Ce travail a été soutenu par un financement de la recherche médicale et sanitaire subvention de la Ville de Paris, les Français nationaux ANR-09-JCJC-0118-1, et l&#39;ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Projet aucune. 242719.

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	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. 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R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Choix de la lignée cellulaire. L&#39;efficacité des analogues de base que l&#39;ARN mutagènes en corrélation avec leur absorption relative par différents types de cellules 11. Si la lignée cellulaire qui est normalement utilisé pour le passage du virus s&#39;avère être réfractaire à l&#39;absorption mutagène ou trop sensibles (toxicité cellulaire élevée), il peut être nécessaire d&#39;utiliser une autre lignée cellulaire qui répond à ces exigences et est toujours permissives à la réplication virale. Une fois que la variante la résistance mutagène est isolé, le reste de la caractérisation peut être réalisée dans l&#39;original, lignée cellulaire de choix. Dans notre expérience, les cellules HeLa facilement prendre jusqu&#39;à mutagène; cellules BHK nécessitent jusqu&#39;à 10 fois plus élevé et les concentrations de cellules Vero sont réfractaires à l&#39;absorption mutagène. Choix du mutagène. En essayant d&#39;isoler variantes fidélité par traitement mutagène, la probabilité de succès augmente si plus d&#39;un type d&#39;agent mutagène est utilisé. Base de mutagènes analogique de structure différente, qui sont incorporés dans les génomes tort lors de la réplication sera principalement induisent entraîner un sous-ensemble spécifique de mutations dans les cycles de réplication ultérieure: traitement ribavirine favorise GTOA de transition et de mutations CTOU 12; 5-azacytidine a un biais similaire, avec le Outre des CtoG et transversions GTOC 13; 5-fluorouracile préférentiellement induit des transitions et des ATOG UtoC 14. Alternativement, des concentrations plus élevées de Mg 2 + ou Mn 2 + peut être complétée au milieu pour augmenter la fréquence de mutation globale des virus à ARN, sans le biais décrits ci-dessus 12. Selon le codon séquences du virus, et les changements de codons nécessaires pour générer une variante fidélité, certaines de ces conditions seront favorables à l&#39;émergence de cette variante par rapport aux autres. Pour plus de fidélité le poliovirus et le virus Coxsackie G64S A372V, ribavirine plus facilement sélectionnés pour les variantes, car la transition ATOG requis sur le site codon correspondait à la prédominance des mutations générées par cette ribavirine. La taille de la population vs MOI. En virologie, les protocoles d&#39;infection culture de tissus accorder une attention particulière à la multiplicité d&#39;infection (MOI), pour éviter l&#39;accumulation de particules défectives interférentes (faible MOI) ou pour favoriser la recombinaison entre les virus (MOI élevé), pour par exemple. Pour sélectionner des événements de l&#39;émergence au cours de série repiquage, il est également important de considérer la taille des populations de virus. Depuis le mutant résistant existe d&#39;abord à basse fréquence, il est préférable de transférer une aussi grande taille de la population que possible d&#39;un passage à la suivante (10 5 -10 6 virus, par exemple) pour éviter de perdre ces variantes émergentes à chaque passage. Amplifier l&#39;importance de bien ou flacon (nombre de cellules infectées) peut aider à minimiser l&#39;augmentation de la MOI, si ce n&#39;est de préoccupation. D&#39;autre part, pour des expériences dans lesquelles la sensibilité d&#39;un virus à mutagène est actuellement testé, faible d&#39;infection MOI est effectuée afin d&#39;augmenter le nombre de cycles de réplication se produisent dans l&#39;expérience et d&#39;éviter le sauvetage des génomes mutagenèse par les génomes de fitness supérieur à travers complémentation en collaboration cellules infectées. Ceci est important car les mutations générées sur les génomes descendance durant le premier tour de la réplication ne sera pas immédiatement détecté. La plupart de ces ARNs mutagénisées sera toujours emballés dans des virions. C&#39;est dans le prochain cycle d&#39;infection qui mutations létales présents dans ces génomes se traduira par un cycle de réplication avorté, et la réduction du titre du virus. Il peut être nécessaire pour permettre plusieurs cycles d&#39;accumulation de mutations avant un effet significatif de la mutagenèse létale est observée. Enfin, si le passage sur la série, en présence du mutagène, les titres de virus continuent à baisser jusqu&#39;à l&#39;extinction, alors le chercheur devrait essayer de repiquage du virus dans progressivement des quantités croissantes d&#39;agent mutagène (à partir d&#39;une concentration très faible). L&#39;isolement et la génération du clone résistant à mutagène ARN à partir de l&#39;ARN mutagène résistant population. Mutagènes ARN d&#39;introduire de multiples mutations aléatoires à chaque génome, mais sélection pour la résistance ne enrichir (et fixer à la séquence consensus) la mutation de résistance. Pour identifier cette mutation, nous avons la séquence de la population résistante mutagène (consensus de la population) et non des virus individuels. Par conséquent, la seule, des mutations aléatoires créés par le mutagène ne sont pas détectés dans la séquence; que les mutations qui entraînent des changements consensus suivant la sélection, sont trouvés. Dans notre expérience, nous avons seulement identifier un ou deux changements tels séquence consensus. Une fois que la population résistante mutagène est obtenue et la mutation de résistance est identifié, il est nécessaire de générer un stock plus pure de cette variante. Ci-dessus, nous avons décrit une procédure de purification sur plaque. Alternativement, si le virus d&#39;intérêt ne produit pas de plaques facilement identifiables, la variante souhaitée peut être PurifIED en limitant la dilution. Cette approche est essentiellement un 50 DICT au format 96 puits, où le stock de virus est dilué de telle sorte que moins de 50% des puits sont contaminés. En utilisant cette dilution, la même approche que ci-dessus est prise, dans l&#39;isolement jusqu&#39;à 10 variantes individuelles et confirmant leurs séquences. Comme mentionné précédemment, dans le meilleur des cas, un clone d&#39;ADNc infectieux de la souche du virus est disponible. Isolement de la variante ne serait donc pas nécessaire. Dans notre expérience, la fidélité variantes sont le résultat de simples substitutions d&#39;acides aminés et peuvent ainsi être générés en utilisant de simples kits commercialisés tels que la mutagenèse QuikChange (Agilent). Une option secondaire est d&#39;utiliser un clone d&#39;ADNc d&#39;une souche étroitement liés. Cependant, si une souche apparentée est utilisé, nous recommandons fortement d&#39;utiliser à la fois cette approche et l&#39;isolement du virus (purification sur plaque, par exemple) parce que nous avons constaté que la même mutation altérant la fidélité de deux virus étroitement apparentés ne sera pas nécessairement le même effet. Fidelity et de réplication. Sélection de variants résistants mutagène ARN ont abouti à l&#39;isolement des deux variantes de fidélité supérieures et inférieures avec des caractéristiques de croissance qui sont semblables à leurs homologues de type sauvage 4,12,15. Actuellement, le lien entre les taux d&#39;activité de la polymérase et la fidélité n&#39;est pas entièrement comprise. In vitro, des études biochimiques utilisant l&#39;ARN polymérase purifiée ont montré que plus la fidélité variantes ont des taux de traitement plus lent, tandis que la baisse des variantes de fidélité ont tendance à avoir un traitement plus rapide 1-3,12. En culture de tissu, ces différences ne sont généralement pas évidente, ce qui suggère que la disponibilité des ressources, plutôt que de la cinétique intrinsèque de l&#39;activité polymérase, est l&#39;étape limitante. Si la variante la fidélité réplique avec une cinétique qui ne sont pas significativement différents de type sauvage, puis une comparaison de leurs fréquences de mutation peut être faite directement. Si un changement très important dans la cinétique de réplication existe, alors les données doivent être normalisées pour tenir compte des différences cinétiques, par exemple en comparant les virus qui ont subi le même nombre de cycles de réplication. Dans notre expérience, même si aucune différence significative dans une seule étape cinétique de croissance ont été observées entre le type sauvage et de haute fidélité de variantes, nous avons observé que plus la fidélité constamment variantes titre plus élevé (moins de 1 log) par rapport au type sauvage, mais ils font un peu moins d&#39;ARN (dans les du même ordre de grandeur), plus loin en suggérant que les génomes contiennent elles produisent moins de mutations et sont donc plus infectieux. La préparation des échantillons et le séquençage. Pour toutes les étapes de ces protocoles, il est impératif que haute-fidélité, la relecture des enzymes sont utilisées pour la PCR et RT-PCR afin de limiter l&#39;introduction de mutations supplémentaires, car ils ne peuvent pas être distingués des mutations biologiquement pertinentes. Il est essentiel que les populations de virus à comparer ont été préparés dans les mêmes conditions (historique des passages, milieu de culture tissulaire, la température, la méthode d&#39;extraction d&#39;ARN, RT-PCR des protocoles, etc) Il est également important de s&#39;assurer que suffisamment de matériel de départ a été obtenu à partir de l&#39;extraction d&#39;ARN tel que une forte bande est généré par RT-PCR. Une dilution 1 / 100 de l&#39;échantillon d&#39;ARN devrait également donner une détectable par RT-PCR bande, ce qui indique que l&#39;échantillon contient un nombre suffisant de molécules d&#39;ARN pour éviter les biais de représentation (amplification du génome mêmes à plusieurs reprises). Depuis la fréquence de mutation est une distribution, on pourrait s&#39;attendre à ce que des valeurs similaires seront obtenus indépendamment de la taille de la population, à condition que le biais susmentionnés ne se produit pas. Comme la figure 6 montre, à 10 5 fois la dilution d&#39;un stock de virus donne une fréquence de mutation qui n&#39;est pas significativement différente de la souche parentale. Jusque dans les conditions optimales pour le clonage TopoTA sont trouvés, de confirmer la présence d&#39;inserts après criblage bleu / blanc, par PCR sur colonie avant le séquençage. Comme un contrôle de bruit mutationnelle (mutations introduites par RT-PCR et séquençage), clone d&#39;un produit de PCR à partir d&#39;un plasmide portant les mêmes séquences virales et / ou le clone et la séquence de RT-PCR des produits ARN transcrit in vitro correspondant au génome du virus (soit conscients que différents dans les enzymes de transcription in vitro ont un taux d&#39;erreur différent et ne peuvent donner des informations utiles à l&#39;erreur de fond réel dans votre procédure). Certaines séquences de virus peuvent être toxiques pour les bactéries, il est donc important de vérifier cela avant de décider sur la région du génome viral à être séquencé pour la fréquence de mutation. En analysant les séquences obtenues par TopoTA, notez que chaque clone doit contenir qu&#39;une seule insertion / séquence. Si un double pic est observé, suggérant une population mixte, il est possible que les deux voisins colonies bactériennes ont été sélectionnés. Il est également possible, bien que hautement improbable étant donné les fréquences de mutation faible réplication bactérienne, que la mutation a été introduite lors de l&#39;amplification du plasmide dans la culture bactérienne. Dans la plaque purified populations, un double pic peut représenter des plaques qui se chevauchent, ou un virus qui est l&#39;acquisition d&#39;une nouvelle mutation ou de revenir d&#39;une mutation au cours du développement de plaque. Soyez cohérent et décider sur l&#39;opportunité de compter ou ne comptent pas ces mutations. Enfin, gardez à l&#39;esprit que les fréquences de mutation utilisés ici sont des valeurs relatives. Ils ne sont valables que dans la comparaison des populations de virus cultivés dans les mêmes conditions, et séquencé au cours de la même région! Ils ne devraient pas être prises comme des valeurs absolues des taux de mutation, ou la fréquence des mutations du génome dans son ensemble. Toutefois, lorsque les conditions sont contrôlées, elles ne permettent reproductibles, des comparaisons quantitatives des différences dans la répartition et la fréquence de mutation.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> ribavirine </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracile </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacytidine </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Le bleu trypan </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA kit de clonage </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> QuikChange mutagenèse kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Si un clone d&#39;ADNc infectieux est disponible </td></tr><tr><td> 96-ainsi Miniprep Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Ou d&#39;autres logiciels d&#39;alignement </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Les virus à ARN utilisent l&#39;ARN dépendante ARN polymérases à répliquer leurs génomes. Le taux d&#39;erreur intrinsèque élevée de ces enzymes est un contributeur important à la génération de la diversité de la population extrêmes qui facilite l&#39;adaptation du virus et son évolution. L&#39;augmentation de preuve montre que le taux d&#39;erreur intrinsèque, et les fréquences de mutation résultant, des virus à ARN peuvent être modulés par de subtiles changements d&#39;acides aminés de la polymérase virale. Bien que des dosages biochimiques existent pour certains ARN polymérases virales qui permettent une mesure quantitative de l&#39;incorporation de fidélité, ici nous décrire une méthode simple pour mesurer les fréquences de mutation des virus à ARN qui s&#39;est avéré être aussi précis que des approches biochimiques dans l&#39;identification des mutations altérant la fidélité. L&#39;approche utilise les techniques classiques virologiques et séquençage qui peuvent être effectuées dans les laboratoires les plus biologie. Basé sur notre expérience avec un certain nombre de virus différents, nous avons identifié les étapes clés qui doivent être optimisés pour augmenter la probabilité d&#39;isoler variantes fidélité et générer des données de la signification statistique. L&#39;isolement et la caractérisation de mutations altérant la fidélité peuvent fournir de nouveaux aperçus sur la structure et la fonction polymérase 1-3. En outre, ces variantes de fidélité peuvent être des outils utiles pour caractériser les mécanismes d&#39;adaptation du virus et l&#39;évolution 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Le présent article décrit les étapes nécessaires pour isoler et caractériser l&#39;ARN polymérase variantes fidélité des virus à ARN et la façon d&#39;utiliser les données de fréquence de mutation pour confirmer les modifications fidélité dans la culture de tissus.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

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29.4K vues.  Institut Pasteur. Le présent article décrit les étapes nécessaires pour isoler et caractériser l'ARN polymérase variantes fidélité des virus à ARN et la façon d'utiliser les données de fréquence de mutation pour confirmer les modifications fidélité dans la culture de tissus.