Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della ricerca medica e sanitaria sovvenzione da parte del Comune di Parigi, la nazionale francese concedere ANR-09-JCJC-0118-1, e l&#39;ERC Starting Grant Progetto RNAvirusPopDivNVax no. 242719.

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	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. 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R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Scelta di linee cellulari. L&#39;efficacia degli analoghi base come l&#39;RNA mutageni si correla con l&#39;assorbimento da parte relativa da diversi tipi di cellule 11. Se la linea cellulare che viene normalmente utilizzato per il passaggio del virus si rivela refrattaria alla mutageno assorbimento o troppo sensibile (ad alta tossicità cellulare), può essere necessario utilizzare un&#39;altra linea cellulare che risponde a questi requisiti ed è ancora permissiva per la replicazione virale. Una volta che la variante resistenza mutageno è isolato, il resto della caratterizzazione può essere eseguita in originale, linea cellulare preferito. Nella nostra esperienza, le cellule HeLa facilmente prendere mutageni; cellule BHK richiedere fino a concentrazioni superiori di 10 volte e le cellule Vero sono refrattari ad assorbimento mutagene. Scelta del mutageno. Nel tentativo di isolare le varianti fedeltà da un trattamento mutageno, la probabilità di successo aumenta se più di un tipo di mutageni. Base mutageni analogico di diversa struttura, che vengono erroneamente incorporati nel genoma durante la replicazione sarà prevalentemente indurre risultato in uno specifico sottoinsieme di mutazioni nei successivi cicli di replica: trattamento ribavirina favorisce GtoA e mutazioni transizione CtoU 12; 5-azacitidina ha una distorsione simile, con la aggiunta di CtoG e trasversioni GtoC 13, 5-fluorouracile preferenzialmente induce transizioni Atog e UtoC 14. In alternativa, concentrazioni più elevate di Mg 2 + o Mn 2 + può essere integrato al mezzo per aumentare la frequenza complessiva mutazione del virus a RNA, senza il pregiudizio di cui sopra 12. A seconda del codone sequenze del virus &#39;, e il codone cambiamenti necessari per generare una variante fedeltà, alcune di queste condizioni favoriscono l&#39;emergere di questa variante rispetto agli altri. Per il poliovirus G64S maggiore fedeltà e virus Coxsackie A372V, ribavirina più facilmente selezionati per le varianti, perché il passaggio Atog richiesta presso il sito codone corrispondeva alle mutazioni prevalentemente generato da questa ribavirina. MOI vs dimensione della popolazione. In virologia, i protocolli per l&#39;infezione dei tessuti cultura prestare particolare attenzione alla molteplicità di infezione (MOI), per evitare l&#39;accumulo di particelle difettoso interferenti (basso MOI) o per promuovere ricombinazione tra virus (alto MOI), per esempio. Per selezionare gli eventi emergere oltre seriale passaging, è importante considerare anche la dimensione della popolazione virus. Dal momento che il mutante resistente si registri inizialmente a bassa frequenza, è meglio trasferire il maggior numero di abitanti il più possibile da un passaggio all&#39;altro (10 5 -10 6 virus, ad esempio) per evitare di perdere queste varianti emergenti, ad ogni passaggio. Scaling up la dimensione del bene o del matraccio (numero di cellule infette) può aiutare a minimizzare l&#39;aumento di MOI se questo è motivo di preoccupazione. D&#39;altra parte, per esperimenti in cui la sensibilità di un virus mutageno viene testato, a basso infection MOI è effettuata al fine di aumentare il numero di cicli di replica che si verificano durante l&#39;esperimento e per evitare salvataggio di genomi mutagenizzate by genomi di fitness più elevato attraverso complementazione in co-cellule infette. Questo è importante in quanto le mutazioni generate genomi progenie durante il primo turno di replica non sarà immediatamente rilevato. La maggior parte di questi RNA mutagenizzate saranno ancora confezionato in virione. E &#39;nel prossimo ciclo di infezione che le mutazioni letali presenti in questi genomi si tradurrà in un ciclo di replicazione interrotta, e la riduzione del titolo virus. Può essere necessario per consentire varie tornate di accumulo di mutazioni lordo di un effetto significativo di mutagenesi letale si osserva. Infine, se rispetto alla serie passaggio in presenza del mutageno, il virus titoli continuano a scendere fino ad estinzione, allora il ricercatore dovrebbe cercare passaging virus in quantità via via crescente del mutageno (a partire da una concentrazione molto bassa). L&#39;isolamento e la generazione del clone RNA mutageno resistente dal mutageno resistente popolazione RNA. Mutageni RNA introdurre molteplici mutazioni casuali ad ogni genoma, ma la selezione per la resistenza solo arricchire (e fix per sequenza consenso) la mutazione di resistenza. Per individuare questa mutazione, abbiamo sequenza della popolazione resistente mutageno (consenso della popolazione) e non i singoli virus. Quindi, il singolo, le mutazioni casuali generati dal mutageno non vengono rilevati nella sequenza, ma solo le mutazioni che si traducono in cambiamenti consenso seguito di selezione, si trovano. Nella nostra esperienza abbiamo solo identificare uno o due di tali modifiche apportate alla sequenza consenso. Una volta che la popolazione resistente mutageno è ottenuta e la mutazione di resistenza è identificato, è necessario generare un magazzino più puro di questa variante. Soprattutto, abbiamo descritto una procedura di purificazione targa. In alternativa, se il virus di interesse non produce placche facilmente identificabili, la variante desiderata può essere purifIED limitando la diluizione. Questo approccio è essenzialmente un 50 TCID in formato a 96 pozzetti, dove viene diluito lo stock del virus in modo tale che meno del 50% dei pozzi sono infetti. Utilizzando questa diluizione, lo stesso approccio di cui sopra è presa, in isolamento fino a 10 singole varianti e confermando le loro sequenze. Come accennato, nel migliore dei casi, un clone cDNA infettive del ceppo virale è disponibile. Isolamento della variante non sarebbe quindi necessario. Nella nostra esperienza, le varianti fedeltà sono il risultato di singole sostituzioni di aminoacidi e può quindi essere generati utilizzando semplici, kit di mutagenesi commercializzato come QuikChange (Agilent). Una opzione secondaria è quella di utilizzare un clone cDNA di un ceppo strettamente correlate. Tuttavia, se un ceppo correlata è utilizzato, consigliamo vivamente di utilizzare sia questo approccio e l&#39;isolamento del virus (ad esempio la purificazione della placca), perché abbiamo scoperto che la stessa mutazione fedeltà alterando su due virus strettamente correlati non sarà necessariamente lo stesso effetto. Fedeltà e la replica. Selezione di RNA varianti resistenti mutageno hanno portato l&#39;isolamento di entrambe le varianti superiori e inferiori fedeltà con caratteristiche di crescita che sono simili alle loro controparti di tipo selvatico 4,12,15. Attualmente, il legame tra tasso di attività della polimerasi e la fedeltà non è del tutto chiaro. Studi in vitro utilizzando biochimici purificato RNA polimerasi hanno mostrato che versioni successive hanno un tasso di fedeltà lavorazione più lenti, mentre le varianti più bassa fedeltà tendono ad avere una più rapida elaborazione 1-3,12. In coltura, queste differenze non sono di solito evidenti, il che suggerisce che la disponibilità di risorse, piuttosto che l&#39;attività cinetica intrinseca polimerasi, è il fattore limitante. Se la variante fedeltà replica con cinetica che non sono significativamente diversi da wild-type, poi un confronto tra le loro frequenze mutazione può essere fatto direttamente. Se un cambiamento molto significativo in cinetica replica esiste, allora i dati dovrebbero essere normalizzati per spiegare le differenze cinetiche, per esempio confrontando i virus che hanno subito lo stesso numero di cicli di replica. Nella nostra esperienza, sebbene non significative differenze in un unico passaggio-cinetica di crescita sono state osservate tra wild-type e le varianti ad alta fedeltà, abbiamo osservato che l&#39;alta fedeltà varianti costantemente titolo superiore (entro 1 log) rispetto al wild-type, ma fanno un po &#39;meno di RNA (entro dello stesso ordine di grandezza), inoltre suggerisce che il genoma producono contengono un minor numero di mutazioni e quindi sono più contagiose. Preparazione del campione e sequenziamento. Per tutte le misure di questi protocolli, è indispensabile che ad alta fedeltà, correzione di bozze enzimi vengono utilizzati per la PCR e RT-PCR per limitare l&#39;introduzione di ulteriori mutazioni, poiché non possono essere distinti da mutazioni biologicamente rilevanti. E &#39;fondamentale che le popolazioni di virus da confrontare sono stati preparati nelle stesse condizioni (passaggio storia, la cultura media dei tessuti, la temperatura, metodo di estrazione RNA, RT-PCR protocolli, ecc) È altresì importante garantire che il materiale di partenza era abbastanza ottenuto dalla estrazione di RNA in modo tale che una band forte è generato mediante RT-PCR. A 1 / 100 di diluizione del campione di RNA deve anche dare una rilevabile RT-PCR banda, indicando che il campione contiene un numero sufficiente di molecole di RNA per evitare distorsioni di rappresentanza (amplificazione del genoma stesso più volte). Dal momento che la frequenza di mutazione è una distribuzione, ci si aspetterebbe che i valori simili si ottengono indipendentemente dalle dimensioni della popolazione, a condizione che il pregiudizio di cui sopra non si sta verificando. Come mostra la figura 6 mostra, a 10 5 volte diluizione di uno stock del virus dà una frequenza di mutazione che non è significativamente diverso dal magazzino dei genitori. Fino a quando le condizioni ottimali per TopoTA clonazione si trovano, confermano la presenza di inserti in seguito ad un&#39;analisi blu / bianco, da colonia PCR prima sequenza. Come controllo per il rumore mutazione (mutazione introdotta mediante RT-PCR e sequenziamento), clone di un prodotto di PCR da un cuscinetto plasmide e la stessa sequenza virale / o clonare e sequenziare i prodotti RT-PCR di RNA in vitro trascritto corrispondente al genoma del virus (da consapevoli del fatto che diversi degli enzimi di trascrizione in vitro hanno tassi di errore diversi e non possono dare informazioni utili per l&#39;errore di fondo reale nella procedura). Alcune sequenze del virus può essere tossico per i batteri, quindi è importante verificare questo prima di decidere sulla regione del genoma virale ad essere sequenziato per la frequenza di mutazione. Nell&#39;analizzare sequenze ottenute da TopoTA, si noti che ogni clone dovrebbe contenere un solo inserimento / sequenza. Se un doppio picco si osserva, suggerendo una popolazione mista, è possibile che due colonie batteriche vicini sono stati selezionati. E &#39;anche possibile, anche se altamente improbabile date le basse frequenze di mutazione in replica batterica, che la mutazione è stata introdotta durante l&#39;amplificazione del plasmide nella coltura batterica. In p placcaurified popolazioni, un doppio picco può rappresentare placche si sovrappongono, o un virus che sta acquisendo una nuova mutazione o il ripristino di una mutazione nel corso dello sviluppo della placca. Siate coerenti e decidere se contare o meno contare queste mutazioni. Infine, tenere presente che le frequenze di mutazione usato qui sono valori relativi. Essi sono validi solo nel confronto tra popolazioni di virus coltivati ​​nelle stesse condizioni, e sequenziato più della stessa regione! Essi non devono essere presi come valori assoluti di tasso di mutazione, o la frequenza di mutazione del genoma nel suo complesso. Tuttavia, quando le condizioni sono controllate, che lo permettono riproducibili, il confronto quantitativo delle differenze nella distribuzione di mutazione e di frequenza.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> ribavirina </td><td> Sigma </td><td> R9644-10mg </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracile </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacitidina </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Blu tripano </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA clonazione kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> QuikChange mutagenesi kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Se un clone cDNA infettive è disponibile </td></tr><tr><td> 96-bene miniprep kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> O il software di allineamento altri </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Virus a RNA uso RNA polimerasi RNA dipendente di replicare i loro genomi. Il tasso di errore intrinseco elevato di questi enzimi è un grande contributo alla generazione di diversità demografica estrema che facilita l&#39;adattamento e l&#39;evoluzione del virus. Crescente evidenza mostra che i tassi di errore intrinseco, e le frequenze di mutazione risulta, di virus a RNA possono essere modulati da sottili cambiamenti di aminoacidi per la polimerasi virale. Anche se esistono test biochimici per alcuni polimerasi RNA virale che permettono una misura quantitativa della incorporazione fedeltà, qui descriviamo un metodo semplice per misurare le frequenze di mutazione del virus a RNA, che ha dimostrato di essere più precisi approcci biochimici per identificare le mutazioni alterano la fedeltà. L&#39;approccio utilizza le tradizionali tecniche di sequenziamento virologici e che possono essere eseguite nei laboratori di biologia più. Sulla base della nostra esperienza con un certo numero di virus diversi, abbiamo identificato i passaggi chiave che deve essere ottimizzato per aumentare la probabilità di isolare varianti fedeltà e la generazione di dati di significatività statistica. L&#39;isolamento e la caratterizzazione di mutazioni fedeltà alterare in grado di fornire nuove intuizioni nella struttura e la funzione della polimerasi 1-3. Inoltre, queste varianti fedeltà possono essere strumenti utili nella caratterizzazione dei meccanismi di adattamento e di evoluzione del virus 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Il presente articolo descrive i passaggi necessari per isolare e caratterizzare l&#39;RNA polimerasi varianti fedeltà dei virus a RNA e come utilizzare i dati di frequenza di mutazione per confermare le modifiche fedeltà in coltura.

Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

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Immunology and Infection

29.4K Views.  Institut Pasteur. Il presente articolo descrive i passaggi necessari per isolare e caratterizzare l'RNA polimerasi varianti fedeltà dei virus a RNA e come utilizzare i dati di frequenza di mutazione per confermare le modifiche fedeltà in coltura.