العمل المبين في هذا المخطوط كان ممكنا من خلال تمويل من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) لUCR الجذعية الأساسية الخلية.

بروتوكول لدينا يبدأ مع طريقة للتكيف مع iPSCs الإنسان على الثقافات المغذية خالية، تليها بروتوكولات لiPSCs بنقل العدوى إلى الإنسان باستخدام GeneJuice (EMD) وnucleofection من iPSCs الإنسان باستخدام جهاز nuclefector AMAXA. ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراءات التالية في غطاء تدفق الصفحي العقيمة. جميع وسائل الإعلام والحلول معايرتها إلى 37 ° C أو درجة حرارة الغرفة قبل البدء ما لم ينص على خلاف ذلك. 1. إنشاء iPSCs الإنسان على التغذية خال من نظام يمكن تقسيم المحافظة iPSCs الإنسان سابقا على الخلايا المغذية، نقل على Geltrex المغلفة طبق ويحتفظ به لاثنين من الممرات قبل المغذية خالية ترنسفكأيشن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في Geltrex C. ° 4 لإعداد Geltrex طلاء، تمييع مطلق Geltrex 1:50 في DMEM الباردة. مزيج الحلول بلطف. </li></ol> ملاحظة: Geltrex، مثل Matrigel هو شكل قابل للذوبان من matr الغشاء القاعديتاسعا تنقيته من الفئران Engelbreth-هولم-سرب الخلايا السرطانية (EHS). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام Matrigel باعتبارها مصفوفة خارج الخلية لإنشاء وحدة التغذية الخالية من الثقافات اللجنة التوجيهية الإنسان. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية كاملة من الآبار السطحية الثقافة مع الحل Geltrex (1 مل 35-جيدا لمم أ). معطف الآبار مع Geltrex في 37 ° C الحاضنة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لiPSCs مرور الإنسان، إضافة 1 مل من accutase لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى تبدأ معظم الخلايا لفصل. </li></ol> لiPSCs مرور الإنسان، إضافة 1 مل من accutase لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى تبدأ معظم الخلايا لفصل. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الخرز الزجاجي 10-15 إلى الخلايا ودوامة بلطف لوحة. إضافة 2 مل من DMEM خروج المغلوب / F12 ويسحن بلطف. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 800 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف من الأنبوب، وترك الإنسان اللجنة التوجيهية بيليه سليمة. نفض الغبار بلطف أنبوب لتفريق الخلية بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة Geltrex من البئر المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه اللجنة التوجيهية بلطف الإنسان في حجم مناسب لSTEMPRO. توزيع بين آبار مغذيات، تبعا لمعدل انتشار). يمكن passaged iPSCs الإنسان في نسبة انقسام 1:02 حتي 01:06. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية مكان إلى 5٪ CO 2 حاضنة لوحة دوامة بعناية لضمان توزيع عادل للخلايا عبر الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا الأعلاف يوميا حتى الخلايا جاهزة للتقسيم مرة أخرى (عندما الخلايا يصل إلى 80٪ confluency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs مرور الإنسان على بئر جديدة Geltrex المغلفة (الخطوة 1،3 حتي 1،9) في نسبة انقسام 1:2. ينبغي تشكيل مستعمرات صغيرة وموزعة بالتساوي على Geltrex المغلفة جيدا قبل ترنسفكأيشن. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن من iPSCs الإنسان مع GeneJuice ينبغي الخلايا (نمت على 6 لوحات جيدا) يكون حوالي 40 -50٪ متموجة في يوم ترنسفكأيشن لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ترنسفكأيشن. فمنليس من الضروري تغيير المتوسطة الخلية حتى في اليوم التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 ميكرولتر KO-DMEM/F12 في أنبوب إيبندورف العقيمة 1،5 مل. إضافة 27 ميكرولتر ترنسفكأيشن GeneJuice كاشف. تخلط جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 DNA البلازميد ميكروغرام. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اختيار البلازميد أمر بالغ الأهمية لتحقيق الكفاءة المثلى ترنسفكأيشن. نستخدم البلازميد مع البروتين الأخضر مضان محسن (EGFP) يقودها المساعدة النقدية المروج 5 (pCAG-EGFP). المساعدة النقدية المروج هو المروج القوية التي تنشط في transcriptionally iPSCs الإنسان، وبالتالي يمكن استخدامها لدفع التعبير التحوير في هذه الخلايا. في أيدينا، لم الخطية من البلازميد لا يبدو أنها تؤثر على كفاءة ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة GeneJuice-DNA إلى الخلايا خليط ودوامة لوحة. تدور في 1200 دورة في الدقيقة لوحة لمدة 5 دقائق (طريقة &#39;spinoculation&#39;) لزيادة الاتصال من خليط ترنسفكأيشن مع iPSCs الإنسان على البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في 37 ودرجة؛ C بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد لكفاءة ترنسفكأيشن في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن مستقرة، تغيير المتوسطة في اليوم التالي مع STEMPRO الطازجة. إضافة اختيار المضادات الحيوية المناسبة بعد 24 - 48 ساعة. </li></ol> 3. Nucleofection من iPSCs الإنسان ويمكن استخدام iPSCs الإنسان نمت على مغذيات أو Geltrex لnucleofection. ومع ذلك، فإننا نوصي بشدة replating iPSCs الإنسان على الخلايا الليفية الماوس nucleofected الجنينية (MEF) أو الخلايا الليفية الإنسان القلفة (HFF) مغذيات عالية لضمان بقاء الخلية والانتعاش. وينبغي أن تستخدم على الأقل 2 مليون خلية لتحقيق أعلى بقاء الخلية بعد nucleofection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تغذية خلايا وسائل الإعلام مكيفة (CM) من خلال احتضان خروج المغلوب اللجنة التوجيهية الإنسان مصل استبدال (KOSR) وسائل الاعلام مع الخلايا المغذية ليلة وضحاها. CM جمع كل 24 ساعة. </li></ol> ملاحظة: أي سلالة الماوس المستخدمة لإعداد طبقات المغذية (مثل CF1، وBLK6 MF1) هو مناسبة لاستخدامها FOص صنع CM. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم nucleofection، قبل علاج iPSCs الإنسان مع 10 ميكرومتر ROCK المانع لمدة لا تقل 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 82 ميكرولتر من الخلايا الجذعية البشرية في حل nucleofector العقيمة 1،5 مل أنبوب إيبندورف. إضافة 18 ميكرولتر الملحق 1. تخلط جيدا. احتضان حل في C ° 37 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة تغذية الخلايا مكيفة وسائل الإعلام (CM) و0.25٪ التربسين / EDTA إلى 37 ° C. تحت غطاء محرك السيارة، prelabel 1 عقيمة أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائل الإعلام من ثقافة الإنسان أن اللجنة التوجيهية nucleofected. يغسل بلطف الخلايا مع 2 مل حل الفوسفات مخزنة 1X (PBS) لكل بئر. نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من التربسين 0.25٪ لكل بئر. احتضان خلايا في C ° 37 لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن بلطف خلايا ماصة الحافة مع 1000 مل. غسل قاع البئر للتأكد من منفصلة تماما عن iPSCs الإنسان. نقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى. </li></ol> ملاحظة: Trypsinization في ج واحدوينبغي بدقة ells يمكن تجنبها. يجب فقط أن الخلايا فكها إلى كتل صغيرة من الخلايا تتكون من ثلاثة توائم تقريبا من الخلايا. وكتل صغيرة من الخلايا (مثلثات الخلية) يمكن فصلها إلى خلايا واحدة خلال التعامل مع لاحقة من الخلايا. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 9 مل وسائل الإعلام MEF لتعطيل التربسين. تدور الخلايا في 800 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. نضح بعناية طاف وترك الخلية بيليه سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في ميكرولتر 100 من prewarmed الإنسان الجذعية حل الخلية nucleofector من الخطوة 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى كوفيت nucleofector باستخدام (أ) 1 مل ماصة الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في التعليق خلية في كوفيت. مزيج من الخلايا والحمض النووي دوامات لطيف. اضغط على كوفيت مرتين على سطح غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج كوفيت في ماسك nucleofector. استخدام برامج B-016. Nucleofect الخلايا عن طريق الضغط على زر X. </li></ol> &lt; <ok> و&gt; عندما يتم عرض عملية nucleofection هو الإنشائيةإد (عادة يستغرق سوى 1-5 ثواني). أسفرت استخدام برامج أخرى nucleofection (A-023، A 033-023-U و) أقل من 10٪ من EGFP إيجابية الخلايا من iPSCs الإنسان. </ok><ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد خلايا nucleofected من كوفيت باستخدام ماصة بلاستيكية تقديم باستور. استعادة الخلايا عن طريق resuspending لهم في CM prewarmed ومثبط ROCK في أنبوب إيبندورف العقيمة 1،5 مل. احتضان خلايا في C ° 37 لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا التعافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا قطرة من الحكمة على طبقات التغذية باستخدام 1 تلميح ماصة مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد لكفاءة ترنسفكأيشن في اليوم التالي. لاستخلاص الحيوانات المستنسخة مستقرة من iPSCs الإنسان المعدلة وراثيا أن التعبير عن ثابت التحوير، تغيير المتوسطة في اليوم التالي مع CM ومثبط ROCK. إضافة اختيار المضادات الحيوية المناسبة بعد 24 - 48 ساعة. </li></ol> 4. ممثل النتائج: <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" /> <stرونغ&gt; الشكل 1. Photomicrographs من Riv1 iPSCs الإنسان transfected مع EGFP-pCAG. (A) EGFP، معربا عن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل باستخدام Riv1 GeneJuice على Geltrex 12 ساعة بعد ترنسفكأيشن. مستعمرات Riv1 iPSCs الإنسان مطلي على شكل مغذيات وبعد nucleofection باستخدام B-016 (B) وA-023 (C) البرنامج. (D)، معربا عن EGFP الإنسان ستابلي المستعمرات اللجنة التوجيهية مع التعبير في كل مكان EGFP المستمدة من GeneJuice. (E)-ستابلي الاحتفاظ بالنقل Riv1 iPSCs الإنسان التأسيسي التعبير EGFP خلال التمايز الجسم مضغي الشكل.

<ol>
	<li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells:+possibilities+for+human+cell+transplantation.">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li><li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li><li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li><li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives.">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification.">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li><li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li><li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage.">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لدينا بروتوكولات نتيجة في تقنيات بسيطة وقوية للغاية وقابلة للتكرار لإدخال جينات منقولة في iPSCs الإنسان دون تأثير سام بارزة وموت الخلايا. وينبغي passaged iPSCs الإنسان إلى أصغر كتل من الخلايا (خلايا 5-10) ومطلي على Geltrex في كثافة عالية (1:2) لضمان كفاءة ترنسفكأيشن الأمثل في مستعمرات صغيرة عديدة. اللجنة التوجيهية لخطوط الإنسان التي هي أكثر عرضة للموت الخلية التمايز و، ينبغي استخدام عدد أكبر من iPSCs الإنسان (تصل إلى 4 X 10 6 خلايا) لتجربة nucleofection واحد. مقايسة عابرة ترنسفكأيشن يولد أعداد كبيرة من iPSCs التحوير، معربا عن الإنسان داخل 1 يوم. استنساخ اللجنة التوجيهية ستابلي تظهر عادة في غضون 7 أيام، وهذه المستعمرات المعدلة وراثيا يجب أن تكون جاهزة ويمكن الحصول عليها في غضون ثلاثة أسابيع. وصف استخدام المروج CAG هنا يضمن التعبير في كل مكان من مراسل EGFP. تحت هذه التحسينات، يمكن تناول بروتوكولات لدينا في التطبيقات الأخرى، بما في ذلك overexpression، جonditional التعريفي، والاشتقاق من خطوط سلالته مراسل محددة، أو ضربة قاضية سيرنا shRNA، إعادة التركيب الجيني الاستهداف ومثلي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 0،25٪ التربسين EDTA مع </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> إينفيتروجن </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3 حبات الزجاج مم </td><td> فيشر العلمية </td><td> 11-312A </td><td> وينبغي غسل الخرز الزجاجي مع حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) بين عشية وضحاها، تشطف قبالة مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) والماء المقطر، وتعقيم الأوتوكلاف من قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> Accutase كاشف خلية التفكك </td><td> إينفيتروجن </td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td> عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) </td><td> إينفيتروجن </td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (ارتفاع نسبة الجلوكوز) </td&gt; <td> Lonza </td><td> 12-741 F </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12760013 </td><td> تخفيض عامل النمو </td></tr><tr><td> GeneJuice ترنسفكأيشن كاشف </td><td> EMD العلوم البيولوجية </td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 35050061 </td><td> ويمكن أيضا الجلوتامين L-(إينفيتروجن، 25030081) يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك. </td></tr><tr><td> اللجنة التوجيهية KOSR الإنسان وسائل الإعلام </td><td></td><td></td><td> ES 500 مل الإنسان يتكون من وسائل الإعلام خروج المغلوب مل 390 DMEM / F12، و 100 مل مصل حال محل خروج المغلوب، 5ml Glutamax-I (100X)، NEAA 5ml (100X)، 500 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (55MM) وتستكمل مع 10 نانوغرام / مل bFGF . </td></tr><tr><td> خروج المغلوب DMEM/F12 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>استبدال خروج المغلوب المصل (KOSR) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> وسائل الإعلام الماوس الجنينية الخلايا الليفية </td><td></td><td></td><td> MEF سائل الإعلام يتكون من 90٪ FBS، NEAA 1X، 1X Glutamax I-1X والبيروفات الصوديوم في DMEM (ارتفاع نسبة الجلوكوز) </td></tr><tr><td> غير الأحماض الأمينية الأساسية، NEAA؟ (100X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> الحل الجذعية البشرية nucleofector الخلية 1 مع الملحق </td><td> Lonza </td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td> التخزين المؤقت المالحة الفوسفات الكالسيوم دون 2 + 2 + والمغنيسيوم </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td> البيروفات الصوديوم (100X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO المتوسطة طقم </td><td> إينفيتروجن </td><td> A1000701 </td><td> 500 مل سائل الإعلام STEMPRO يتكون من 454 مل قرع البابمن DMEM / F12، 10 مل STEMPRO الملحق المصل خالية من النمو (50X)، 5ml Glutamax-I (100X)، 5ml NEAA (100X)، 36 مل BSA (ألبومين المصل البقري، 25٪)، و 909 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (55MM ) وتستكمل مع 10 نانوغرام / مل bFGF. </td></tr></tbody></table>

transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells

التعديل الوراثي هو استمرار لتكون أداة أساسية في دراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية ويبين في التطبيقات السريرية المحتملة للخلايا الجذعية الجنينية (HESCs) 1. في حين وصفت العديد من التحسينات في طرق إيصال الجين 2-9، ترنسفكأيشن لا تزال متقلبة لعملية HESCs، وحتى الآن لم يتم الإبلاغ عن صنع الإنسان في الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). في هذا الفيديو، ونحن لشرح كيفية مختبرنا transfects بشكل روتيني وnucleofects iPSCs الإنسان باستخدام البلازميد مع تعزيز مضان مراسل الأخضر (EGFP) البروتين. يتم تكييفها iPSCs الإنسان والحفاظ عليه المغذية خالية الثقافات للقضاء على إمكانية ترنسفكأيشن الخلية المغذية والسماح اختيار كفاءة مستقرة استنساخ اللجنة التوجيهية المعدلة وراثيا بعد ترنسفكأيشن. لnucleofection، وiPSCs الإنسان مسبقا تعامل مع مثبط ROCK 11، trypsinized إلى كتل صغيرة من الخلايا، وnucleofected replated على مغذيات في الخلية المغذية للهواءالمتوسطة لزيادة الانتعاش الخلية. ويمكن الحصول على التحوير، معربا عن iPSCs الإنسان بعد 6 ساعات. يتم تطبيق اختيار المضادات الحيوية بعد 24 ساعة وخطوط مستقرة المعدلة وراثيا تظهر ضمن 1 أسبوع. بروتوكول لدينا قوية وقابلة للتكرار لخطوط التوجيهية الإنسان دون تغيير تعدد القدرات من هذه الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

على الرغم من التطورات الأخيرة في التعديل الوراثي، ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESCs) لا تزال عملية متقلبة. على حد علمنا، لم أساليب منهجية وفعالة لبالنقل الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان خلايا (iPSCs) للأنباء. هنا، نحن تصف بروتوكولات قوية لبالنقل بكفاءة وnucleofect iPSCs الإنسان.

وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

transfecting-and-nucleofecting-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

21.3K Views.  University of California Riverside. على الرغم من التطورات الأخيرة في التعديل الوراثي، ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESCs) لا تزال عملية متقلبة. على حد علمنا، لم أساليب منهجية وفعالة لبالنقل الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان خلايا (iPSCs) للأنباء. هنا، نحن تصف بروتوكولات قوية لبالن...

Video: Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfecting الإنسان الخلايا الجذعية العصبية مع Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)  

To begin, take a flask of cultured fibroblast cells, coat a 10-centimeter cell culture plate suitable for hiPSC culture with four milliliters of cold coating solution per plate, and incubate the plate for one hour at 37 degrees Celsius. Afterward, remove the media from the fibroblasts and wash them with four milliliters of pre-warmed PBS per flask. Aspirate the PBS and associate the fibroblasts with four milliliters of Trypsin-EDTA per flask by incubating for five to seven minutes at 37 degrees Celsius.Monitor cell detachment using a phase contrast microscope, and if needed, tap against the side of the flask to detach the cells from the plastic surface. Transfer the detached cells to a 50-milliliter conical tube and wash the empty flasks with six milliliters of pre-warmed fibroblast medium. Collect and pool the remaining cells in the conical tube.Then centrifuge the cells at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Aspirate the supernatant and re-suspend the cell pellet in three milliliters of fresh, pre-warmed PBS. Count the cells, transfer 1.5 times 10 to the sixth fibroblasts into a new conical tube and fill up with PBS to the five millimeter mark.Centrifuge the tube at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, re-suspend the cell pellet in five milliliters of electroporation medium, and centrifuge again. In the meantime, aspirate the coating solution from the coated 10-centimeter cell culture plate and add seven milliliters of pre-warmed fibroblast medium.At the end of the centrifugation, discard the supernatant and re-suspend the cell pellet in electroporation medium with a concentration of 1.5 times 10 to the sixth cells in 250 microliters. Transfer the 250 microliter cell suspension to an electroporation cuvette with a four millimeter gap distance. Next, prepare a plasma transfection mix by adding four micrograms of each plasmid to a total volume of 50 microliters of electroporation medium.Transfer the transfection mix to the cuvette, mix gently by flicking, and electroporate with one pulse at 280 volts. Finally, transfer 150 microliters of the electroporated fibroblasts to the prepared 10-centimeter cell culture plate. Agitate the plate thrice in all directions to distribute the cells, and incubate overnight.Fibroblasts present in a long, spindle-like phenotype, the size of 150 to 300 nanometers. After reprogramming, colonies with 50 micrometer small hiPSCs occur displaying distinct borders. The hiPSCs are distinguished by a high nuclei to body ratio and increased proliferation rate.