Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Medizin-und Gesundheitsforschung Zuschuss von der Stadt Paris, die Französisch Nationalen gewähren ANR-09-JCJC-0118-1, und der ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Projekt nicht unterstützt. 242719.

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	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. 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K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. 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R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. 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Wahl der Zell-Linie. Die Wirksamkeit von Basis-Analoga als RNA Mutagene korreliert mit ihrer relativen Aufnahme durch verschiedene Zelltypen 11. Wenn der Zelllinie, die normalerweise für Viruspassage dient erweist sich als refraktär Aufnahme oder zu empfindlich (hohe Zelltoxizität) mutagen, kann es notwendig sein, um eine andere Zelllinie, die diese Anforderungen erfüllt und ist immer noch permissive die virale Replikation verwenden. Sobald die mutagen Widerstand Variante isoliert ist, kann der Rest der Charakterisierung in der ursprünglichen, bevorzugte Zelllinie durchgeführt werden. In unserer Erfahrung, HeLa Zellen leicht nehmen mutagen; BHK-Zellen benötigen bis zu 10-fach höhere Konzentrationen und Vero-Zellen sind refraktär gegenüber mutagen Aufnahme. Wahl des mutagen. Bei dem Versuch, Treue-Varianten durch Mutagenbehandlung, die Wahrscheinlichkeit eines Erfolgs zu isolieren wird erhöht, wenn mehr als eine Art von Mutagen verwendet wird. Basis analoger Mutagene unterschiedlicher Struktur, die fälschlicherweise in Genome während der Replikation eingebaut wird überwiegend induzieren Ergebnis in eine bestimmte Untergruppe von Mutationen in den nachfolgenden Replikationszyklen: Ribavirin behandelt Gefälligkeiten GtoA und CtoU Übergang Mutationen 12; 5-Azacytidin hat eine ähnliche Tendenz, mit der Neben der CtoG und GtoC Transversionen 13; 5-Fluorouracil bevorzugt induziert Atog und UTOC Übergänge 14. Alternativ höhere Konzentrationen von Mg 2 + oder Mn 2 + können dem Medium ergänzt werden, um die gesamte Mutationsfrequenz von RNA-Viren, ohne die Vorspannung über 12 beschrieben zu erhöhen. Je nach Virus &quot;Codon-Sequenzen und die Codon-Änderungen erforderlich, um eine Treue-Variante zu erzeugen, einige von diesen Bedingungen wird die Entstehung dieser Variante gegenüber anderen zu bevorzugen. Für die höheren Treue Poliovirus G64S und Coxsackie Virus A372V, Ribavirin Behandlung am ehesten für die Varianten ausgewählt, weil die erforderliche Atog Übergang an die Codon-Website entsprach der Mutationen hauptsächlich durch dieses Ribavirin generiert. MOI vs Populationsgröße. In der Virologie, Pay-Protokolle für Gewebekultur Infektion besonderes Augenmerk auf die Multiplizität der Infektion (MOI), um die Ansammlung von defekten störende Partikel (low MOI) zu vermeiden oder Rekombination zwischen Viren zu fördern (hohes MOI), für Beispiel. So wählen Sie für die Entstehung Veranstaltungen über serielle Passage ist es auch wichtig, Viruspopulation Größe zu betrachten. Da die resistente Mutante existiert zunächst bei einer niedrigen Frequenz ist es am besten, einen möglichst großen Bevölkerungszahl wie möglich von einem Kanal übertragen auf die nächste (10 5 -10 6 Viren, z. B.) nicht zu verlieren diese neuen Varianten bei jeder Passage. Intensivierung der Größe von gut oder Kolben (Anzahl der Zellen infiziert) kann dazu beitragen, den Anstieg der MOI zu minimieren, wenn dies von Belang ist. Auf der anderen Seite, für Experimente, in denen die Empfindlichkeit eines Virus mutagen getestet wird, ist gering MOI Infektion durchgeführt, um die Anzahl der Replikationszyklen vorkommende in das Experiment zu erhöhen und die Rettung von mutagenisierten Genomen zu vermeiden durch eine höhere Fitness Genome durch Komplementation bei co-infizierten Zellen. Dies ist wichtig, da die Mutationen für die Nachkommenschaft Genome in der ersten Runde der Replikation generiert wird nicht sofort erkannt werden. Die meisten dieser mutagenisierten RNAs noch in Virion verpackt werden. Es ist in die nächste Runde der Infektion, die letalen Mutationen in diesen Genomen wird in einer abgebrochenen Replikationszyklus führen, und Reduzierung der Virustiter. Es kann notwendig sein, um für mehrere Runden der Akkumulation von Mutationen erlauben, bevor eine signifikante Wirkung von tödlichen Mutagenese zu beobachten ist. Schließlich, wenn mehr als die Passage-Serie in der Gegenwart von mutagen, die Virustiter bis Aussterben weiter abfällt, dann sollte der Forscher versuchen Passagierung Virus in allmählich steigenden Mengen von mutagen (ausgehend von einem sehr niedrigen Konzentrationen). Isolation und Generierung der RNA mutagen resistenten Klon aus der RNA mutagen-resistenten Population. RNA Mutagene einführen mehrere zufällige Mutationen zu jedem Genom, sondern Selektion auf Resistenz wird nur bereichern (und zu beheben, um Consensus-Sequenz) die Resistenz-Mutation. Zur Identifizierung dieser Mutation, wir Abfolge der Mutagen resistente Population (Konsens der Bevölkerung) und nicht die einzelnen Viren. Daher sind die einzigen, zufällige Mutationen durch die mutagen erstellt wurden, nicht in der Reihenfolge erkannt, nur die Mutationen, die im Konsens Veränderungen nach Auswahl, zu finden sind. In unserer Erfahrung sind wir nur zu identifizieren ein oder zwei solcher Konsensus-Sequenz ändert. Sobald die mutagen resistenten Population erhalten wird und die Resistenz-Mutation identifiziert ist, ist es notwendig, eine reine Bestandsaufnahme dieser Variante zu erzeugen. Oben beschrieben, haben wir eine Gedenktafel Reinigungsverfahren. Alternativ, wenn das Virus von Interesse führt nicht zu leicht identifizierbaren Plaques, können die gewünschte Variante purif werdenIED durch limitierende Verdünnung. Dieser Ansatz ist im Wesentlichen ein TCID 50 in 96-Well-Format, in denen das Virus Lager so verdünnt, dass weniger als 50% der Brunnen infiziert sind. Mit dieser Verdünnung wird der gleiche Ansatz wie oben genommen, bei der Isolierung bis zu 10 individuelle Varianten und bestätigt ihre Sequenzen. Wie bereits erwähnt, in den besten Fällen ist eine infektiöse cDNA Klon des Virus-Stamm zur Verfügung. Isolation der Variante wäre also nicht notwendig sein. Nach unserer Erfahrung sind Treue Varianten das Ergebnis der einzelnen Aminosäure-Substitutionen und kann somit unter Verwendung einfacher, kommerzialisiert Mutagenese-Kits wie Quikchange (Agilent) werden. Eine zweite Möglichkeit ist, einen cDNA-Klon von einem eng verwandten Stamm verwenden. Allerdings, wenn ein verwandter Stamm verwendet wird, empfiehlt sich die Verwendung sowohl diesen Ansatz und die Virusisolierung (zB Plaque-Reinigung), weil wir festgestellt, dass die gleiche Treue zu verändern Mutation auf beiden eng verwandten Viren werden nicht unbedingt die gleiche Wirkung haben. Fidelity und Replikation. Selektion von RNA mutagen resistente Varianten haben in der Isolation sowohl höhere als auch niedrigere Treue Varianten mit Wachstum, die ähnliche Merkmale auf ihre Wildtyp-Gegenstücke 4,12,15 sind geführt. Derzeit ist das Bindeglied zwischen Polymerase Erwerbsquoten und Treue nicht vollständig verstanden. In-vitro-biochemische Untersuchungen unter Verwendung von gereinigten RNA-Polymerase haben gezeigt, dass eine höhere Klangtreue Varianten langsamer Verarbeitungsgeschwindigkeit haben, während niedrigere Treue Varianten schnellere Verarbeitung 1-3,12 neigen. In Gewebekulturen, sind diese Unterschiede in der Regel nicht erkennbar, was darauf hindeutet, dass die Verfügbarkeit von Ressourcen, anstatt intrinsische Polymerase-Aktivität Kinetik ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Wenn die Treue Variante repliziert mit Kinetik, die sich nicht signifikant von Wildtyp-, dann einen Vergleich ihrer Mutation Frequenzen können direkt vorgenommen werden. Wenn eine sehr signifikante Veränderung bei der Replikation Kinetik vorhanden ist, dann sollten die Daten normalisiert, um zur kinetischen Unterschiede, zum Beispiel durch den Vergleich Viren, die die gleiche Anzahl von Replikationszyklen unterzogen haben Konto. In unserer Erfahrung, auch wenn keine signifikanten Unterschiede in einem Schritt Wachstumskinetik zwischen Wildtyp und High-Fidelity-Varianten beobachtet wurden, beobachteten wir, dass eine höhere Klangtreue Varianten durchweg höhere Titer (innerhalb von 1 log) im Vergleich zum Wildtyp, aber sie machen etwas weniger RNA (innerhalb der gleichen Größenordnung), weiter darauf hindeutet, dass die Genome sie produzieren weniger Mutationen enthalten und somit mehr infektiös. Die Probenaufbereitung und Sequenzierung. Für alle Schritte in dieser Protokolle ist es unerlässlich, dass High-Fidelity-, Korrektur-Enzymen für die PCR und RT-PCR dienen zur Begrenzung der Einführung zusätzlicher Mutationen, da sie nicht von biologisch relevanten Mutationen unterschieden werden. Es ist wichtig, dass das Virus Populationen verglichen werden unter den gleichen Bedingungen (Passage Geschichte, Gewebekulturmedium, Temperatur, RNA-Extraktions-Verfahren, RT-PCR-Protokolle, etc.) erstellt worden Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass genügend Ausgangsmaterial wurde erhalten aus der RNA-Extraktion, so dass eine starke Bande von RT-PCR generiert. A 1 / 100 Verdünnung der RNA-Probe sollte auch eine nachweisbare RT-PCR-Bande, was darauf hinweist, dass die Probe eine ausreichende Zahl von RNA-Molekülen auf Vertretung Bias zu vermeiden (Verstärkung der gleiche Genom mehrfach) enthält. Da Mutationsfrequenz ist eine Distribution, würde man erwarten, dass ähnliche Werte unabhängig von der Populationsgröße wird erreicht werden, sofern die genannten Bias nicht auftritt. Wie Abbildung 6 zeigt, gibt ein 10 5-fachen Verdünnung von einem Virus Lager eine Mutation Frequenz nicht wesentlich verschieden von den Elterntieren. Bis in die optimale Bedingungen für TopoTA Klonen gefunden werden, bestätigen das Vorhandensein von Einsätzen nach blau / weiß-Screening, durch Kolonie-PCR-Sequenzierung vor. Als Kontrolle für Mutationsanalysen Rauschen (Mutationen durch RT-PCR und Sequenzierung eingeführt), Klon eines PCR-Produkts aus einem Plasmid mit dem gleichen Virus-Sequenz und / oder geklont und sequenziert RT-PCR-Produkte von in vitro transkribierten RNA entsprechend Virusgenom (werden bewusst, dass verschiedene in-vitro-Transkription Enzyme haben unterschiedliche Fehlerraten und dürfen nicht geben wertvolle Informationen über die wahren Hintergründe Fehler in der Prozedur). Einige Viren-Sequenzen können giftig für Bakterien, so ist es wichtig, diese vor einer Entscheidung über die Region des viralen Genoms für Mutationsfrequenz sequenziert werden zu überprüfen. Bei der Analyse der Sequenzen durch TopoTA erhalten, beachten Sie, dass jeder Klon sollte nur ein insert / Sequenz enthalten. Wenn ein Doppel-Peak beobachtet, was auf eine gemischte Bevölkerung, ist es möglich, dass zwei benachbarte Bakterienkolonien ausgewählt wurden. Es ist auch möglich, obwohl sehr unwahrscheinlich, die niedrigen Frequenzen Mutation in bakteriellen Replikation gegeben, dass die Mutation während der Amplifikation von Plasmid wurde in der Bakterienkultur eingeführt. In Plaque purified Populationen kann eine Doppel-Spitze repräsentieren überlappende Plaques, oder ein Virus, dass der Erwerb einer neuen Mutation oder Zurücksetzen eine Mutation während der Plaque-Entwicklung. Seien Sie konsequent und entscheiden, ob zu zählen oder nicht zählen diese Mutationen. Schließlich, im Auge behalten, dass die Mutation verwendeten Frequenzen hier relative Werte. Sie gelten nur in den Vergleich Viruspopulationen unter den gleichen Bedingungen aufgewachsen, und sequenziert über den gleichen Bereich! Sie sollten nicht als absolute Werte der Mutationsrate, oder die Mutation Häufigkeit des Genoms als Ganzes betrachtet werden. Allerdings, wenn die Bedingungen geregelt sind, erlauben sie eine reproduzierbare, quantitative Vergleiche von Unterschieden in Mutation Verbreitung und Häufigkeit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Ribavirin </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluorouracil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-Azacytidin </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange Mutagenese-Kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Wenn ein cDNA infektiösen Klon ist verfügbar </td></tr><tr><td> 96-Well-Miniprep Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Oder andere Ausrichtung Software </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

RNA-Viren verwenden RNA abhängigen RNA-Polymerasen auf ihre Genome zu replizieren. Die eigensicheren hohen Fehlerquote dieser Enzyme ist ein großer Faktor für die Generation der extremen Vielfalt der Population, die auf Viren Anpassung und Entwicklung erleichtert. Zunehmende Anzeichen zeigt, dass die intrinsische Fehlerrate und die daraus resultierenden Mutation Frequenzen von RNA-Viren können moduliert werden durch subtile Aminosäure Änderungen an der viralen Polymerase. Obwohl biochemische Assays für einige virale RNA-Polymerasen, die quantitative Messung der Inkorporation Treue erlauben existieren, hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Messung der Mutation Frequenzen von RNA-Viren, die sich als so genau wie biochemische Ansätze bei der Identifizierung Treue zu verändern Mutationen hat. Der Ansatz nutzt konventionellen virologischen und Sequenzierung Techniken, die in den meisten biologischen Laboren durchgeführt werden können. Basierend auf unseren Erfahrungen mit einer Reihe von verschiedenen Viren, haben wir die wichtigsten Schritte, die optimiert, um die Wahrscheinlichkeit zu isolieren Treue Varianten und die Erzeugung der Daten der statistischen Signifikanz erhöhen müssen identifiziert werden. Die Isolierung und Charakterisierung der Treue zu verändern Mutationen können neue Einblicke in die Polymerase-Struktur und Funktion 3.1 bieten. Darüber hinaus können diese Treue Varianten nützliche Werkzeuge werden bei der Charakterisierung von Mechanismen der Virus-Anpassung und Weiterentwicklung 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Der vorliegende Artikel beschreibt die notwendigen Schritte zu isolieren und zu charakterisieren RNA-Polymerase Treue Varianten von RNA-Viren und wie man Mutationsfrequenz Daten verwenden, um Treue Veränderungen in der Gewebekultur zu bestätigen.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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