1) إعداد مفترق ذبابة الفاكهة السوداء البطن العضلية العصبية (NMJ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معيار ذبابة الفاكهة ملحي (كلوريد الصوديوم 130 ملم ، 36 ملم السكروز ، 5 ملي بوكل ، CaCl 2 مم 2 ، 2 مم MgCl 2 ، 5 ملي Hepes ، ودرجة الحموضة 7.3 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح في إعداد المالحة (1.1). هو يرقات ذبابة الفاكهة موهون الجانب الظهري المتابعة في صحن Sylgard ؛ الجانب الظهري هو مقطوع الطولية ، وتتم إزالة الأجهزة الداخلية. وامتدت بعد ذلك لإعداد وموهون. العضلات البطنية ويمكن استخدام عدة بعد ذلك. </li></ol> 2) تحفيز وتلطيخ FM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المستحسن للقيام بكل الخطوات التالية في ظروف الإضاءة المنخفضة ، من أجل حماية الأصباغ FM من التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحفيز الكيميائي للأعصاب ، يستخدم العازلة عالية البوتاسيوم. إعداد ذبابة الفاكهة المالحة (انظر 1.1) تحتوي على 90 ملم و 10 ميكرومتر بوكل من FM1 43 صباغة. يبقي الحل محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام إعداد مع العازلة معدة مسبقا لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مع المياه المالحة القياسية ذبابة الفاكهة (1.1) لإزالة خارج الخلية FM1 - ​​43 صباغة. المضي قدما بسرعة الى التثبيت. </li></ol> 3) إصلاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام إعداد غلوتارالدهيد مع 2.5 ٪ في الفوسفات مخزنة (PBS) المالحة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للحفاظ على ميزات جيدة من الصرفية ، ويفضل أن غلوتارالدهيد بارافورمالدهيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ثم تترك إعداد المغمورة لمدة 15 دقيقة في 100 ملم من الكلورين NH 4. تتم هذه الخطوة من أجل إخماد مجموعات ألدهيد خالية من تثبيتي غلوتارالدهيد المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل حل NH 4 من الكلورين مع برنامج تلفزيوني عادي. </li></ol> 4) Photoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان إعداد NMJ لمدة 30 دقيقة عند 4 مئوية في برنامج تلفزيوني تحتوي على 1.5 ملغ مل من diaminobenzidine - 1 (DAB) درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف العينة تحت المجهر الفلورسنت. العثور على وتركيز إشارة الفلورسنت باستخدام المياه التكبير منخفضة نسبيا الهدف الغمر (20X 0.5 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليط الضوء على عينة مع شدة المصباح أقصى حتى يتم صبغ FM ابيض تماما (الشكل 1C). للسيطرة على photoconversion إذا حدث ، من المستحسن أن الاختيار في العينة تحت ضوء انتقال قبل وبعد خطوة صبغ تبيض FM. إذا photoconversion يأخذ مكان ، فمن المتوقع أن يعجل البني الداكن (الشكل 1C). الوقت الإضاءة هو متغير ، وهذا يتوقف على قوة الإضاءة وأيضا على تغلغل DAB في التحضير. بالنسبة لمعظم الأعمال التحضيرية ، وجدنا مرات إضاءة 30-45 دقيقة ~ وكأنه الحل الأمثل عند استخدام هدفا 20X. وتستخدم الإضاءة فترات أقصر لتحقيق أهداف أعلى التكبير (60x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضاءة لكننا نفضل استخدام مصباح الزئبق ، مع السكن مصباح تحتوي على المرآة الخلفية ، والذي يجمع أشعة الضوء الخلفي متناثر ، وبالتالي يزيد كثافة المجموع. </li></ol> 5) تجهيز العينة للEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Osmication <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل مع مجلد واحد من رباعي أكسيد الأوزميوم في حجم شجرة من الماء (ما يقارب 300 ميكرولتر لكل عينة). رباعي أكسيد الأوزميوم العمل به يجب ان يتم تحت غطاء محرك السيارة ، وذلك باستخدام القفازات ومعدات الحماية ايي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان إعداد في حل رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (تحت غطاء محرك السيارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (4-5 مرات 5 دقائق) ونقل العينات إلى كل قارورة زجاجية نظيفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جفاف <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول منفصلة تحتوي على 30 ، 50 ، 70 90 و 95 و 100 ٪ من الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 30 ٪ لكل عينة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 50 ٪ لكل عينة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الايثانول 70 ٪ على كل عينة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 90 ٪ من كل عينة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الايثانول 95 ٪ على كل عينة لمدة 5 دقائق (اكرر 3X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ لكل عينة لمدة 5 دقائق (اكرر 3X). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضمين ومزيد من المعالجة <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مزيج من راتنج EPON حجم مجلد واحد مع من الايثانول. إضافة إلى إعداد إطار التناوب المستمر (2-4 ساعات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مكان في EPON 100 ٪ في قوارير مفتوحة ، والسماح للايثانول المتبقية لتتبخر (4-6 ساعات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مكان في قوالب على 60 درجة مئوية لمدة 36 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإلكترون المجهري المعالجة. عملية التحضير في القسمين 50-80 نانومتر رقيقة ، وذلك باستخدام إجراءات ultramicrotomy القياسية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير المجهري الإلكترون <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والتقط إعداد الإجراءات التقليدية باستخدام EM. </li></ol></li></ol> 6) الممثل النتائج وترد النتائج المتوقعة في 1C أرقام و 2. نتائج الإجراء الإضاءة في تشكيل إخوانهسفل يعجل DAB ، والتي سوف تكون مرئية في كل مضان التصوير والبث. التواجد الأول خلال الإضاءة هي اختفاء مضان المرتبطة تلوين صبغ FM. ومضان الخلفية يسببها تثبيتي ألدهيد ، في المقابل ، سوف تكون واضحة في كافة مراحل التجربة. التبييض يحدث عادة في غضون دقائق 10-20 ~ بعد بدء الإضاءة. عادة يمكن أن يلاحظ أي منتج photoconversion في هذه النقطة الزمنية. وينبغي أن تستمر الإضاءة ، وبعد 10 دقائق ~ الاستعدادات سوف تتحول إلى الظل البني بسبب تراكم DAB (الشكل 1C الرابع) ومن غير الواضح لماذا DAB هطول الأمطار وصبغ FM تبيض لا تأخذ مكان في وقت واحد ، فمن الممكن أن عدد كبير نسبيا تتأكسد كمية DAB يحتاج إلى تجميع وتراكم قبل هطول الأمطار ، وبالتالي رد الفعل هذا هو أبطأ من عملية التبييض. في هذه المرحلة ، ومع ذلك ، وإعداد ليست مستعدة لتجهيز المجهر الإلكتروني ، حيث أن الأمطار DAB غير مكتملة احتمالا. نحن نفضل الانتظار لمدة 5-10 دقائق أطول خلالها التحضير (العصب الطرفي قبل المشبكي) يفترض وجود اللون البني الغامق (أو أسود) اللون ، مما يدل على التحويل الكامل. ويمكن ملاحظة تحول طفيف من سطح العامة لإعداد (على سبيل المثال ، من ألياف العضلات في الموصل العصبي العضلي) في هذه المرحلة. ومن المرجح أنها ذات الصلة لتحويل يسببها DAB التي تألق ذاتي (و / أو مضان تثبيتي) ، وأنها ليست ضارة لهذا الاجراء. ثم تتم معالجتها في التحضير للالمجهر الإلكتروني ، ويجب أن يتم التحقق من وجود حويصلات (المسمى) الظلام. كما أننا أظهرنا قبل 5،6 ، وهذه الحويصلات هي أكثر كثافة بكثير من تلك غير المسمى ، وبالتالي فهي تمييزها بسهولة (الشكل 2B). لزيادة فرصة جيدة للتمييز أنواع مختلفة من الحويصلات ، ينبغي أن يتم تنفيذ أي تباين تعزيز تلطيخ آخر من المقاطع (لا اليورانيل خلات الرصاص أو التلوين سيترات) ، وتلطيخ الأوزميوم كافية لمراقبة أكثر العناصر الخلوية ، وليس كما الظلام كما يعجل DAB. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : الأصباغ وزير الخارجية واستخدامها لphotoconversion. (أ) تمثل خطوات تجربة كلاسيكية للتحميل وdistaining الحويصلات باستخدام صبغة FM تحت التحفيز. (ط) احتضان العينة تحتوي على صبغة FM العازلة. (ب) حفز (كهربائيا أو كيميائيا) للحث على الانصهار في الحويصلة جود صبغة FM. (ج) سوف الإلتقام subsequence التحفيز بعد تحميل بعض الحويصلات مع صبغة FM لا تزال موجودة في المنطقة العازلة خارج الخلية. (د) استبدال الصبغة خارج الخلية مع وزير الخارجية عن طريق الغسيل العازلة. (ت) وسوف تحفيز جديدة تحفز حويصلات تحميلها للافراج عن صبغ بها وزير الخارجية على إيماس. (ب) تخطيطي يظهر الرأس والذيل وجسر للصباغة FM1 - 43. (C) مثال لتجربة photoconversion NMJ في ذبابة الفاكهة. (ط) بعد تحميل NMJ مع FM1 - 43 ، وغسل جزيئات الصبغة الخارجية وإصلاح ، ويمكن لاحظت مضان لمحطة عصب مع مجهر epifluorescence التقليدية (63x). (II - III) تحت الإضاءة المستمر هو ابيض تماما الصبغة. (د) عند إضاءة مستمرة ، لونها أسود يبدو بسبب هطول الأمطار diaminobenzidine. شريط الحجم يمثل 10 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : EM أمثلة لعينات photoconverted (أ) صورة تظهر العصبية الطرفية التي تحتوي على حويصلات متشابك ، ولكن ليس منهم من photoconverted ؛ قد يكون سبب ذلك عدم وجود إنارة كافية أو الفقراء diaminobenzidine تغلغل في الأنسجة. (B) حبة متشابك مع عدة حويصلات (مملوءة) المظلمة التي مرت photoconversion FM. (ج) زيادة النتائج محطة إنارة في الظلام an الشاملة حيث لا حويصلات أو العضيات يمكن تمييزها. أشرطة النطاق تمثل 200 نانومتر.

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

وينبغي اتخاذ بعض الخطوات الهامة في الاعتبار : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يقوم على حضانة DAB إلا بعد الغسل الكامل والتبريد من الاستعدادات. وإلا فإن رد فعل غير غلوتارالدهيد التفاعل مع وتسبب هطول الأمطار DAB والخمسين (عادة على شكل بلورات ال?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

اندماج الحويصلات متشابك مع غشاء البلازما (إيماس) هو خطوة لازمة في الافراج عن العصبي والاتصالات العصبية. ثم يتم استرداد الحويصلات من غشاء البلازما (الإلتقام) ويتم تجميعها معا مع التجمع العام للحويصلات داخل محطة العصبية ، حتى الخضوع لEXO ودورة جديدة الإلتقام (تدوير الحويصلة). وقد درست هذه العمليات باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات مثل المجهر الإلكتروني والتسجيلات الكهربية وamperometry وقياسات السعة. الأهم من ذلك ، خلال العقدين الماضيين ظهر عدد من علامات fluorescently المسمى ، والسماح لتتبع تقنيات بصرية الحويصلات في الديناميات الخاصة بإعادة التدوير. واحدة من العلامات الأكثر شيوعا هي styryl FM أو صبغة 1 ؛ هيكليا ، وكلها تحتوي على الأصباغ وزير الخارجية رئيس ماء وذيل محبة للدهون متصلا من خلال حلقة العطرية واحد أو أكثر من السندات المزدوجة (الشكل 1B). وصبغ التجربة الكلاسيكية وزير الخارجية لتسمية مجموعة من الحويصلات تتمثل في إعداد الاستحمام (الشكل 1Ai) مع الصبغة خلال تحفيز العصب (كهربائيا أو مع ارتفاع K +). هذا يؤدي الى إعادة تدوير حويصلة وتحميل اللاحقة للصباغة في الحويصلات endocytosed مؤخرا (الشكل 1A I - III). وبعد تحميل الحويصلات مع صباغة ، جولة ثانية من التحفيز في حمام صبغة خالية تؤدي الى الافراج عن وزير الخارجية خلال إيماس (الشكل 1A IV - V) ، والعملية التي يمكن اتباعها من خلال رصد انخفاض كثافة مضان (destaining). على الرغم من الأصباغ وزير الخارجية قد ساهمت إلى حد كبير في مجال إعادة التدوير الحويصلة ، فإنه ليس من الممكن تحديد الدقيق أو توطين مورفولوجية حويصلات الفردية باستخدام المجهر مضان التقليدية. لهذا السبب ، نحن هنا شرح كيفية FM الأصباغ ويمكن أيضا أن تستخدم كعلامات التقامي باستخدام المجهر الإلكتروني ، من خلال photoconversion. تقنية photoconversion يستغل ممتلكات الأصباغ الفلورية لتوليد أنواع الاكسجين التفاعلية تحت الإضاءة الشديدة. وغرقت الاستعدادات fluorescently المسمى في محلول يحتوي على diaminobenzidine (DAB) ومضيئة. رد الفعل الأنواع التي تم إنشاؤها بواسطة جزيئات صبغة أكسدة DAB ، الذي يشكل مستقرة ، غير قابلة للذوبان تترسب يحتوي على المظهر المظلم الذي يبدو ويمكن تمييزها بسهولة في المجهر الإلكترون 2،3. كما يتأكسد DAB فقط في الجوار المباشر للجزيئات فلوري (كما في أنواع الاكسجين التفاعلية قصيرة الأجل) ، وتقنية تضمن هياكل fluorescently فقط المسمى ذاهبون لاحتواء يعجل الإلكترونات كثيفة. هذه التقنية تسمح بذلك دراسة مورفولوجية والمكان المحدد لإعادة تدوير بنشاط العضيات.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

وقد الأصباغ وزير الخارجية للمساعدة لا تقدر بثمن في فهم ديناميات متشابك. ويتبع عادة وزراء خارجية تحت المجهر الفلورسنت خلال ظروف مختلفة التحفيز. ومع ذلك ، photoconversion من الأصباغ وزير الخارجية جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني يسمح التصور من حمامات متميزة حويصلة متشابك ، الترآيب الدقيق بين مكونات أخرى ، وحبات متشابك.

دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

studying-synaptic-vesicle-pools-using-photoconversion-of-styryl-dyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  European Neuroscience Institute Göttingen. وقد الأصباغ وزير الخارجية للمساعدة لا تقدر بثمن في فهم ديناميات متشابك. ويتبع عادة وزراء خارجية تحت المجهر الفلورسنت خلال ظروف مختلفة التحفيز. ومع ذلك ، photoconversion من الأصباغ وزير الخارجية جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني يسمح التصور من حمامات متميزة حويصلة متشا...

Video: Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

نموذج الماوس إشعال الناجمة عن بينتيلينيتيترازولي

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

مقايسة ضوئية لإعادة التدوير حويصلة متشابك في الخلايا العصبية مثقف Overexpressing البروتينات Presynaptic

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

تقييم متشابك تعدد استخدام المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...