저자는 원고의 준비와 지원 볼테르 Gungab 주셔서 감사합니다. 이 작품은의 보조금에 의해 일부 지원되었습니다 H. 스와로 국립 보건원 (T32 GM008440 WL 청년과 H. 스와로 EJ 워커, WL 영에 R01 NS27713, NS44155 P01)를, 그리고 R21 NS070153, 그리고 미국 심장 협회 (AHA H. 스와로 10GRNT3130004).

1. Vasculature에서 혈액을 지우기 <ol><li> 0.25 ML의 식염수에 희석 10 밀리그램 / kg xylazine 100 밀리그램 / kg 300ml의 intraperitoneal 주사하여 마우스를 마취. </li><li> 마취가 발자국 꼬집어없이 반응에 의해 확인되면 다이어프램 쪽을 통과해서 바로 xyphoid 과정을 아래에 가위와 가슴팍 절개를 만들기 위해 가위를 사용하여 흉강을 폭로 ribcage의 지느러미와 복부 세그먼트 사이 했네요. 흉골과 인접 가슴 벽을 접는하고 hemostat과 보안에 의해 마음을 쉽게받을 수 있습니다. 마음을 노출 핀셋으로 pericardial SAC를 엽니다. </li><li> PBS 플러스 헤파린 (5 단위 / ML) 37시 온수 욕조에서 솔루션 ° C 및 유출에 뭉툭한 22 게이지 바늘로 튜브.을 따뜻하게 연결 살수 펌프 (압력을 100mmHg)를 켜십시오 </li><li> 심장의 꼭대기 근처 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 즉시 전신 혈액 유출을 활성화 권리 아트리움을 열고 잘라 피를까지 내가 계속 홍조s의 순환에서 제거. </li></ol> 2. 혈관 계통에 캐스팅 에이전트의 재관류 <ol><li> 믹스 필터링 MV 화합물 4 ML과 함께 뮤직 비디오 희석제 5 ML : Microfil (흐름 테크 주식 회사 카버, MA) 제조 업체의 절차에 따라 주조 솔루션을 준비합니다. 촉매의 450μl를 (5 %) (MV 양생 에이전트) 추가합니다. 솔루션 작동 시간은 20 분,하지만 적절한 점도를 보장하기 위해 사용하기 전에 바로 섞는다. </li><li> 10ml의 주사기에 에이전트 솔루션을 주조 철회, 주사기에 뭉툭한 20 게이지 바늘을 첨부하고 솔루션 바늘을 입력합니다. </li><li> 혈액을 꼴이지에 사용된 것과 같은 구멍을 통해 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 심장에 hemostat 클램프와 장소에 보안 바늘. </li><li> 약 3 ML / 분 천천히 좌심실로 캐스팅 에이전트 솔루션을 주사. 초과 압력 주조 대리인 또는 잠재적인 선박 파열의 잘못된 흐름으로 이어질 수 있습니다. </li><li> 를 포함하여 성공적인 재관류의 흔적에 대한 봐요 : 주조의 시각화대장 및 간 vasculature, 말초 사지 변색, 그리고 코, 혀 변색의 ING 에이전트. 필요한 적절한 재관류를 달성하는 경우에는 주사를 정리하다. </li></ol> 3. 수집 및 조직의 처리 <ol><li> 4 박 4 % paraformaldehyde에 두뇌 및 장소를 제거 ° C. </li><li> 직접 상온에서 점점 더 집중 EtOH로 paraformaldehyde의 배치에 의해 머리를 탈수 : 25 % EtOH, 일일, 50% EtOH, 일일, 75% EtOH, 일일, 95% EtOH 2 일, 100 % EtOH 2 일 . </li><li> 상온에서 2 일간 메틸 살리실산의 perfused 머리를 immersing하여 혈관 주위 뇌 조직을 명확히하십시오. </li><li> 전체 unsectioned 명확히 두뇌의 Vasculature은 해부 현미경 (그림 1) (Leica MZFL III 현미경, Leica 마이크로 시스템즈, Bannockburn, IL) 또는 brightfield 현미경 (그림 2) (Leica DM / 아래 메틸 살리실산에 포장되어 두뇌와 몇 군데 수 있습니다 LS, Leica 마이크로 시스템즈). </li><li> Reclarification조직이 완전히 지워되지 않은 경우 수행할 수 있습니다. 메틸 살리실산, 전송 두뇌에서 2 일간 95 % EtOH로, 100 2 일간 %의 EtOH, 2 일간 메틸 살리실산. </li></ol> 4. 마이크로 - CT 영상이나 Histological 응용 조직 준비 <ol><li> 두뇌는 바로 (그림 4) 설명 후 또는 다시 수화 이후 마이크로 - CT를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. </li><li> ; 95% EtOH, 일일, 75% EtOH, 일일, 50% EtOH 2 일, 25% EtOH 2 일 백퍼센트 EtOH, 1 일 : histological 분석을위한 뇌 조직을 준비하려면, 직렬 희석 EtOH를 통해 머리를 rehydrate , PBS 및 저장합니다. 두뇌는 다음 표준 절차를 사용하여 파라핀에 박혀 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 혈관 캐스팅 후, cerebrovasculature은 뇌의 표면 (Fig.1A)에 macroscopically 볼 수 있습니다. 실질 내부 혈관 트리 (그림 1B를) 다음과 같은 시각 해명하실 수 있습니다. 자세한 혈관 구조몇 군데와 (그림 3) 범위를 해부하고, 마이크로 - CT 스캔 (그림 4), brightfield 현미경 (그림 2)에 따라 분석하실 수 있습니다. brightfield 현미경 사용 vasculature는 높은 배율 (그림 2B)에서 두뇌 (그림 2A)뿐만 아니라 개인 microvessels을 sectioning하지 않고 서로 다른 초점 비행기에서 볼 수 있습니다. 해부 현미경, 하나는 cerebrovasculature의 입체 구조 (그림 3) 더 나은 시각화를 허용 하나의 초점 비행기에서 전체 혈관 구조를 볼 수 있습니다. 해부 현미경으로 촬영한 이미지는 대형 선박 형태 및 전체 뇌 vasculature을 보여주지만, brightfield 현미경 (그림 2B)로 찍은 사진에 표시된 내용을 부족 수 있습니다. 이 기술은 우리가 실험 BAVM 성인 마우스 모델 2 불규칙 혈관을 감지할 수있었습니다. 그림 5는 마이크로 - CT 스캔 (그림의 5A)와 brightfield 현미경 (그림의 5B)에 의해 감지 같은 불규칙한 혈​​관의 예를 보여줍니다. 함께,이 데이터는 우리가 t을 분석할 수 있습니다 것을 보여줍니다혈관 캐스팅 후 여러 이미징 도구를 사용하여 그 같은 샘플. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg" /> 그림 1. 혈관 캐스트 다음 전체 마우스 뇌. 전 (A)와 용매 메틸 살리실산에 의해 (B) 허가 이후에. 선박은 뇌의 표면 (A)와 실질 다음과 같은 설명 절차 (B)로 명확하게 시각하실 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg" /> 명확히 혈관 casted 두뇌의 그림 2. Brightfield 현미경 이미지. 브레인 다양한 비행기에서 서로 다른 배율 수준에서 몇 군데하실 수 있습니다. 스케일 바 200μm (A) 및 50μm (B). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg" /> 그림 3. 지느러미보기에서 전체 성인 마우스 뇌 cerebrovasculature를 보여주는 1X에서 현미경 이미지를 분석 해 봅시다. &lt;IMG 고도 = &quot;그림 4&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg&quot;/&gt; 그림 4. 마이크로 - CT는 지느러미보기에서 그림 3에 표시된 동일한 전체 성인 마우스 두뇌의 이미지를 스캔. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg" /> 그림 5. 두뇌 arteriovenous보기 흉한 것을 감지 혈관 주조 방법의 응용 프로그램. A) 혈관 casted 두뇌의 마이크로 CT 촬영은 복부보기에서 오른쪽 반구의 확대, 불규칙 AVM 같은 선박의 영역을 보여줍니다. 지역의 확대 이미지 (화이트 박스)은 오른쪽에 표시됩니다. B) 같은 불규칙한 혈​​관는 50x 배율에서 brightfield 현미경 아래에서 시각. 스케일 바 50 μm의.

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실험 동물을 사용하는 실험 절차가 캘리포니아 대학, 샌프란 시스코 (UCSF)의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

우리는 여기서 다양한 modalities와 함께 몇 군데있을 수 있습니다 성인 마우스 cerebrovasculature의 캐스팅에 대한 방법을보고합니다. 질병 모델 BAVM이 방법의 적용이 불규칙 선박의 3D 분석을 수 있습니다. 향후 연구는 마이크로 - CT 이미지의 부량, 조직의 histological 분석 및 혈관 질병 진행의 진단을 포함합니다. 일반적인 문제가있어서 프로그램을 제안 두뇌 vasculature의 완전한 재관류 항상 달성되지 않습니다. 왼쪽 심방이나 대동맥을 rupturing없이 말초 혈관에 도달하기에 충분한 압력을 갖는 것은 도전입니다. 이것을 극복하기 위해 약 100mmHg의 일관된 압력을 적용합니다. 또한, 대동맥에 에이전트를 주조의 적절한 유출을 보장하기 위해 바늘 위치를 조정합니다. 캐스팅 에이전트가 두뇌 혈관에 도달할 수 있도록 경동맥 동맥이 제한하지 않는 것이 중요합니다. 당 향상 작은 용기와 연관 중요 절차융합은 다음과 같습니다 vasculature에서 혈액 (1) 적절한 삭제, 캐스팅 에이전트 (2) 여과 및 캐스팅 에이전트 주입시 (3) 주사 바늘을 배치. 관리는 좌심방과 폐를에 에이전트를 주조의 주입을 피하기 위해 이동해야합니다. 다른 조사가 성공적으로 추가 절차를 사용하지 않고 마우스 3 쥐 4 cerebrovasculature을 perfused있다. hemotoxylin이 93 % 선박 루멘 재관류 5 보였다와 Microfil perfused 선박의 수동 분석 counterstained. 항상 폐기 또는 완전히 신속하게 중합되며, 도구가 여러 과목 사용할 수 없습니다로 캐스팅 에이전트 접촉 어떤 도구를 청소하십시오. 주변 마우스 뇌 조직을 명확 도전하실 수 있습니다. 메틸 살리실산의 침수에 따라 조직은 여전히​​ 선박 이미징이 어렵게 불투명 나타날 수 있습니다. 적절한 탈수와 설명을 보장하는 것은이 문제를 해결한다. 알코올 및 메틸의 동안 로커에서 뇌 조직을 배치alicylate 치료는 조직 해명을 향상시킬 수 있습니다. 기술의 단점 이 기법의 한계는 다음과 같습니다 : (1) 그것은 바로 촉매가 추가 후 신속하게 진하게하므로 그것을 혼합 후 주조 에이전트 솔루션을 주입하는 것이 필요합니다, (2) 주조 에이전트 쉽게 대형 전도성 선박을 가득 채우고 있지만, 그것은하지 않습니다 안정 등 arterioles (저항 선박)과 모세 혈관 (영양 혈관)로 작은 혈관을 작성하며, 일부 단체가 마이크로 - CT 영상 1,6에 대한 Microfil을 선호하지만 (3) 그것은 마이크로 - CT 영상을위한 최고의 radiopaque 명암되지 않습니다. 그러나, 적절한 바늘 배치, 선박 위치 및 재관류 압력을 포함하여 위에 제안된 제안, 다음, 작은 혈관의 완전한 주조가 형성될 수 있습니다. 다양한 분석 도구에 대한 적응성 다양한으로이 에이전트 동맥과 정맥의 혈액 순환을 포함한 뇌혈관 구조를 분석하는 유용한 도구를 만드는관점. 기술의 응용 이 방법의 장점은 광범위한 응용 가능성이 있습니다. 캐스트는 동맥, 정맥, 그리고 신체 내에있는 모든 조직의 모세 혈관 포함한 모든 선박을 채우고, 다양한 종류의 여러 장기에 혈관 구조 분석 수 있도록. 이전에는 다른 그룹은 인간, 원숭이 9, 양 10, 쥐 4,11,12, 마우스 3,13 7 크고 작은 8 선박이 재관류를 사용했습니다. 우리는 지금 건강하고 병에 걸린 두 상태에서 마우스 두뇌 microvessels의 구조를 분석 2이 방법을 사용하는 증거를 보여줍니다. 또한, 여러 장기의 혈관의 시각화을 향상시키기 위해 다양한 크기와 다양한 색상의 혈관을 perfuse 사용 가능한 다양한 viscosities와 Microfil 해결책이 있습니다. 예를 들어, 빨간색은 잘 대조 쉽게 창백한 뇌 실질의 시각, 그리고 노란색 수 있습니다진한 빨간색 myocardium. 자료 radiopaque대로 또한, vasculature는 마이크로 - CT는 3 차원 rotatable 이미지를 얻기 위해 스캔 군데하실 수 있습니다. 조직도 몇 군데 거쳐 파라핀 섹션 및 histological 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 결론 우리는 cerebrovasculature의 형태학의 구조를 연구 분석 기법의 다양한 사용하여 적용할 수 있습니다 성인 마우스 뇌의 혈관의 혈관 캐스트를 만들려고 여기 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한 확대, 불규칙 모양의 선박에 의해 대표, BAVM 질환 상태의 모델이 방법의 응용에 대한 증거를 제공한 정맥 순환에 동맥에서 션트 혈액. 사용 가능한 혈관 주조 다양한 방법이 있습니다. 우리는 혈관 캐스트를 보시려면 여기를 제공하는 간단한 프로토콜은 다양한 이미징 modalities를 사용하여 성인 마우스 뇌의 vasculature을 검사하는 도구로 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> FlowTech 주식 회사 </td><td> MV130 </td><td> 사개월의 수명 </td></tr><tr><td> 메틸 살리실산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> O3695 - 500 </td><td> 조직을 명확히하기 위해 </td></tr></tbody></table>

cerebrovascular casting of the adult mouse for 3d imaging and morphological analysis

혈관 영상은 두뇌 arteriovenous 기형 (BAVMs)와 같은 뇌혈관 질환의 임상 진단 및 관리에 중요합니다. 동물 모델은 뇌혈관 질환의 etiopathology 및 잠재적인 치료를 공부를 위해 필요합니다. 큰 동물 이미징 vasculature은 비교적 간단합니다. 그러나, murine 뇌 질환 모델 개발 선박 이미징 방법으로 인해 유전자 - 수정된 마우스 라인의 비용 및 가용성하는 것이 바람직하다. 이미징 murine 대뇌 혈관 나무는 도전입니다. 인간과 큰 동물 macrovascular에서 angioarchitecture을 평가하기위한 황금 표준 (전도성) 수준은 x - 선 카테터 대비 기반 혈관 조영술, 작은 설치류에 적합하지하는 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 많은 D를 사용하여 분석 수 있습니다 동맥, 정맥, 모세 혈관 및 포함 전체 혈관 침대의 내구성 뼈대를 생성 뇌혈관 주조하는 방법을 제시ifferent modalities. 마우스 cerebrovasculature의 microvessels의 완벽한 캐스팅이 어려울 수 있지만, 이러한 도전이 단계별로 프로토콜에서 해결됩니다. 혈관 주조 재료의 intracardial 재관류를 통해 신체의 모든 혈관이 casted 있습니다. 뇌는 그런 다음 제거하고 유기 용매 메틸 살리실산을 사용하여 명확히 수 있습니다. 뇌 혈관의 입체 영상은 어떤 종래의 brightfield 현미경 또는 해부 현미경으로 간단하고 저렴하게 시각하실 수 있습니다. casted cerebrovasculature도 몇 군데와 마이크로 계산된 tomography (마이크로 - CT) 1을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 또한, 몇 군데 후에, casted 두뇌는 histological 분석을 위해 파라핀에 박혀 수 있습니다. 다른 기술에 비해이 혈관 주조 방법의 이점은 brightfield 현미경 분석을 포함하여, 다양한 분석 도구의 광범위한 적응이다, CT 인해 radiopaque의 charac로 검색자료뿐만 아니라 histological 및 immunohistochemical 분석 teristic. 조직이 효율적으로 사용 동물 사용을 저장하고 비용을 줄일 수 있습니다. 우리는 최근 미세한 수준 2 성인 BAVM의 마우스 모델에서 불규칙 혈관을 시각화하고, 마이크로 - CT 촬영에 의해 몇 군데 잘못된 혈관의 추가 이미지를 제공하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 증명하고있다. 이 방법은 단점을 가지고 있으며, 모든 종류의 분석에 적합하지 않을 수 있습니다지만, 쉽게 배운 널리 체내 혈관의 혈관 캐스팅에 적용할 수있는 간단하고 실용적인 기술입니다.

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Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

이 문서에서는, 우리는 수행하기 쉽고 이미지가 성인 마우스 뇌의 혈관 트리를 활용할 수 뇌혈관 캐스팅에 대한 간단한 실용적인 기술을 제시한다.

3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.5K 조회수.  University of California, San Francisco. 이 문서에서는, 우리는 수행하기 쉽고 이미지가 성인 마우스 뇌의 혈관 트리를 활용할 수 뇌혈관 캐스팅에 대한 간단한 실용적인 기술을 제시한다.

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Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

인식에 대한 감정의 혼란 효과의 두뇌 이미징 조사

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

연구

신경과학

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

자극 특이적 피질 시각적 자극 잠재적 인 형태 학적 패턴을 불러 일으켰다

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...