية من أجل زيادة عدد الدورات التي تحدث في تكرار التجربة وتجنب إنقاذ الجينوم mutagenized بواسطة الجينوم العالي من خلال اللياقة البدنية تكامل في المشاركة في إصابة الخلايا. هذا أمر مهم لأن سوف لا الطفرات الناتجة عن الجينوم ذرية خلال الجولة الأولى من النسخ المتماثل يتم الكشف على الفور. وسيظل معظم هذه الرناوات mutagenized يمكن تعبئتها في الفيريون. فهو في الجولة القادمة من العدوى التي الطفرات المميتة موجودة في هذه الخريطة الجينية سوف يؤدي إلى إحباط دورة النسخ المتماثل ، والحد من عيار الفيروس. قد يكون من الضروري للسماح لعدة جولات من تراكم الطفرات قبل لوحظ تأثير كبير من الطفرات المميتة. أخيرا ، إذا كانت أكثر من سلسلة مرور في حضور المغير ، والتتر الفيروس يستمر في الانخفاض حتى الانقراض ، ثم ينبغي أن الباحث حاول الركض الفيروس تدريجيا في زيادة كميات المغير (بدءا من تركيز منخفض للغاية). العزلة واستنساخ جيل من الحمض النووي الريبي مطفر مقاومة من السكان مطفر مقاومة الحمض النووي الريبي. المطفرة إدخال الحمض النووي الريبي الطفرات العشوائية متعددة إلى كل الجينوم ، ولكن اختيار المقاومة سوف تثري فقط (والإصلاح إلى توافق في الآراء تسلسل) الطفرة المقاومة. لتحديد هذه الطفرة ، ونحن تسلسل السكان مقاومة المغير (توافق آراء من السكان) وليس الفيروسات الفردية. وبالتالي ، لم يتم الكشف عن واحد ، والطفرات العشوائية التي أوجدتها المغير في تسلسل ؛ فقط الطفرات التي تم العثور عليها نتيجة التغيرات في الآراء التالية الاختيار. في تجربتنا نحن فقط تحديد واحد أو اثنين تسلسل توافق هذه التغييرات. مرة واحدة يتم الحصول على مقاومة السكان مطفر ويتم التعرف على الطفرات المقاومة ، فمن الضروري لتوليد مزيد من الأسهم النقية لهذا المتغير. أعلاه ، وصفنا إجراء تنقية البلاك. بدلا من ذلك ، اذا كان الفيروس من الفائدة لا تنتج صفائح يسهل التعرف عليها ، قد تكون البديل المطلوب purifالعبوات الناسفة عن طريق الحد من التخفيف. هذا النهج هو أساسا في شكل TCID 50 96 - جيدا ، حيث يتم تخفيف المخزون الفيروس بحيث يصاب أقل من 50 ٪ من الآبار. باستخدام هذا التخفيف ، ويتم اتخاذ نفس النهج كما ذكر أعلاه ، في عزل ما يصل الى 10 المتغيرات الفردية ويؤكد على متواليات. كما ذكر ، في أفضل الحالات ، وهي استنساخ [كدنا] المعدية من سلالة الفيروس هو متاح. وبمعزل عن البديل وبالتالي لا يكون ضروريا. في تجربتنا ، الإخلاص المتغيرات هي نتيجة لاستبدال واحد من الأحماض الأمينية وبالتالي يمكن إنشاؤها باستخدام بسيطة ، ومجموعات الطفرات تجاريا مثل Quikchange (اجيلنت). وثمة خيار الثانوي هو استخدام استنساخ [كدنا] من سلالة ترتبط ارتباطا وثيقا. ومع ذلك ، إذا تم استخدام سلالة ذات الصلة ، نقترح بشدة استخدام كل من هذا النهج ، وعزل الفيروس (مثل تنقية لوحة) لأننا وجدنا أن الطفرة الإخلاص نفسه تغيير على اثنين من الفيروسات وثيق الصلة لن يكون بالضرورة نفس التأثير. وقد أسفرت الإخلاص وتكرارها. اختيار المتغيرات مطفر RNA مقاومة في معزل عن كلا الخيارين الإخلاص أعلى وأقل مع خصائص النمو التي هي مماثلة لنظرائهم نوع البرية 4،12،15. حاليا ، لا يتم الربط بين معدلات النشاط والإخلاص بوليميريز مفهومة تماما. في المختبر أظهرت الدراسات البيوكيميائية باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز المنقى أن أعلى معدلات الدقة المتغيرات تجهيز أبطأ ، في حين أن انخفاض المتغيرات الإخلاص تميل إلى أن تكون أسرع تجهيز 1-3،12. في مجال زراعة الأنسجة ، وهذه الاختلافات ليست واضحة في العادة ، مما يدل على أن توافر الموارد ، بدلا من الذاتية حركية النشاط بوليميريز ، هو معدل الحد خطوة. إذا كان يتطابق مع الإخلاص البديل الحركية التي لا تختلف كثيرا عن النوع البري ، ومن ثم يمكن مقارنة الترددات الطفرة التي قطعتها على نفسها مباشرة. إذا كان تغيير كبير جدا في حركية تكرار موجودا ، ثم يجب أن تكون البيانات تطبيع لمراعاة الفروق الحركية ، على سبيل المثال ، التي قارنت بين الفيروسات التي خضعت لنفس العدد من الدورات النسخ المتماثل. في تجربتنا ، على الرغم من ملاحظة وجود اختلافات كبيرة في خطوة واحدة حركية النمو بين نوع البرية والمتغيرات عالية الدقة ، لاحظنا أن ارتفاع المتغيرات الإخلاص عيار باستمرار أعلى (في حدود 1 في السجل) بالمقارنة مع النوع البري لكنها تجعل أقل قليلا RNA (داخل بنفس الترتيب من حيث الحجم) ، مما يشير أيضا إلى أن العوامل الوراثية التي تنتجها تحتوي على عدد أقل من الطفرات وبالتالي فهي أكثر المعدية. إعداد العينات وتسلسلها وبالنسبة لجميع الخطوات في هذه البروتوكولات ، لا بد من أن تستخدم عالية الدقة ، ودليل على القراءة والانزيمات لPCR RT PCR - للحد من طفرات إضافية منذ عرضه لا يمكن تمييزها عن الطفرات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. فمن الأهمية بمكان أن تم إعداد السكان الفيروس يمكن مقارنة في نفس الظروف (التاريخ المرور ، والأنسجة المتوسطة والثقافة ، ودرجة الحرارة ، وطريقة استخلاص الحمض النووي الريبي ، RT - PCR البروتوكولات ، الخ) ومن المهم أيضا لضمان ما يكفي من المواد ابتداء كان تم الحصول عليها من استخراج الحمض النووي الريبي بحيث يتم إنشاء فرقة قوية من جانب RT - PCR. وينبغي أن يكون مخفف 1 / 100 من عينة الحمض النووي الريبي تعطي أيضا للكشف RT - PCR الفرقة ، مشيرا إلى أن العينة تحتوي على أعداد كافية من جزيئات الحمض النووي الريبي لتجنب التحيز التمثيل (تضخيم الجينوم نفسه مرارا وتكرارا). تردد منذ الطفرة هو التوزيع ، فإن للمرء أن يتوقع أن يتم الحصول على قيم متشابهة بغض النظر عن حجم السكان ، وفرت التحيز المذكور لا يحدث. كما يبين الشكل رقم 6 ، 10 5 أضعاف التخفيف من مخزون فيروس يعطي التردد الطفرة التي لا تختلف كثيرا عن المخزون الأبوية. حتى يتم العثور على الظروف المثلى للاستنساخ TopoTA ، تؤكد وجود تدرج بعد الفحص أزرق / أبيض ، بواسطة PCR مستعمرة قبل التسلسل. كعنصر تحكم عن الضوضاء طفرية (الطفرات التي أدخلها RT - PCR وتسلسل) ، استنساخ منتج PCR من تحمل البلازميد تسلسل الفيروسي نفسه و / أو استنساخ وتسلسل المنتجات RT - PCR من الحمض النووي الريبي في المختبر كتب المقابلة لجينوم الفيروس (يكون علم أن الأنزيمات النسخ المختلفة في المختبر ومعدلات الخطأ ومختلفة قد لا تعطي معلومات مفيدة بالنسبة لخطأ في الإجراءات الخلفية الحقيقية لديك). قد تكون بعض تسلسل الفيروس يمكن أن تكون سامة للبكتيريا ، لذلك فمن المهم للتحقق من ذلك قبل اتخاذ قرار بشأن هذه المنطقة من الجينوم الفيروسي لتكون متسلسلة لتواتر الطفرات. في تحليل تسلسل TopoTA التي حصلت عليها ، لاحظ أن كل نسخة واحدة فقط يجب أن يحتوي على إدراج / التسلسل. إذا لوحظ ذروة مزدوجة ، مما يشير إلى مجموعة من السكان مختلطة ، فمن الممكن أن اختيار اثنين من المستعمرات البكتيرية المجاورة. ومن الممكن أيضا ، على الرغم من المستبعد جدا بالنظر إلى الطفرة الترددات المنخفضة في النسخ المتماثل البكتيرية ، والتي تم تقديمها خلال الطفرة التضخيم من البلازميد في الثقافة البكتيرية. في لوحة عurified السكان ، قد تمثل ذروة مزدوجة لوحات متداخلة ، أو فيروس الذي تم الحصول على طفرة جديدة أو العودة طفرة خلال تطوير البلاك. أن تكون متسقة واتخاذ قرار بشأن ما إذا كان الاعتماد أم لا عد هذه الطفرات. في النهاية ، أن نضع في الاعتبار أن الطفرة الترددات المستخدمة هنا هي قيم نسبية. فهي صالحة فقط في المقارنة بين السكان الفيروس نمت في ظل حالة واحدة ، ومتسلسلة على المنطقة نفسها! يجب ألا تؤخذ على أنها قيم مطلقة معدل الطفرة ، أو تردد طفرة في الجينوم ككل. ومع ذلك ، عندما يتم التحكم في الظروف ، فإنها تسمح للتكرار ، والمقارنات الكمية الخلافات في توزيع طفرة والتردد.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> ريبافيرين </td><td> سيغما </td><td> R9644 - 10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5 فلورويوراسيل </td><td> سيغما </td><td> F6627 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> 5 - آزاسيتيدين </td><td> سيغما </td><td> A2385 - 100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> سيغما </td><td> M1028 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> سيغما </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> زرقة التريبان </td><td> سيغما </td><td> T8154 - 20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA استنساخ عدة </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange الطفرات طقم </td><td> اجيلنت </td><td> 200516 </td><td> إذا كان استنساخ [كدنا] المعدية متاح </td></tr><tr><td> 96 - جيدا miniprep طقم </td><td> Macherey - ناجل </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene ، Sequencher </td><td> DNAstar ، جين رموز المؤسسة </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> أو برامج أخرى المحاذاة </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

فيروسات الحمض النووي الريبي النووي الريبي التي تعتمد استخدام الحمض النووي الريبي لتكرار polymerases الجينوم الخاصة بهم. نسبة الخطأ عالية جوهريا من هذه الأنزيمات هي مساهم كبير في توليد تنوع السكان المتطرفة التي تسهل التكيف مع الفيروس والتطور. تزايد الدلائل تشير الى ان معدلات الخطأ الجوهرية ، والطفرة الترددات الناتجة من فيروسات الحمض النووي الريبي ويمكن عن طريق التضمين خفية تغييرات الأحماض الأمينية للبوليميريز الفيروسية. على الرغم من وجود فحوصات البيوكيميائية لبعض polymerases الجيش الملكي النيبالي الفيروسية التي تسمح قياس الكمي لإدماج الإخلاص ، ونحن هنا وصفا لطريقة بسيطة لقياس الترددات تحور الفيروسات الحمض النووي الريبي التي أثبتت أن تكون دقيقة قدر نهج البيوكيميائية في تحديد الطفرات تغيير الدقة. هذا النهج يستخدم التقنيات التقليدية وتسلسل الفيروسي التي يمكن تنفيذها في مختبرات معظم الأحياء. بناء على خبرتنا مع عدد من الفيروسات المختلفة ، وحددنا الخطوات الرئيسية التي يجب أن يكون الأمثل لزيادة احتمال عزل المتغيرات الإخلاص وتوليد البيانات ذات دلالة إحصائية. ويمكن عزل وتوصيف الطفرات تغيير الإخلاص تقديم رؤى جديدة في هيكل ووظيفة بوليميريز 1-3. وعلاوة على ذلك ، يمكن لهذه المتغيرات الإخلاص أن تكون أدوات مفيدة في تشخيص آليات للتكيف وتطور الفيروس 4-7.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency at JoVE.com

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

هذه المادة يصف الخطوات اللازمة لعزل وتوصيف المتغيرات بوليميريز RNA الإخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي ، وكيفية استخدام البيانات وتيرة الطفرة لتأكيد التغييرات الدقة في زراعة الأنسجة.

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.4K Views.  Institut Pasteur. هذه المادة يصف الخطوات اللازمة لعزل وتوصيف المتغيرات بوليميريز RNA الإخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي ، وكيفية استخدام البيانات وتيرة الطفرة لتأكيد التغييرات الدقة في زراعة الأنسجة.

Video: Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

عزل وتوصيف العدلات مع خصائص مضادة للورم

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...