Les travaux décrits dans ce manuscrit a été rendue possible grâce au financement du California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) pour Core DUC sur les cellules souches.

Notre protocole débute avec une méthode d&#39;adaptation de l&#39;homme aux cultures iPSCs chargeur-libres, suivies de protocoles pour la transfection iPSCs humains en utilisant GeneJuice (EMD) et nucléofection de iPSCs humains en utilisant un dispositif AMAXA nuclefector. Remarque: Les procédures suivantes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile. Tous les milieux et solutions sont équilibrées à 37 ° C ou à la température ambiante avant de commencer, sauf indication contraire. 1. Établir iPSCs de l&#39;homme sur le départ sans système IPSCs homme auparavant maintenus sur des cellules nourricières peuvent être divisés, transféré sur Geltrex enduit plat et maintenu pendant deux passages avant d&#39;alimentation sans transfection. <ol><li> Décongeler Geltrex nuit à 4 ° C. Pour préparer revêtement Geltrex, diluer décongelé Geltrex 1:50 dans du DMEM froid. Mélanger les solutions en douceur. </li></ol> Remarque: Geltrex, comme Matrigel est une forme soluble de matr membrane basaleix purifiées à partir de souris Engelbreth-Holm-Swarm cellules tumorales (EHS). En variante, le Matrigel peut être utilisé comme une matrice extracellulaire pour établir des liaisons de cultures libres homme IPSC. <ol start="2"><li> Couvrir toute la surface du puits de culture avec Geltrex solution (1 ml pour un 35-mm également). Manteau puits avec Geltrex à 37 ° C incubateur pendant 1 heure. </li><li> Pour iPSCs passage de l&#39;homme, ajouter 1 ml de Accutase par puits et incuber à 37 ° C pendant 1 min jusqu&#39;à ce que la plupart des cellules commencent à se détacher. </li></ol> Pour iPSCs passage de l&#39;homme, ajouter 1 ml de Accutase par puits et incuber à 37 ° C pendant 1 min jusqu&#39;à ce que la plupart des cellules commencent à se détacher. <ol start="4"><li> Ajouter 10-15 perles de verre aux cellules et mélanger doucement en tournant la plaque. Ajouter 2 ml de DMEM KnockOut / F12 et doucement triturer. Transfert suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 10 ml. </li><li> Spin cellules à 800 rpm pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant à partir du tube, en laissant intact l&#39;homme iPSC culot. Tapotez doucement le tube àdisperser culot cellulaire. </li><li> Retirer Geltrex du bien enrobées. </li><li> Resuspendre doucement humaine iPSC culot dans un volume approprié de STEMPRO. Distribuer entre les puits de dispositifs d&#39;alimentation, en fonction du taux de prolifération). CSPi humaines peuvent être repiquées dans un rapport de division de 1:2 à 1:6. </li><li> Placer soigneusement dans 5% de CO 2 incubateur, tourbillon avec précaution la plaque pour assurer une distribution uniforme de cellules à travers le puits. </li><li> Cellules Flux jour jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêts à être divisé de nouveau (quand les cellules atteignent 80% de confluence). </li><li> CSPi passage de l&#39;homme sur Geltrex nouveau puits revêtu de l&#39;étape (1,3 à 1,9) dans un rapport de division de 1:2. Les petites colonies doit être formé et réparti uniformément sur Geltrex enduit bien avant la transfection. </li></ol> 2. La transfection de iPSCs de l&#39;homme avec GeneJuice (Cellules cultivées sur des plaques de 6 puits) doit être d&#39;environ 40 -50% de confluence le jour de la transfection d&#39;atteindre une efficacité de transfection optimale. Il estpas nécessaire de modifier le milieu cellulaire jusqu&#39;au lendemain. <ol><li> Préparer 100 KO-DMEM/F12 ul dans un tube stérile de 1,5 ml Eppendorf. Ajouter 27 ul de réactif de transfection GeneJuice. Mélangez bien. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 4 ug d&#39;ADN plasmidique. Incuber le tube à température ambiante pendant 15 minutes. Le choix du plasmide est essentiel pour l&#39;efficacité de transfection optimale. Nous utilisons un plasmide avec une protéine de fluorescence verte renforcée (eGFP) entraînée par l&#39;ACG promoteur 5 (pCAG-eGFP). CAG promoteur est un promoteur fort qui est transcriptionnellement actif dans iPSCs de l&#39;homme et peut donc être utilisé pour diriger l&#39;expression du transgène dans ces cellules. Dans nos mains, la linéarisation du plasmide ne semble pas affecter l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Ajouter GeneJuice ADN-mélange pour les cellules et les remous de la plaque. Faites tourner la plaque à 1200 rpm pendant 5 minutes (méthode «spinoculation &#39;) pour augmenter le contact du mélange de transfection avec iPSCs de l&#39;homme sur le bien. </li><li> Incuber les cellules à 37 ans &amp;deg; C durant la nuit. </li><li> Surveiller l&#39;efficacité de transfection le lendemain. </li><li> Pour la transfection stable, changer moyenne le lendemain avec STEMPRO frais. Ajouter le choix des antibiotiques après 24 - 48 heures. </li></ol> 3. Nucléofection de l&#39;homme iPSCs IPSCs humaines cultivées sur les départs ou Geltrex peut être utilisé pour nucléofection. Cependant, nous recommandons fortement replacage nucleofected iPSCs de l&#39;homme sur fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) ou des fibroblastes de prépuce humain (HFF) mangeoires pour assurer la viabilité cellulaire élevée et la récupération. Au moins 2 millions de cellules doivent être utilisées pour obtenir la survie de cellules plus élevée à la suite nucléofection. <ol><li> Préparer chargeur à pile milieux conditionnés (CM) en incubant humaine KnockOut iPSC sériques de rechange (KOSR) des médias avec des cellules nourricières du jour au lendemain. Recueillir CM toutes les 24 heures. </li></ol> Remarque: Toute souche de souris utilisée pour la préparation de couches de connexion (tels que BLK6, CF1 et MF1) est adapté pour être utilisé for faire CM. <ol start="2"><li> Le jour de nucléofection, pré-traiter iPSCs de l&#39;homme avec 10 inhibiteur de ROCK uM pendant au moins 1 heure. </li><li> Préparer 82 ul de solution-mère Nucleofector de cellules humaines dans un tube stérile de 1,5 ml Eppendorf. Ajouter 18 ul supplément 1. Mélangez bien. Incuber la solution à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Pré-chargeur réchauffer la pile milieu conditionné (CM) et 0,25% de trypsine / EDTA à 37 ° C. Sous le capot, prelabel une stérile 15 ml tube conique. </li><li> Retirez délicatement les médias de la culture iPSC humaine à nucleofected. Lavez délicatement les cellules avec 2 ml de solution de phosphate 1X tamponnée (PBS) par puits. Aspirer le PBS. Ajouter 1 ml de trypsine à 0,25% par puits. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Doucement triturer les cellules avec 1000 ml de pointe de pipette. Laver le fond du puits pour s&#39;assurer que tous iPSCs de l&#39;homme sont complètement détachés. Transfert suspension cellulaire à l&#39;étiquette tube de 15 ml conique. </li></ol> Remarque: la trypsine en simple caunes devraient être strictement évités. Les cellules doivent être délogé en petits amas de cellules se composait d&#39;environ triplets de cellules. Petits amas de cellules (cellules triples) seront dissociées en cellules isolées au cours de la manipulation ultérieure des cellules. <ol start="7"><li> Ajouter 9 ml de milieu MEF pour inactiver la trypsine. Spin cellules à 800 rpm pendant 3 minutes. Aspirer soigneusement le surnageant et laisser le culot de cellules intactes. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans préchauffé 100 pl de solution cellules souches humaines Nucleofector de l&#39;étape 3.3. </li><li> Transfert de cellules dans une cuvette Nucleofector l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml. </li><li> Ajouter 4 ug d&#39;ADN plasmidique dans la suspension cellulaire dans la cuvette. Mélanger les cellules et l&#39;ADN en remuant doucement. Appuyez sur la cuvette deux fois sur la surface de la hotte. </li><li> Insérez la cuve dans le porte-Nucleofector. Utiliser les programmes B-016. Cellules Nucleofect en appuyant sur le bouton X. </li></ol> &lt; <ok> &gt; S&#39;affiche lorsque le processus est complet nucléofectioned (ne prend généralement que 1-5 secondes). L&#39;utilisation de programmes nucléofection autres (A-023, 033-A et U-023) a abouti à moins de 10% de cellules positives eGFP de CSPi humaines. </ok><ol start="12"><li> Récupérer les cellules nucleofected de la cuvette avec la condition Pasteur en plastique pipette. Récupérer les cellules en les remettant en suspension dans CM préchauffé et un inhibiteur de ROCK dans un tube stérile de 1,5 ml Eppendorf. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10 minutes pour laisser les cellules récupérer. </li><li> Cellules de transfert de goutte à goutte sur des couches nourricières en utilisant 1 ml de pointe de pipette. Incuber les cellules à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Surveiller l&#39;efficacité de transfection le lendemain. Pour obtenir des clones stables de iPSCs transgéniques exprimant de façon stable l&#39;homme qui transgène, changer moyenne le lendemain avec CM et un inhibiteur de ROCK. Ajouter le choix des antibiotiques après 24 - 48 heures. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" /> <strong&gt; Figure 1. photomicrographies de Riv1 iPSCs humaines transfectées avec pCAG-eGFP. (A) eGFP exprimant Riv1 cellules transfectées en utilisant GeneJuice sur Geltrex 12 heures après la transfection. Les colonies de Riv1 iPSCs homme plaqué et formé sur les départs suivants nucléofection l&#39;aide de B-016 (B) et A-023 (C) du programme. (D) de manière stable exprimant eGFP-colonies humaines iPSC avec une expression ubiquitaire eGFP dérivé de GeneJuice. (E) stablement transfectées Riv1 iPSCs humains conservés expression constitutive eGFP cours de la différenciation corps embryoïdes.

<ol>
	<li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells:+possibilities+for+human+cell+transplantation.">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li><li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li><li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li><li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives.">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification.">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li><li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li><li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage.">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Notre résultat protocoles techniques simples, robustes et hautement reproductible à introduire des transgènes dans iPSCs homme sans effet toxique important et la mort cellulaire. IPSCs de l&#39;homme doivent être repiquées en petits amas de cellules (cellules 5-10) et étalées sur Geltrex à haute densité (1:2) pour assurer l&#39;efficacité de transfection optimale dans de nombreuses petites colonies. Pour l&#39;homme iPSC lignes qui sont plus sujettes à la mort cellulaire et la différenciation, plus grand nombre de iPSCs de l&#39;homme (jusqu&#39;à 4 x 10 6 cellules) doit être utilisé pour une expérience unique nucléofection. Analyse de transfection transitoire génère un grand nombre de transgènes exprimant iPSCs de l&#39;homme au sein de 1 jour. Transfectées de façon stable clones iPSC apparaissent habituellement dans les 7 jours, et ces colonies transgéniques doivent être prêts à être cueillis dans les trois semaines. L&#39;utilisation d&#39;un promoteur CAG décrit ici assure expression ubiquitaire de rapporteur de l&#39;EGFP. En vertu de ces améliorations, nos protocoles peuvent être introduits dans d&#39;autres applications, y compris la surexpression, conditionnel induction, des lignées reporter lignée spécifiques, ou shRNA knockdown siARN, la recombinaison homologue et ciblage génique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine avec de l&#39;EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3 billes de verre mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-312A </td><td> Perles de verre doivent être lavés avec de l&#39;acide chlorhydrique (HCl) pendant une nuit, rincé avec de l&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) et de l&#39;eau distillée, et stérilisé à l&#39;autoclave avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Cellule Accutase dissociation réactif </td><td> Invitrogen </td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (glycémie élevée) </td&gt; <td> Lonza </td><td> 12-741 F </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> Invitrogen </td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td> Invitrogen </td><td> 12760013 </td><td> Facteur de croissance réduite </td></tr><tr><td> Réactif de transfection GeneJuice </td><td> EMD Biosciences </td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td> L-glutamine (Invitrogen, 25030081) peut également être utilisé à la place. </td></tr><tr><td> Human iPSC KOSR médias </td><td></td><td></td><td> 500 ml humaine ES médias se compose de 390 KnockOut ml de DMEM / F12, 100 ml Sérum Replacer KnockOut, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 pi 2-mercaptoéthanol (55mm) et additionné de 10 ng / ml de bFGF . </td></tr><tr><td> KnockOut DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>Remplacement KnockOut Serum (KOSR) </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Médias de fibroblastes de souris embryonnaires </td><td></td><td></td><td> MEF médias se compose de 90% de FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I et du pyruvate de sodium dans du DMEM 1X (glycémie élevée) </td></tr><tr><td> Acide aminé non essentiel, NEAA? (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> Les cellules souches humaines Nucleofector solution à 1 avec supplément </td><td> Lonza </td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline sans Ca 2 + et Mg 2 + </td><td> Invitrogen </td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO support kit </td><td> Invitrogen </td><td> A1000701 </td><td> 500 ml STEMPRO médias se compose de 454 ml de KnockSur DMEM / F12, 10 ml STEMPRO supplément de croissance sans sérum (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml de BSA (albumine de sérum bovin, 25%), 909 ul 2-mercaptoéthanol (55mm ) et additionné de 10 ng / ml de bFGF. </td></tr></tbody></table>

transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells

La modification génétique continue d&#39;être un outil essentiel dans l&#39;étude de la biologie des cellules souches et en énonçant des applications cliniques potentielles des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) 1. Bien que des améliorations dans plusieurs méthodes de transfert de gènes ont été décrits 2-9, transfection reste un processus capricieux de CSEh, et ​​n&#39;a pas encore été signalé dans l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites (CISP). Dans cette vidéo, nous démontrons comment notre laboratoire transfecte régulièrement et nucleofects iPSCs de l&#39;homme en utilisant le plasmide avec une protéine de fluorescence verte renforcée (eGFP) journaliste. IPSCs de l&#39;homme sont adaptés et entretenus de manière alimentation sans cultures afin d&#39;éliminer la possibilité de transfection de cellules nourricières et de permettre une sélection efficace des clones stables iPSC transgéniques après transfection. Pour nucléofection, iPSCs de l&#39;homme sont pré-traités avec un inhibiteur ROCK 11, trypsinisées en petits amas de cellules, nucleofected et réensemencées sur les départs dans le chargeur conditionné par les cellulesmoyen d&#39;améliorer la récupération des cellules. Transgène exprimant iPSCs de l&#39;homme peut être obtenu après 6 heures. Sélection antibiotique est appliqué après 24 heures et stables lignées transgéniques apparaître dans 1 semaine. Notre protocole est robuste et reproductible pour des lignées iPSC sans altérer la pluripotence de ces cellules.

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Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Malgré les progrès récents dans la modification génétique, la transfection de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) reste un processus capricieux. A notre connaissance, les méthodes systématiques et efficaces pour transfecter l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) n&#39;ont pas été signalés. Ici, nous décrivons les protocoles robustes pour transfecter efficacement et nucleofect iPSCs de l&#39;homme.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

transfecting-and-nucleofecting-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K vues.  University of California Riverside. Malgré les progrès récents dans la modification génétique, la transfection de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) reste un processus capricieux. A notre connaissance, les méthodes systématiques et efficaces pour transfecter l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) n'ont pas été signalés. Ici, nous décrivons les protocoles robustes pour transfecter efficacement et nucleofect iPSCs de l'homme.

Vidéo: Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfection des cellules souches humaines à l&#39;Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Recherche

Biologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

Colonies sélectionner et isoler de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes adultes Reprogrammed

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)  

Reprogrammation épisomique de fibroblastes dermiques pour générer des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi)

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.