המחברים מודים וולטייר Gungab לסיוע בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות: המכון הלאומי לבריאות (T32 GM008440 אל EJ ווקר, R01 NS27713 אל WL יאנג, P01 NS44155 אל WL צעירים וה &#39;סו), וכן R21 NS070153 ל ח סו וכן האמריקאי Heart Association (AHA 10GRNT3130004 ל ח סו).

1. ניקוי דם מן vasculature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בזריקה intraperitoneal של קטמין מ&quot;ג / ק&quot;ג עם 100 xylazine מ&quot;ג / ק&quot;ג 10 בדילול מלא מלוחים 0.25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה אושרה על ידי תשובה לצבוט כף יד, שימוש במספריים לעשות חתך לרוחב החזה עם מספריים, ממש מתחת תהליך xyphoid, לחתוך דרך הסרעפת, ולחתוך בין קטע הגבי ו הגחון של בית החזה כדי לחשוף חלל בית החזה. לחשוף לב על ידי קיפול עד עצם החזה והחזה סמוך ובטוח עם hemostat. פתח את שק קרום הלב עם פינצטה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה זלוף (100mmHg לחץ) מחובר חם PBS בתוספת הפרין (5 יחידות / מ&quot;ל) פתרון באמבט מים חמים על 37 מעלות צלזיוס, צינורות עם מחט 22 קהה מד על יצוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי, קרוב לשיא של הלב. מיד לחתוך לפתוח את אטריום הזכות לאפשר יצוא דם מערכתית להמשיך שטיפה עד דם אניs הוסר מן המחזור. </li></ol> 2. זלוף של סוכן יציקה לתוך מערכת כלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Microfil (תזרים טק, Inc קארבר, MA) פתרון הליהוק לכל פרוטוקול של היצרן: מערבבים 5 מ&quot;ל של diluent MV עם 4 מ&quot;ל של המתחם MV מסונן. הוסף 450μl (5%) של זרז (סוכן MV ריפוי). זמן הפתרון הוא עובד 20 דקות, אבל לערבב מיד לפני השימוש כדי להבטיח צמיגות תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכה הליהוק פתרון סוכן לתוך מזרק 10 מ&quot;ל, לצרף מחט קהה 20 לאמוד את המזרק ומלא מחט עם פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט לתוך החדר השמאלי דרך אותו חור המשמש הסמקה הדם. מחט Secure למקום עם מהדק hemostat על הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק סוכן פתרון הליהוק לאט לתוך החדר השמאלי על כ 3 מ&quot;ל / דקה. לחץ עודף עלול להוביל זרימה נכונה של סוכן יציקה או קרע כלי פוטנציאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראה סימנים של זלוף מוצלח, כולל: ויזואליזציה של השחקניםing סוכן vasculature המעי והכבד, שינוי צבע האיבר הדיסטלי, ואת האף ושינויי צבע הלשון. להסתגל מחט ואם יש צורך להשיג זלוף תקין. </li></ol> 3. איסוף ועיבוד של רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח ומכניסים paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים המוח על ידי הנחת מן paraformaldehyde ישירות EtOH מרוכז יותר ויותר בטמפרטורת החדר: 25% EtOH, 1 יום, 50% EtOH, 1 יום, 75% EtOH, 1 יום, 95% EtOH, 2 ימים, ו -100% EtOH, 2 ימים . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את רקמת המוח סביב כלי הדם ידי טבילה המוח perfused ב salicylate מתיל עבור 2 ימים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכלי הדם של המוח כולו הבהיר unsectioned ניתן הדמיה עם המוח שקוע salicylate מתיל תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1) (לייקה MZFL מיקרוסקופ השלישי, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) או מיקרוסקופ brightfield (איור 2) (לייקה DM / LS, Leica Microsystems). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reclarificationניתן לעשות זאת אם הרקמה לא מנוקה לחלוטין. מ סליצילט המוח מתיל העברה, כדי EtOH 95% 2 ימים, 100 EtOH% עבור 2 ימים, salicylate מתיל עבור 2 ימים. </li></ol> 4. Micro-CT או הדמיה הכנה היסטולוגית Application-רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח יכול להיות צילמו באמצעות מיקרו-CT מיד לאחר הבהרה או לאחר הידרציה מחדש (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את רקמת המוח לניתוח היסטולוגית, רעננותם המוח דרך EtOH בדילול סידורי: 100% EtOH, 1 יום, 95% EtOH, 1 יום, 75% EtOH, 1 יום, 50% EtOH, 2 ימים, 25% EtOH, 2 ימים וכן חנות PBS. המוח יכול להיות מוטבע פרפין באמצעות הליך רגיל. </li></ol> 5. נציג תוצאות בעקבות הליהוק וסקולרית, cerebrovasculature ניתן לראות macroscopically על פני המוח (Fig.1A). העץ כלי דם בתוך parenchyma ניתן הבהרה בעקבות דמיינו (איור 1B). מבנה כלי הדם מפורטניתן הדמיה וניתח תחת מיקרוסקופ brightfield (איור 2), לנתח היקף (איור 3), ועם מיקרו סריקת CT (איור 4). באמצעות מיקרוסקופ brightfield, vasculature ניתן לראות מטוסים מוקד שונים ללא חתך את המוח (איור 2 א) וכן microvessels הפרט בהגדלה גבוהה יותר (איור 2 ב). תחת בהיקף לנתח, אפשר לראות את מבנה כלי הדם כולה במישור מיקוד אחת, דבר המאפשר הדמיה טובה יותר של מבנה תלת מימדי של cerebrovasculature (איור 3). תמונות שצולמו במיקרוסקופ יכול להראות לנתח מורפולוגיה כלי שיט גדולים vasculature המוח כולו, אבל חוסר הפרטים המוצגים בתמונות שצולמו במיקרוסקופ brightfield (איור 2 ב). טכניקה זו אפשרה לנו לזהות כלי סדיר במודל ניסיוני מבוגר שלנו עכבר BAVM 2. איור 5 מציג דוגמה של כלי סדיר באותו זוהה על ידי מיקרו סריקת CT (איור 5 א) ו - מיקרוסקופ brightfield (איור 5 ב). יחד, נתונים אלה מראים כי אנו יכולים לנתח tהוא מדגם זהה עם כלי הדמיה מרובים לאחר הליהוק של כלי הדם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg" /> באיור 1. במוח העכבר שלמים הבאים הליהוק כלי הדם. לפני (א) ולאחר בירור (ב &#39;) על ידי salicylate מתיל ממס. כלי ניתן דמיינו בבירור על פני השטח המוח (א) ו בהליך בירור parenchyma הבאים (B). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg" /> 2. איור מיקרוסקופ brightfield תמונות של המוח הבהיר casted וסקולרית. המוח ניתן הדמיה על מטוסים שונים ברמות הגדלה שונות. סולם בר 200μm (א) ו 50μm (B). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg" /> באיור 3. הביתור תמונת מיקרוסקופ על 1x מראה מבוגר כל עכבר cerebrovasculature המוח מתצוגה הגבי. &lt;img alt = &quot;איור 4&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg&quot; /&gt; איור 4. Micro-CT סריקת תמונה של המוח המבוגר אותו כל עכבר שמוצג באיור 3 מתצוגה הגבי. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg" /> איור 5. היישום של שיטת הליהוק כלי הדם לזהות מום arteriovenous המוח. א) Micro-סריקת CT של המוח casted כלי הדם מראה מוגדל של האזור, AVM, כמו כלי סדירה האונה הימנית מתצוגה הגחון. תמונה מוגדלת של האזור (קופסה לבנה) מוצגת בצד ימין. ב) כלי סדיר דמיינו אותו תחת מיקרוסקופ brightfield בהגדלה 50x. סולם בר 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vivo+muCT+evaluation+of+neovascularisation+in+tissue+engineered+bone+constructs.">Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs.</a> Bone. 43, 195-202 (2008).</li><li>Walker, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriovenous+malformation+in+the+adult+mouse+brain+resembling+the+human+disease.">Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease.</a> Ann. Neurol. , (2011).</li><li>Iqbal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+novel+mono-+and+multivalent+VHH-fragments+and+their+application+for+molecular+imaging+of+brain+tumours.">Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).</li><li>Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+after+simultaneous+transplantation+with+neuro-epithelial+stem+cells+and+adjacent+mesenchymal+tissues+into+infarcted+rat.">Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat.</a> 145, 473-480 (2003).</li><li>Chugh, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cerebral+blood+volume+in+mouse+brain+regions+using+micro-computed+tomography.">Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography.</a> Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).</li><li>Marxen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med. Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. a. i. n. e. y., L, L., Silverman, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis:+vasa+vasorum+and+neovascularization+of+human+coronary+arteries.+A+possible+role+in+the+pathophysiology+of+atherosclerosis.">Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis.</a> N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).</li><li>Fossett, D. T., Caputy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Operative Neurosurgical Anatomy. , (2002).</li><li>Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+architecture+of+the+small+intestinal+mucosa+of+the+monkey+(Macaca+mulatta).">The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta).</a> Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).</li><li>Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+size+of+bronchopulmonary+anastomoses+in+sheep+lung.">Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).</li><li>Brady, J. M., Cutright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+of+measuring+blood+vessel+volume+in+bone+applied+to+the+mandible+and+humerus+of+the+rat.">A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat.</a> Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).</li><li>Evan, A. P., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferent+arterioles+in+the+cortex+of+the+rat+kidney.">Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney.</a> Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).</li><li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice.">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li></ol>

הפרוצדורות לשימוש בחיות מעבדה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש מאוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (UCSF).

אנו מדווחים כאן שיטה ליציקת cerebrovasculature של עכבר בוגר שעשויים להיות צילמו עם שיטות שונות. יישום של שיטה זו על BAVM המודל מאפשר ניתוח 3D מחלה של כלי סדיר. מחקרים עתידיים אפשריים כוללים כימות של מיקרו-CT תמונות, ניתוח היסטולוגית של רקמה, ואבחון של התקדמות מחלת כלי דם. בעיות נפוצות נתקל והצעות זלוף מלאה של כלי הדם במוח לא תמיד מושגת. לאחר לחץ מספיק כדי להגיע לכלי הדם דיסטלי ללא פקיעת אבי העורקים אטריום שמאלה או אתגר. כדי להתגבר על זה, להפעיל לחץ עקבי של כ 100mmHg. כמו כן, להתאים את מיקום המחט על מנת להבטיח יצוא מתאים הליהוק של סוכן אל תוך אבי העורקים. חשוב עורקי הראש אינן מוגבלות כל כך הסוכן הליהוק יכול להגיע כלי המוח. נהלים קריטי כי לתאם עם כלי קטן משופרת לכלהיתוך הם: (1) ניקוי נאות של הדם בכלי הדם מתוך: (2) סינון של הסוכן הליהוק; ו (3) מיקום המחט בזמן זריקה למלהק. יש להקפיד להימנע הזרקת הליהוק סוכן אל המבואה ריאה שמאל. חוקרים אחרים perfused בהצלחה העכבר 3 ו -4 cerebrovasculature עכברוש ללא שימוש נהלים נוספים. ניתוח ידניים כלי perfused Microfil counterstained עם hemotoxylin הראה 93 כלי% זלוף לומן 5. תמיד להתעלם לחלוטין או לנקות כל כלי בא במגע עם סוכן הליהוק, כפי שיופיע לפלמר במהירות, וכלים לא יכולה לשמש בנושאים רבים. הבהרה של הרקמה הסובבת במוח העכבר יכול להיות מאתגר. לאחר טבילה salicylate מתיל, הרקמה עדיין עשויים להיראות אטום, מה שהופך הדמיה כלי הקשה. הבטחת התייבשות בירור ראוי וצריך לפתור את הבעיה הזו. הצבת ברקמת המוח על כיסא נדנדה במהלך אלכוהול מתיל sהטיפול יכול לשפר alicylate הבהרה רקמות. החסרונות של טכניקת המגבלות של טכניקה זו כוללים: (1) יש צורך להזריק את הפתרון למלהק מיד לאחר ערבוב זה כמו שזה יהיה לעבות במהירות לאחר זרז נוסף, (2) סוכן הליהוק ממלא כלי מוליכות גדולים בקלות, אבל זה לא למלא כלי אמין יותר, כגון arterioles (כלי התנגדות) נימים (כלי התזונתי); ו (3) זה לא בניגוד radiopaque הטוב ביותר עבור מיקרו CT הדמיה, למרות קבוצות שמעדיפים Microfil עבור מיקרו CT הדמיה 1,6. עם זאת, בעקבות הצעות המוצע לעיל, כולל מיקום המחט תקין, עמדה הספינה ולחץ זלוף, יציקה מלאה של כלי קטן יכולה להיות מושגת. הסתגלות כלי ניתוח שונים עושה את זה סוכן כלי חשוב לניתוח מבנה מוחי, כולל במחזור עורקי וורידי, עם שונותפרספקטיבות. יישומים של טכניקת היתרון של שיטה זו הוא פוטנציאל היישום הרחב. צוות השחקנים ממלא את כל הכלים, כולל עורקים, ורידים, נימים של רקמה בתוך כל הגוף, כך מבנים כלי דם באיברים שונים של מינים שונים ניתן לנתח. בעבר, קבוצות אחרות השתמשו זלוף עבור 8 כלי גדול 7 וקטנים אדם, קוף 9, 10 כבשים, חולדה 4,11,12, ועכבר 3,13. אנו מציגים כעת עדות באמצעות טכניקה זו בניתוח מבנה microvessels במוח העכבר, במדינות שניהם בריאים וחולים 2. בנוסף, ישנם פתרונות Microfil עם viscosities שונים זמינים perfuse כלי בגדלים שונים וצבעים שונים על מנת לשפר את ההדמיה של כלי לאיברים שונים. לדוגמה, אדום ניתן דמיינו בקלות parenchyma המוח חיוור, צהוב ניגודים היטב עםאדום כהה שריר הלב. יתר על כן, החומר הוא radiopaque, vasculature ניתן הדמיה עם מיקרו-CT סריקה כדי לקבל תמונה rotatable 3D. הרקמה יכול לשמש גם עבור חלקים פרפין וניתוח היסטולוגית לאחר הדמיה. מסקנה אנו מדגימים כאן פרוטוקול לעשות יצוק כלי הדם של כלי הדם של המוח עכבר מבוגר, אשר ניתן להתאים באמצעות מגוון של טכניקות ניתוח כדי ללמוד את המבנה המורפולוגי של cerebrovasculature. יש לנו גם סיפק עדויות ליישום שיטה זו מודל של המדינה המחלה BAVM, המיוצג על ידי כלי מוגדל צורה אסימטרית כי המחלף דם עורקי וורידי תפוצה. יש מגוון של שיטות הליהוק וסקולרית זמין. פרוטוקול פשוט אנו מספקים כאן בגבס כלי הדם עשויים לשמש ככלי לבחון את כלי הדם של המוח המבוגר העכבר באמצעות שיטות הדמיה שונות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> FlowTech, Inc </td><td> MV130 </td><td> 4 חודשים חיי מדף </td></tr><tr><td> מתיל Salicylate </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> O3695-500 </td><td> כדי להבהיר רקמה </td></tr></tbody></table>

cerebrovascular casting of the adult mouse for 3d imaging and morphological analysis

דם הדמיה היא קריטית באבחון וניהול קליניים של מחלות כלי דם במוח, כגון מומים במוח arteriovenous (BAVMs). במודלים של בעלי חיים נחוצים לחקר טיפולים etiopathology ואת הפוטנציאל של מחלות כלי דם במוח. דימות vasculature בבעלי חיים גדולים יחסית קל. עם זאת, בפיתוח שיטות הדמיה של כלי מודלים המחלה Murine המוח רצוי בשל העלות והזמינות של גנטית שונה קווי העכבר. הדמיה העץ Murine כלי הדם המוחיים היא אתגר. בבני אדם ובבעלי חיים גדולים יותר, תקן הזהב להערכת angioarchitecture ב macrovascular (מוליכות) רמה רנטגן קטטר בניגוד מבוססי אנגיוגרפיה, שיטה לא מתאים מכרסמים קטנים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה של ​​יציקת מוחי שמייצר שלד עמיד המיטה כלי דם, כולל עורקים, ורידים, נימים, כי יכול להיות מנותח באמצעות d רביםifferent לאופנים. הליהוק השלם של microvessels cerebrovasculature של העכבר יכול להיות קשה, אך אתגרים אלה מופנים בפרוטוקול צעד אחר צעד זה. באמצעות זלוף intracardial החומר הליהוק כלי הדם, כלי כל הגוף הם casted. המוח לאחר מכן ניתן להסיר הבהיר באמצעות salicylate מתיל ממס אורגני. שלושה ממדי הדמיה של כלי הדם במוח ניתן דמיינו פשוט ובזול עם מיקרוסקופ כל brightfield קונבנציונלי או ביתור מיקרוסקופ. Cerebrovasculature casted יכול להיות גם צילמו לכמת באמצעות מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מיקרו) 1. בנוסף, לאחר הדמיה, המוח casted יכול להיות מוטבע פרפין לניתוח היסטולוגית. היתרון של שיטה זו הליהוק וסקולרית לעומת טכניקות אחרות, הוא הסתגלות הרחב לכלים אנליטיים שונים, לרבות ניתוח brightfield מיקרוסקופיים, סריקת CT עקב המאפיינים radiopaqueteristic של החומר, כמו גם ניתוח היסטולוגית ו immunohistochemical. זה ניצול יעיל של רקמות יכול לחסוך את השימוש בבעלי חיים ולהפחית עלויות. הוכחנו לאחרונה יישום של שיטה זו כדי להמחיש את כלי הדם לא סדיר במודל של עכברים של BAVM מבוגר ברמה מיקרוסקופית 2, ולספק תמונות נוספות של כלי פגום הדמיה על ידי מיקרו CT. אף על פי שיטה זו יש חסרונות ולא יכול להיות אידיאלי עבור כל סוגי הניתוחים, היא טכניקה פשוטה, מעשית זה ניתן ללמוד בקלות מיושמים באופן נרחב על הליהוק של כלי הדם של כלי הדם בכל הגוף.

Watch this Scientific Journal Video about Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis at JoVE.com

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

cerebrovascular-casting-adult-mouse-for-3d-imaging-morphological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.5K Views.  University of California, San Francisco. במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.

Video: Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

הדמיה מוחית חקירת אפקט פגיעה של רגש על קוגניציה

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

גירוי מדויק של קליפת העין הקורטיקלית פוטנציאל מורפולוגיים

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...