الكتاب أشكر فولتير Gungab للحصول على المساعدة في إعداد المخطوط. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من : المعاهد الوطنية للصحة (T32 GM008440 EJ لوكر ، R01 NS27713 ليونج WL ، P01 NS44155 ليونغ سو وWL ه) ، وR21 NS070153 سو لحاء ؛ والأمريكي جمعية القلب (AHA 10GRNT3130004 سو لحاء).

1. تطهير الدم من الأوعية الدموية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين ملغ / كلغ 100 مع زيلازين ملغ / كلغ مخففة في 10 مل المالحة 0.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم تأكيد التخدير التي لا استجابة لقرصة مخلب ، استخدم المقص لإجراء شق عبر الصدر مع مقص أقل بقليل من عملية سيفي الشكل ، وقطع طريق الحجاب الحاجز ، وتقطيعها وبين الجزء الظهري البطني من القفص الصدري لكشف التجويف الصدري. كشف القلب بنسبة تصل القص والطي المتاخمة جدار الصدر وآمنة مع مرقئ. فتح كيس التامور مع ملاقط لكشف القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة الارواء (100mmHg الضغط) متصلا الدافئة بالاضافة الى برنامج تلفزيوني الهيبارين (5 وحدة / مل) حل في حمام الماء الساخن عند 37 درجة مئوية ، وأنابيب بإبرة حادة قياس 22 في التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة في البطين الأيسر ، بالقرب من قمة القلب. قطع على الفور فتح الأذين الأيمن لتمكين تدفق الدم النظامية ويستمر حتى احمرار الدم طق إزالتها من التداول. </li></ol> 2. نضح من وكيل صب في نظام الأوعية الدموية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Microfil (تدفق التكنولوجيا ، وشركة كارفر ، ماجستير) في بروتوكول حل الصب الصانع : 5 مل من مزيج مخفف MV مع 4 مل من مجمع MV تصفيتها. إضافة 450μl (5 ٪) من محفز (MV كيل علاج). حل وقت العمل هو 20 دقيقة ، ولكن المزيج على الفور قبل استخدامه للتأكد من اللزوجة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الصب في حل كيل حقنة 10ML ، أرفق كليلة إبرة قياس 20 إلى المحقنة والإبرة مع ملء الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال ابرة في البطين الأيسر من خلال ثقب نفسها المستخدمة في التنظيف الدم. إبرة في مكان آمن مع المشبك مرقئ على القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن صب حل كيل ببطء في البطين الأيسر بحوالي 3 مل / دقيقة. الضغط الزائد قد يؤدي إلى تدفق غير صحيح من وكيل صب أو المحتملة تمزق السفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابحث عن علامات نضح ناجحة ، بما في ذلك : تصور من الزهرجي وكيل في الأوعية الدموية الأمعاء والكبد ، تلون أطرافه البعيدة ، والأنف وتلون اللسان. تعدل الإبرة إذا لزم الأمر لتحقيق التروية المناسبة. </li></ol> 3. جمع ومعالجة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ ومكانته في بارافورمالدهيد 4 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى من الدماغ عن طريق وضع بارافورمالدهيد مباشرة في EtOH تتركز بشكل متزايد في درجة حرارة الغرفة : 25 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 50 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 75 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 95 ٪ EtOH ، 2 أيام ، و 100 ٪ EtOH ، 2 أيام . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضيح حول أنسجة المخ الأوعية الدموية في الدماغ عن طريق غمر perfused في ساليسيلات الميثيل لمدة 2 يوما في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ولا يمكن تصوير الأوعية الدموية للدماغ unsectioned كامل مع توضيح الدماغ منغمسين في ساليسيلات الميثيل تحت المجهر تشريح (الشكل 1) (لايكا الثالث MZFL المجهر ، لايكا مايكروسيستمز ، بانوكبورن ، IL) أو brightfield المجهر (الشكل 2) (لايكا DM / LS ، لايكا مايكروسيستمز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reclarificationويمكن أن يتم إذا لم يتم تطهير الأنسجة تماما. من ساليسيلات الميثيل في الدماغ نقل على EtOH 95 ٪ لمدة 2 يوما ، و 100 ٪ للEtOH 2 أيام ، وساليسيلات الميثيل لمدة 2 ايام. </li></ol> 4. الجزئي أو التصوير المقطعي النسيجية إعداد التطبيق النسيج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ولا يمكن تصوير الدماغ باستخدام التصوير المقطعي الصغيرة مباشرة بعد توضيح أو بعد إعادة الترطيب (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد أنسجة المخ للتحليل النسيجي ، ترطيب الدماغ من خلال المسلسل EtOH المخفف : 100 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 95 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 75 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 50 ٪ EtOH ، 2 أيام ، 25 ٪ EtOH ، 2 أيام ؛ وتخزينها في برنامج تلفزيوني. ثم يمكن للدماغ أن يكون جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام إجراء القياسية. </li></ol> 5. ممثل النتائج بعد الصب الأوعية الدموية ، ويمكن أن ينظر إلى cerebrovasculature ظاهريا على سطح الدماغ (Fig.1A). يمكن للشجرة الأوعية الدموية داخل لحمة يمكن تصور التوضيح التالي (الشكل 1B). الهيكل التفصيلي الأوعية الدمويةولا يمكن تصوير وتحليل تحت المجهر brightfield (الشكل 2) ، وتشريح النطاق (الشكل 3) ، والجزئي مع الفحص بالاشعة المقطعية (الشكل 4). باستخدام المجهر brightfield ، يمكن أن ينظر إلى الأوعية الدموية في طائرات مختلفة دون التنسيق sectioning الدماغ (الشكل 2A) ، وكذلك microvessels الفردية على أعلى التكبير (الشكل 2B). تحت نطاق تشريح ، يمكن للمرء أن يرى الهيكل بأكمله الأوعية الدموية في طائرة واحدة محورية ، مما يتيح أفضل تصور للهيكل الأبعاد الثلاثة للcerebrovasculature (الشكل 3). يمكن أن الصور الملتقطة تحت المجهر تشريح تظهر كبيرة التشكل السفينة والأوعية الدموية في الدماغ كله ، ولكن تفتقر إلى التفاصيل المبينة في الصور التي التقطت مع المجهري brightfield (الشكل 2B). وقد سمحت لنا هذه التقنية للكشف عن السفن غير النظامية في نموذجنا BAVM التجريبية الماوس الكبار 2. ويبين الشكل 5 مثال على السفن غير النظامية نفسه الكشف عنها بواسطة الفحص بالاشعة المقطعية المتناهية الصغر (الشكل 5A) وbrightfield المجهر (الشكل 5B). معا ، وهذه البيانات يدل على أننا يمكن تحليل رانه نموذج واحد مع أدوات التصوير متعددة بعد الصب الأوعية الدموية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg" /> الشكل 1. الجامع مخ الفأر التالية الصب الأوعية الدموية. قبل (A) وبعد (B) ساليسيلات الميثيل توضيحا من المذيبات. ويمكن تصور أن تكون السفن بوضوح على سطح الدماغ (A) وحمة الداخلي التوضيح التالي (B). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg" /> الرقم 2 Brightfield المجهر. صور الأوعية الدموية في الدماغ توضيح مسبوكة. ولا يمكن تصوير الدماغ على طائرات مختلفة وعلى مستويات مختلفة التكبير. جدول المحامين 200μm (A) و50μm (B). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg" /> الشكل 3. تشريح المجهر في صورة تظهر 1X كله مخ الفأر cerebrovasculature الكبار من وجهة نظر الظهرية. &lt;img وALT = &quot;الشكل 4&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg&quot; /&gt; الشكل 4. الصغرى ، الفحص بالاشعة المقطعية صورة نفسه كاملة الكبار مخ الفأر هو مبين في الشكل (3) من وجهة نظر الظهرية. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg" /> الشكل 5. تطبيق طريقة الصب الأوعية الدموية للكشف عن تشوه شرياني والدماغ. أ) الصغرى ، الأشعة المقطعية للدماغ الوعائية محمل يظهر منطقة الموسع ، AVM السفن مثل عدم انتظام في النصف الأيمن من وجهة نظر البطني. يظهر صورة مكبرة من المنطقة (المربع الأبيض) على اليمين. ب) تصور السفن غير النظامية نفسه تحت المجهر على التكبير 50x brightfield. مقياس شريط 50 ميكرون.

<ol>
	<li>Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vivo+muCT+evaluation+of+neovascularisation+in+tissue+engineered+bone+constructs.">Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs.</a> Bone. 43, 195-202 (2008).</li><li>Walker, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriovenous+malformation+in+the+adult+mouse+brain+resembling+the+human+disease.">Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease.</a> Ann. Neurol. , (2011).</li><li>Iqbal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+novel+mono-+and+multivalent+VHH-fragments+and+their+application+for+molecular+imaging+of+brain+tumours.">Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).</li><li>Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+after+simultaneous+transplantation+with+neuro-epithelial+stem+cells+and+adjacent+mesenchymal+tissues+into+infarcted+rat.">Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat.</a> 145, 473-480 (2003).</li><li>Chugh, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cerebral+blood+volume+in+mouse+brain+regions+using+micro-computed+tomography.">Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography.</a> Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).</li><li>Marxen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med. Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. a. i. n. e. y., L, L., Silverman, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis:+vasa+vasorum+and+neovascularization+of+human+coronary+arteries.+A+possible+role+in+the+pathophysiology+of+atherosclerosis.">Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis.</a> N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).</li><li>Fossett, D. T., Caputy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Operative Neurosurgical Anatomy. , (2002).</li><li>Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+the+small+intestinal+mucosa+of+the+monkey+(Macaca+mulatta).">The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta).</a> Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).</li><li>Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+size+of+bronchopulmonary+anastomoses+in+sheep+lung.">Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).</li><li>Brady, J. M., Cutright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+of+measuring+blood+vessel+volume+in+bone+applied+to+the+mandible+and+humerus+of+the+rat.">A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat.</a> Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).</li><li>Evan, A. P., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferent+arterioles+in+the+cortex+of+the+rat+kidney.">Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney.</a> Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).</li><li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice.">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li></ol>

تمت الموافقة على إجراءات تجريبية لاستخدام الحيوانات المختبرية من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (UCSF).

نحن هنا التقرير وسيلة لصب cerebrovasculature الماوس الكبار التي قد تكون تصوير مع طرائق مختلفة. تطبيق هذا الأسلوب لهذا المرض BAVM نموذج يتيح تحليل 3D السفن غير النظامية. الدراسات المستقبلية المحتملة تشمل تقدير حجم الصور المقطعية الدقيقة والتحليل النسيجي للنسيج ، وتشخيص تطور المرض في الأوعية الدموية. واجهت مشاكل مشتركة واقتراحات ليس نضح كاملة من الأوعية الدموية في الدماغ يتحقق دائما. وجود ما يكفي من الضغط للوصول إلى الأوعية الدموية الطرفية دون تمزق الأذين الأيسر أو الأبهر هو التحدي. للتغلب على هذا ، والضغط ثابت من 100mmHg تقريبا. أيضا ، وضبط الموقف الإبرة لضمان تدفق مناسب من وكيل صب في الشريان الأورطي. من المهم أن لا تقتصر على الشرايين السباتية بحيث يمكن أن تصل إلى وكيل صب في الأوعية الدماغية. الحرجة الإجراءات التي ترتبط مع تحسن في إناء صغيرالانصهار هي : (1) تبادل المعلومات المناسبة من الدم من الأوعية الدموية ، (2) ترشيح وكيل الصب ، و (3) موضع إبرة الحقن خلال وكيل الصب. وينبغي الحرص على تجنب حقن صب وكيل في الأذين الأيسر والرئة. وقد perfused محققين آخرين بنجاح الماوس 3 و 4 cerebrovasculature الفئران بدون استخدام إجراءات إضافية. counterstained التحليل اليدوي للسفن perfused Microfil مع hemotoxylin أظهرت 93 ٪ نضح تجويف السفينة 5. تجاهل دائما نظيفة تماما أو أي أداة الذي يأتي في اتصال مع وكيل صب لأنها سوف تتبلمر بسرعة ، ولا يمكن أن تكون الأدوات المستخدمة في مواضيع متعددة. ويمكن توضيح الأنسجة المحيطة دماغ الفأر تكون صعبة. بعد الانغماس في ساليسيلات الميثيل ، قد يبدو ما زالت مبهمة الأنسجة ، مما يجعل من الصعب تصوير السفينة. وينبغي ضمان الجفاف سليم وتوضيح حل هذه المشكلة. وضع أنسجة المخ على الكرسي الهزاز خلال ليالي والكحول الميثيلويمكن تحسين العلاج alicylate توضيح الأنسجة. عيوب تقنية قيود هذا الأسلوب ما يلي : (1) من الضروري حقن صب وكيل حل مباشرة بعد خلطها لأنها سوف رشاقته بسرعة بعد إضافة الحافز ، (2) وكيل صب يملأ السفن الكبيرة تصرف بسهولة ، ولكنه لا ملء موثوق السفن الصغيرة ، مثل الشرايين (الأوعية المقاومة) والشعيرات الدموية (الأوعية المغذية) ، و (3) ليس هذا هو النقيض لأفضل ظليل للأشعة المقطعية الدقيقة والتصوير ، وعلى الرغم من أن بعض المجموعات تفضل Microfil عن التصوير المقطعي الصغيرة 1،6. ومع ذلك ، وفقا لاقتراحات المقترحة أعلاه ، بما في ذلك وضع الإبرة الصحيح ، موقف السفينة وضغط التروية ، لا يمكن تحقيق الصب كاملة من السفن الصغيرة. والقدرة على التكيف مع مختلف أدوات التحليل يجعل هذا العامل أداة قيمة لتحليل البنية الدماغية ، بما في ذلك تداول الشرايين والأوردة ، مع مختلفوجهات النظر. تطبيقات تقنية الاستفادة من هذا الأسلوب هو إمكاناتها تطبيق واسع النطاق. المدلى بها تملأ جميع السفن ، بما في ذلك الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية ، وجميع الأنسجة داخل الجسم ، بحيث يمكن تحليل هياكل الأوعية الدموية في الأجهزة متعددة من مختلف الأنواع. سابقا ، وقد استخدمت هذه الجماعات الأخرى نضح للسفن الكبيرة 8 7 و الصغيرة في الإنسان ، والقرد 9 ، 10 الغنم ، 4،11،12 الفئران ، والفأر 3،13. نعرض الآن أدلة على استخدام هذه التقنية في تحليل بنية microvessels في مخ الفأر ، في ولايات كل من سليم والمريضة 2. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حلول Microfil مع اللزوجة المختلفة المتاحة ليروي سفن من مختلف الأحجام والألوان المختلفة لتحسين التصور للسفن في الأجهزة المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون أحمر بسهولة في الدماغ حمة شاحب ، ويتناقض تماما مع الأصفرالأحمر الداكن عضلة القلب. وعلاوة على ذلك ، حيث أن المواد غير ظليل للأشعة ، ويمكن تصوير الأوعية الدموية الصغيرة مع الفحص بالاشعة المقطعية للحصول على صورة 3D للتدوير. ويمكن أيضا أن تستخدم في النسيج لأقسام البارافين والتحليل النسيجي بعد التي يجري تصويرها. اختتام ندلل هنا على بروتوكول لجعل المدلى بها الأوعية الدموية في الأوعية الدموية للدماغ الفأر الكبار ، والتي يمكن تكييفها باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات التحليل لدراسة البنية المورفولوجية للcerebrovasculature. قدمنا ​​أيضا أدلة لتطبيق هذا الأسلوب لنموذج الدولة BAVM المرض ، ويمثلها السفن ، غير منتظمة الشكل الموسع أن الدم الشرياني لتحويلة من التداولات وريدي. وهناك مجموعة متنوعة من الأساليب المتاحة الصب الأوعية الدموية. ويمكن استخدام بروتوكول بسيطة نقدمها هنا ليلقي الأوعية الدموية كوسيلة لفحص الأوعية الدموية للدماغ الفأر البالغين باستخدام طرق التصوير المختلفة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تلاحظ </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> FlowTech ، وشركة </td><td> MV130 </td><td> 4 الشهر الجرف الحياة </td></tr><tr><td> ساليسيلات الميثيل </td><td> فيشر العلمية </td><td> O3695 - 500 </td><td> لتوضيح الأنسجة </td></tr></tbody></table>

cerebrovascular casting of the adult mouse for 3d imaging and morphological analysis

الأوعية الدموية التصوير حاسما في التشخيص السريري وإدارة الأمراض القلبية الوعائية ، مثل تشوهات الشرايين والأوردة في المخ (BAVMs). النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة العلاجات الباثولوجيا السببية والمحتملة من الأمراض الدماغية الوعائية. تصوير الأوعية الدموية في الحيوانات الكبيرة سهلة نسبيا. ومع ذلك ، وتطوير أساليب التصوير السفينة من الفئران نماذج مرض الدماغ هو مرغوب فيه نظرا للتكلفة وتوافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا. تصوير الأوعية الدموية الدماغية الفئران الشجرة هو التحدي. في البشر والحيوانات الكبيرة ، المعيار الذهبي لتقييم angioarchitecture في الأوعية الكبيرة (تصرف) هو مستوى الأشعة السينية القسطرة النقيض القائم على تصوير الأوعية ، وهي طريقة غير مناسبة للقوارض صغيرة. في هذه المقالة ، نقدم طريقة الصب الدماغية التي تنتج هيكل عظمي دائمة من السرير والأوعية الدموية بأكملها ، بما في ذلك الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية والتي قد تكون تحليلها باستخدام العديد من دifferent الطرائق. يمكن الصب الكامل للmicrovessels من cerebrovasculature الماوس يكون صعبا ، ولكن يتم التصدي لهذه التحديات في هذا البروتوكول خطوة بخطوة. من خلال نضح intracardial المواد الصب الأوعية الدموية ، وجميع السفن مسبوكة من الجسم. ويمكن عندئذ الدماغ يمكن إزالتها وأوضح باستخدام المذيبات العضوية ساليسيلات الميثيل. ويمكن تصوير الأبعاد الثلاثة في الأوعية الدموية في الدماغ تصور ببساطة وغير مكلفة مع أي المجهر brightfield التقليدية أو مجهر تشريح. يمكن أيضا أن تكون مسبوكة cerebrovasculature تصوير وكميا باستخدام التصوير المقطعي الصغيرة (المتناهية الصغر CT) 1. بالإضافة إلى ذلك ، يجري تصويره بعد ، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ الدماغ مسبوكة في البارافين للتحليل النسيجي. الاستفادة من هذا الأسلوب الصب الأوعية الدموية بالمقارنة مع غيرها من التقنيات هو التكيف الواسع لأدوات تحليلية مختلفة ، بما في ذلك تحليل brightfield المجهرية ، الفحص بالاشعة المقطعية نظرا لcharac ظليل للأشعةteristic من المواد ، فضلا عن تحليل النسيجي والمناعى. وهذا يمكن أن الاستخدام الفعال للحفظ الأنسجة الحيوانية الاستخدام وتقليل التكاليف. لقد أظهرنا مؤخرا تطبيق هذه الطريقة لتصور الأوعية الدموية الشاذة في نموذج الفأر من BAVM الكبار على المستوى المجهري 2 ، ويقدم صورا إضافية للسفن التي تالف تصوير الاشعة المقطعية المتناهية الصغر. على الرغم من أن هذه الطريقة لها عيوبها ، وربما لا يكون مثاليا لجميع أنواع التحليلات ، بل هو بسيط وتقنية العملية التي يمكن تعلمها بسهولة وتطبيقها على نطاق واسع الصب الأوعية الدموية الأوعية الدموية في جميع أنحاء الجسم.

Watch this Scientific Journal Video about Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis at JoVE.com

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

في هذه المقالة ، نقدم بسيطة ، العملية لتقنية الصب الدماغية التي هي سهلة لتنفيذ ويمكن استخدامها لصورة شجرة والأوعية الدموية للدماغ الفأر الكبار.

صب الدماغية للماوس الكبار عن التصوير والتحليل الصرفي 3D

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

cerebrovascular-casting-adult-mouse-for-3d-imaging-morphological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K Views.  University of California, San Francisco. في هذه المقالة ، نقدم بسيطة ، العملية لتقنية الصب الدماغية التي هي سهلة لتنفيذ ويمكن استخدامها لصورة شجرة والأوعية الدموية للدماغ الفأر الكبار.

Video: Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

طرق لتعديل وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الكبار

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

المحفزات الخاصة بالقشرية البصرية التي تثير الأنماط المورفولوجية المحتملة

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

التقييم المورفولوجي والوظيفي لمناصات الشريط في مناطق تردد محددة من القوقعة الماوس

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Fluorescence Angiography for Evaluation of Aneurysm Perfusion and Parent Artery Patency in Rat and Rabbit Aneurysm Models

Brain aneurysm treatment focuses on achieving complete occlusion, as well as preserving blood flow in the parent artery. Fluorescein sodium and indocyanine green are used to enable the observation of blood flow and vessel perfusion status, respectively. The aim of this study is to apply FVA to verify real-time blood flow, vessel perfusion status and occlusion of aneurysms after induction of sidewall aneurysms in rabbits and rats, as well as to validate the procedure in these species.
Twenty sidewall aneurysms were created in 10 rabbits by suturing a decellularized arterial vessel pouch on the carotid artery of a donor rabbit. In addition, 48 microsurgical sidewall aneurysms were created in 48 rats. During follow-up at one month after creation, the parent artery/aneurysm complex was dissected and FVA was performed using an intravenous fluorescein (10%, 1 mL) injection via an ear vein catheterization in rabbits and a femoral vein catherization in rats. Aneurysms were then harvested, and patency was evaluated macroscopically.
Macroscopically, 14 out of 16 aneurysms in rabbits indicated no residual parent artery perfusion with totally occluded luminae, however 11 (79%) were detected by FVA. Four aneurysms were excluded due to technical problems. In rats, residual aneurysm perfusion was macroscopically observed in 25 out of 48 cases. Of the 23 without macroscopic evidence of perfusion, FVA confirmed the incidence of 22 aneurysms (96%). There were no adverse events associated with FVA. Fluorescein is easily applicable and no special equipment is needed. It is a safe and extremely effective method for evaluating parent artery integrity and aneurysm patency/residual perfusion in an experimental setting with rabbits and rats. FVA using fluorescein as a contrast agent appears to be effective in controlling patency of aneurysms and the underlying vessel and can even be adapted to bypass surgery.

We present a protocol to efficiently evaluate aneurysm perfusion and vessel patency of sidewall aneurysm in rats and rabbits, using fluorescein-based fluorescence video angiography (FVA). With a positive predictive value of 92.6%, it is a simple but very effective and economical method with no special equipment required.

تصوير الأوعية الفلورية لتقييم تمدد الأوعية الدموية وطب الشرايين الأم في نماذج تمدد الأوعية الدموية الفئران والأرانب

Brain aneurysm treatment focuses on achieving complete occlusion, as well as preserving blood flow in the parent artery. Fluorescein sodium and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...