وأيد هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من ويلكوم ترست (المرجع : 084277).

<ol>
	<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools.">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle+revisited.">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li><li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5.">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li><li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes.">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li><li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function.">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li><li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles.">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li><li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals.">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li><li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover.">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li><li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses.">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li><li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis.">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li><li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li><li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+central+synapses.">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li><li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses.">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li><li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2.">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release.">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li><li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool.">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

وتستخدم على نطاق واسع الأصباغ وزير الخارجية للتحقيق في وظيفة الأعصاب الطرفية في الاستعدادات العصبية كثيرة. وقد استخدمت بصورة رئيسية لرصد مدى إما الإلتقام SV ، دوران SV أو حركية إيماس 6. بروتوكول صفها تمتد هذه الدراسات لدراسة الفرق تفريغ أحواض SV محددة. وهذا يوفر معلومات إضافية بخصوص تجديد حمامات SV وكذلك مداها التعبئة. ويمكن استخدام الأصباغ وزير الخارجية لتسمية جولات متعددة من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه. استغلت هذه الخاصية ونحن تصميم البروتوكولات التي يمكن رصدها SV دوران في كل محطة طرفية مرتين في العصب نفسه. هذا يتيح مراقبة دقيقة الداخلية ، وهو أمر ضروري نظرا للطبيعة غير متجانسة من إعادة التدوير في محطات SV العصبية الموازية 11. عبر استخدام المرحلة S1 باعتبارها الرقابة الداخلية ، وإعادة تعبئتها من RRP ، RP واجمالىيمكن SV تجمع في وجود مخدرات موثوق بها ومباشرة مقارنة. بالإضافة إلى توفير المعلومات عن حجم المطلقة لإعادة التدوير ، وRRP RP حمامات التحفيز في ظل ظروف مختلفة ، ويمكن لهذا البروتوكول أيضا توفير البيانات عن بعد -- 1) وتقسيم بين مركبة فضاء وRRP RP بوصفها وظيفة من تجمع التدوير ل2 ، S1 و S2) الحجم النسبي للحمامات S2 (RRP وRP) بوصفها وظيفة من مجموع بركة التدوير S1 و 3) الحجم النسبي في أي تجمع SV المعرفة في S2 بوصفها وظيفة من نفس المجموعة في S1. وهذا البروتوكول ولا سيما عدم تقديم معلومات عن حركية التفريغ ولكن ، منذ ذلك الوقت اقتناء بطيء جدا (لقياس الحركية مرات الاستحواذ يجب أن يكون سريعا بقدر الإمكان والتفريغ تلقائيا مزامنة لالتقاط الصورة). لدينا 30 هرتز 2 المحفزات ليالي يستحضر حد ما متطابقة من RRP التفريغ لالسكروز مفرط التوتر 8. منذ حجم RRPتم تعريفها بواسطة السكروز مفرط التوتر تفريغ 15 ، يمكننا أن نقول أن هذا البروتوكول افرغت كل مركبة فضاء RRP ، بالاتفاق مع الخلايا العصبية في قرن آمون الدراسات 16. تماما تقريبا استنزاف الاحتياطي التي تجمع ثلاثة قطارات من 400 المنبهات (40 هرتز كل 10 ثانية) منذ هذا التحفيز افرغت مبلغ مماثل من صبغ لنموذج (2 المحفزات مع بوكل 50 مم) التي تستنزف 95 ٪ من جميع مركبة فضاء صبغ المسمى 8،17. تقدير دقيق لحجم RRP على حد سواء وحمام سباحة احتياطي يعتمد أيضا على الحصول على المعلومات ضمن مجموعة ديناميكية الخطية للكاميرا CCD. ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسيطة مزيد من التعديل. يمكن أيضا أن قوة من المحفزات التحميل تكون متنوعة لتحديد مدى نشاط الخلايا العصبية وطرق مختلفة تؤثر الإلتقام SV تجديد حوض السباحة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أكبر من دورتين من التحميل والتفريغ أن يؤديها إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول في خلايا transfected إما مع أو overexpressionناقلات shRNA. نظرا لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن الثقافات العصبية الأولية ، لا بد من البروتينات وأعرب المفتاحية مع البروتينات الفلورية. فمن الضروري أن هذه العلامات الفلورية لا تتداخل مع الإشارة صبغ FM (سماوي أو استخدام البروتينات الحمراء ، على سبيل المثال). في هذه الحالة ، يمكن أيضا من الخلايا العصبية الطرفية وغير transfected transfected في نفس الحقل للعرض يمكن مقارنة كعنصر تحكم إضافية 8. في مثل هذه التجارب المقارنة بين مدى التحميل بين الاحمال وS1 S2 غير ذات قيمة تذكر ، لأن وجود اضطراب في كلتا الأحمال. يمكن تقسيم بين صبغ أحواض SV يزال من الممكن تصور ولكن 8. ودعا الصحفيين وراثية ويمكن أيضا أن تستخدم لpHluorins رصد إيماس SV الإلتقام في الثقافة والعصبية الأولية. هذه التحقيقات استخدام درجة الحموضة حساسة للبروتين الفلورية الخضراء للبيئة درجة الحموضة من المجالات اللمعية من البروتينات SV المفتاحية مثل VAMP ، وsynaptophysin VGLUT1 18 </suع&gt;. عندما تستخدم بالاقتران مع مثبطات أتباز الحويصلي ، يمكن pHluorins التقرير كلا من حركية ومدى تعبئة تجمع SV 19. النهج FM - صبغة تستند الموصوفة هنا لديه بعض المزايا على أسلوب pHluorin ، أولا ، والأصباغ وزير الخارجية تقديم معلومات عن الوضع الذي SV الإلتقام تغذي RRP وبرك الاحتياطي 8. ويمكن تسمية محددة ثانيا حمامات SV FM مع الأصباغ التي لها خصائص مختلفة الأطياف 20 وأخيرا لا يوجد أي شرط لترنسفكأيشن. يمكن الأصباغ وزير الخارجية لا توفر معلومات عن حركة المرور SV بين الراحة وإعادة تدوير حمامات SV لكن (على النقيض من pHluorins 19) ، ومنذ ذلك الحين مركبة فضاء التعريف يجب أن تكون محملة صبغ خلال الإلتقام أن تكون مرئية. وبالتالي كل من وزير الخارجية والأصباغ pHluorins لها من القوة والضعف وأقوى عندما تستخدم في تجارب مستقلة لمعالجة مسألة واحدة. صور عالية الجودة ضرورية للتحليل صحيح وreproducibالنتائج جنيه. في حين يمكن بسهولة تصحيح الانحراف الأفقي ، لا يمكن أن التجارب التي يوجد فيها انحراف في المحور Z يمكن استردادها. لهذا السبب ، فإنه من الأهمية بمكان إعادة تركيز الصور قبل البدء S1 و S2 افرغت. في الحالات عندما تسوس كبيرة الفلورسنت حدث ، يجوز تطبيق التصحيحات تسوس (عادة من خلال طرح تتبع المسجلة مسبقا من وزير الخارجية محملة الخلايا في غياب التحفيز). ومع ذلك ، فمن المقترح أن يتم تنفيذ سوى تصحيح تسوس لتمثيل رسومي وليس لاستخدامها في أي تحليل كمي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM التنقيح 3 كاميرا رقمية </td><td> كارل زايس </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> محوري Observer.A1 مجهر </td><td> كارل زايس </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> لوحات ثقافة خلية (6 آبار) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> الطرد المركزي (العالمي 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 حاضنة </td><td> هيراوس الآلات </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> الصقر أنابيب (15 / 50 مل) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0.75 ∞ / 0.17 الهدف </td><td> كارل زايس </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> الزجاج coverslips (Ø25mm) </td><td> VWR الدولية </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> باستور ماصات زجاجية (230 نانومتر) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> غرفة التصوير </td><td> نذير </td><td> RC - 21 BRFS </td></tr><tr><td> الصفحي تدفق هود </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain الأنسجة المروحية </td><td> Mickle مختبر الهندسة المحدودة </td><td> ام تي سي / 2 </td></tr><tr><td> مصباح الزئبق </td><td> كارل زايس </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim نظام محفز كهربائي (100mV ، عرض pluse 1ms) </td><td> Digitimer المحدودة. </td><td> D330 </td></tr><tr><td> مضخة نضح </td><td> واتسون ، مارلو </td><td> 313S </td></tr><tr><td> المصلية الماصات (5/10/25 مل) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> مصراع تحكم </td><td> كارل زايس </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> محقنة (20 مل) </td><td> Plastipak دينار بحريني </td><td> ST01 - B002 </td></tr><tr><td> مرشحات حقنة (Minisart -- 0.20 ميكرون) </td><td> سارتوريوس Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC - 6 صمام تحكم القناة ستة </td><td> نذير </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP Filteص مجموعة (مجموعة 46) </td><td> كارل زايس </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. معينة والمعدات والأجهزة المستخدمة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> FM1 - ​​43 </td><td> كامبردج العلوم الاحيائية </td><td> BT70021 </td><td> 10 ميكرومتر </td></tr><tr><td> FM2 - 10 </td><td> كامبردج العلوم الاحيائية </td><td> BT70044 </td><td> 100 ميكرون </td></tr><tr><td> بولي - D - يسين </td><td> سيغما </td><td> P7886 </td><td> 15 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> سيليكون الشحوم </td><td> سيغما </td><td> 85403 </td><td align="center"> -- </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الكواشف المستخدمة محددة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> مصل بقري الزلال (BSA) </td><td> سيغما </td><td> A4503 </td><td> 0.3 ٪ </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G5767 </td><td> 0.25 ٪ </td></tr><tr><td> مغSO 4 · 7H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M2773 </td><td> 1.5 ملم </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 مل mg/100 </td></tr></tbody></table> 100ML جديدة ، تجعل لكل إعداد معقمة تصفية قبل الاستخدام الجدول 3. حل باء لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> الحل B </td><td align="center"> -- </td><td align="center"> -- </td><td> 19 مل </td></tr><tr><td> التربسين (5 ملغ / مل الأسهم ، -20 درجة مئوية) </td><td> سيغما </td><td> T9201 </td><td> 1 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 4. تي حل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> حل C </td><td align="center"> -- </td><td align="center"> -- </td><td> 3.2 مل </td></tr><tr><td> الحل B </td><td align= &quot;مركز&quot;&gt; -- </td><td align="center"> -- </td><td> 16.8 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 5. W حل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> ديوكسي ريبونيوكلياز (الدناز ، 500 مل يو للسهم 0.5 ، -20 درجة مئوية) </td><td> سيغما </td><td> D5025 </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M2773 </td><td> 1.5 ملم </td></tr><tr><td> الحل B </td><td align="center"> -- </td><td align="center"> -- </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> فول الصويا التربسين المانع (SBTI ، و 0.5 ملغ في الأسهم مل 0.5 ، -20 درجة مئوية) </td><td> سيغما </td><td> T9003 </td><td> 0.5 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 6. C حل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> مصل بقري الزلال (BSA) </td><td> سيغما </td><td> A4503 </td><td> 4 ٪ </td></tr><tr><td> ايرل محلول الملح المتوازن (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M2773 </td><td> 3 مم </td></tr></tbody></table> الجدول 7. EBSS الحل لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> السيتوزين β - D - arabinofuranoside (آرا - C) * </td><td> سيغما </td><td> C1768 </td><td> 10 ميكرومتر </td></tr><tr><td> Foetal المصل البقري </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10 ٪ </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G5767 </td><td> 30 ملم </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> سيغما </td><td> G3126 </td><td> 2 ملم </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيغما </td><td> P5405 </td><td> 25 ملم </td></tr><tr><td> متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> البنسلين (ف) / الستبرتوميسين (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> يو 100 / مل (P) ، و 100 ميكروغرام / مل (S) </td></tr></tbody></table> * ينبغي أن يضاف آرا - C والمتوسطة ابتداء من 1 DIV الجدول 8. الثقافة وسائل الإعلام لإعداد CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> الإصدار </th><th> شركة </th></tr><tr><td> AxioVision ريلاش. </td><td> 4.8 </td><td> كارل زايس </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> المعاهد الوطنية للصحة </td></tr><tr><td> مايكروسوفت اكسل </td><td> 2003 </td><td> مايكروسوفت </td></tr></tbody></table> الجدول 9. برامج محددة الكمبيوتر المستخدمة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج لا. </th><th> تركيز </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> سيغما </td><td> C7902 </td><td> 1.3 ملي </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G5767 </td><td> 5 مم. </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيغما </td><td> P5405 </td><td> 3.5 ملم </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> سيغما </td><td> P9791 </td><td> 0.4 ملي </td></tr><tr><td> 2 · MgCl 6H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M0250 </td><td> 1.2 ملم </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 مم </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 مم. </td></tr><tr><td> غ 2 SO 4 </td><td> BDH وازم المختبرات </td><td> 10264 </td><td> 1.2 ملم </td></tr><tr><td> TES </td><td> سيغما </td><td> T1375 </td><td> 20 ملي </td></tr></tbody></table> الجدول 10. محلول ملحي (7.4 درجة الحموضة)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

بعد الافراج العصبي في المحطات العصبية المركزية ، ويتم استردادها بسرعة بواسطة مركبة فضاء الإلتقام. ثم يتم تعبئتها مع مركبة فضاء استرجاع العصبي والانضمام إلى التجمع إعادة التدوير ، على النحو المحدد مركبة فضاء التي تتوفر ل1،2 إيماس. عموما يمكن إعادة تدوير تجمع تقسم الى قسمين حمامات متميزة -- تجمع نشره بسهولة (RRP) ، وتجمع إماراتي (RP). كما يعني أسمائهم ، ويتكون من مركبة فضاء RRP التي يتم على الفور المتاحة للاندماج في حين يتم إطلاق مركبة فضاء RP 1،2 فقط خلال التحفيز مكثفة. فمن المهم أن يكون هناك فحص تقارير موثوقة تفيد بأن عملية التجديد هذه الفرق حمامات SV من أجل فهم 1) كيف مركبة فضاء بعد مرور أنماط مختلفة من الإلتقام (مثل clathrin التي تعتمد على الإلتقام والنشاط التي تعتمد على الإلتقام بالجملة) و 2) الآليات السيطرة على تعبئة RRP على حد سواء وRP استجابة لمحفزات مختلفة. الأصباغ وزير الخارجية وتوظف بشكل روتينياد تقرير لدوران SV كميا في المحطات العصب المركزي 3-8. لديهم ذيل مسعور المحروقات التي تسمح بتقسيم عكسها في طبقة ثنائية المادة الدهنية ، ورئيس المجموعة للماء الذي يمنع المرور عبر الأغشية. الأصباغ ومضان قليلا في محلول مائي ، ولكن عوائدها الكم يزيد بشكل كبير في الغشاء عند تقسيم 9. هكذا هي الأصباغ FM تحقيقات الفلورسنت مثالية لتتبع بنشاط إعادة التدوير مركبة فضاء. البروتوكول القياسي للاستخدام صبغة FM هي على النحو التالي. الأولى هي تطبيقها على الخلايا العصبية ويتم تناولها خلال الإلتقام (الشكل 1). بعد غسلها غير المنضوية صبغة بعيدا عن غشاء البلازما وإعادة تدويرها ، إعادة توزيع داخل مركبة فضاء تجمع إعادة التدوير. ونضبت ثم باستخدام هذه المحفزات تفريغ مركبة فضاء (الشكل 1). منذ FM صبغة وسم مركبة فضاء غير كمي 10 ، وتراجع الناتج مضان يتناسب مع كمية من الحويصلات الافراج عنهم. وهكذا ، ولدت إعادة التدوير وانصهار مركبة فضاء من العلاقات العامةويمكن لجولة evious الإلتقام كميا بشكل موثوق به. هنا ، نقدم البروتوكول الذي تم تعديله للحصول على عنصرين إضافية للمعلومات. أولا ، يتم استخدام المنبهات متتابعة التفريغ لتفريغ بالتفاوت في RRP وRP ، والسماح الكمي لتجديد حمامات SV محددة. ثانيا ، كل محطة يمر العصب البروتوكول مرتين. وبالتالي ، يمكن مقارنة استجابة العصب نفسه في محطة S1 ضد الوجود من مادة الاختبار في المرحلة S2 (الشكل 2) ، وتوفير الرقابة الداخلية. هذا هو المهم ، لأن مدى إعادة التدوير SV عبر محطات مختلفة العصب هو متغير جدا 11. ويمكن استخدام أي ملتصقة الثقافات العصبية الأساسي لهذا البروتوكول ، ولكن يتم تحسين كثافة الطلاء والحلول والشروط لتحفيز الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ (CGNs) 12،13.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

ووصفت العيش تقنية التصوير مضان لقياس التجديد وتعبئة حويصلة متشابك محددة (SV) مجمعات في المحطات العصبية المركزية. ويتم رصد جولتين من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه توفير الرقابة الداخلية.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K Views.  University of Edinburgh. ووصفت العيش تقنية التصوير مضان لقياس التجديد وتعبئة حويصلة متشابك محددة (SV) مجمعات في المحطات العصبية المركزية. ويتم رصد جولتين من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه توفير الرقابة الداخلية.

Video: Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...