עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן Wellcome (Ref: 084,277).

<ol>
	<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools.">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle+revisited.">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li><li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5.">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li><li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes.">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li><li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function.">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li><li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles.">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li><li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals.">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li><li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover.">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li><li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses.">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li><li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis.">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li><li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li><li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+central+synapses.">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li><li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses.">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li><li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2.">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release.">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li><li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool.">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

צבעים FM נמצאים בשימוש נרחב לחקור פונקציה מסוף עצב בהכנות עצבי רבים. הם היו מועסקים בעיקר כדי לפקח על היקף אנדוציטוזה או SV, מחזור SV או קינטיקה של exocytosis 6. פרוטוקול תיאר מרחיב את המחקרים הללו כדי לבחון את ההפרש פריקה של בריכות SV ספציפיים. זה מספק מידע נוסף על חידוש של בריכות SV וגם היקף הגיוס שלהם. צבעים FM ניתן להשתמש בתווית מספר סיבובים של מיחזור SV בתוך מסופי העצב אותו. אנחנו צריכים לנצל את רכוש שנועד פרוטוקולים בהם תחלופה SV בטרמינל אחד יכול להיות במעקב פעמיים מסופי העצב אותו. זה מספק בקרה פנימית מדויק, שהוא חיוני בשל אופי הטרוגני של מיחזור SV במסופי עצב מקביל 11. באמצעות שימוש של השלב S1 כמו שליטה פנימי, המילוי של RRP, RP לבין סךבריכת SV בנוכחות תרופות ניתן להשוות באופן אמין וישיר. בנוסף לאספקת מידע על גודל מוחלט של מיחזור, בריכות RRP ו RP בתנאי גירוי שונים, פרוטוקול זה יכול גם לספק נתונים הבאים - 1) חלוקת SVS בין RRP ו RP כפונקציה של הבריכה מיחזור עבור S1 ו - S2, 2) את הגודל היחסי של בריכות S2 (RRP ו RP) כפונקציה של הבריכה הכולל מיחזור S1 ו - 3) את הגודל היחסי של כל הבריכה SV S2 מוגדרת כפונקציה של הבריכה באותו S1. זה פרוטוקול מסוים לא תספק מידע על קינטיקה פריקה עם זאת, מאז הרכישה הזמן הוא איטי מדי (עבור מדידות הקינטית פעמים הרכישה צריך להיות מהיר ככל האפשר ופריקה אוטומטית מסונכרן לכידת תמונה). 30 הרץ שלנו 2 גירויים s מעורר מידה זהה של RRP הפריקה כדי סוכרוז hypertonic 8. מאז גודל RRPמוגדר על ידי סוכרוז hypertonic הפריקה 15, אנו יכולים לקבוע כי פרוטוקול זה פורק כל SVS RRP, בהסכמה עם מחקרים נוירונים בהיפוקמפוס 16. הבריכה מילואים מתרוקן כמעט לחלוטין על ידי שלוש רכבות של 400 גירויים (כל אחד 40 הרץ זה 10) מאז הגירוי הזה פורק סכום זהה של צבע על פרדיגמה (2 גירויים עם 50 מ&quot;מ KCl) כי מכלה 95% מכלל צבען שכותרתו SVS 8,17. כימות מדויק של גודל הן RRP ובמילואים בריכה תלוי גם בהשגת מידע בטווח דינאמי ליניארי של המצלמה CCD. פרוטוקול זה פשוט יכול גם להיות שונה יותר. העוצמה של גירויים טוען גם יכול להיות מגוונות כדי לקבוע כיצד הפעילות העצבית מצבי אנדוציטוזה שונה להשפיע על חידוש SV הבריכה. יתר על כן, יותר מאשר שני מחזורים של טעינה ופריקה יכול גם להתבצע אם נדרש. פרוטוקול זה יכול לשמש גם בתאים transfected עם ביטוי יתר אוshRNA וקטורים. בשל היעילות הנמוכה של תרבויות transfection עצבי ראשוני, חלבונים הביע חייב להיות מתוייגים עם חלבוני ניאון. זה חיוני כי אלה תגי פלורסנט לא להפריע לאות לצבוע FM (שימוש ציאן או חלבונים אדום, למשל). במקרה זה, מסופי עצב מתאי transfected ולא transfected באותו שדה הראייה יכול להיות גם בהשוואה בקרה נוספת 8. בניסויים כגון השוואה של מידת הטעינה בין המון S1 ו S2 הוא בעל ערך קטן, שכן ההפרעות שוהה במהלך עומסי שניהם. מחיצות של צבע בין בריכות SV עדיין יכול להיות דמיינו אולם 8. כתבים גנטית בשם pHluorins יכול גם להיות מועסק כדי לפקח exocytosis אנדוציטוזה SV ובתרבות עצבי ראשוני. בדיקות אלו להשתמש בחלבון ה-pH רגיש פלואורסצנטי ירוק לסביבה pH של תחומים luminal של חלבונים SV מתויג כגון נצלנית, synaptophysin ו VGLUT1 18 </sup&gt;. כאשר משתמשים בשילוב עם מעכבי שלפוחי ATPase, pHluorins יכול לדווח הן קינטיקה והיקף גיוס בריכה SV 19. הגישה FM-צבע מבוסס המתואר כאן יש כמה יתרונות על פני הטכניקה pHluorin, ראשית, צבעים FM לספק מידע על מצב שבו SV אנדוציטוזה ומחדש RRP ובריכות מילואים 8. ספציפי שנית בריכות SV יכול להיות מתויג עם צבעים FM כי יש תכונות ספקטרליות שונות 20 ולבסוף אין דרישה transfection. צבעים FM לא יכול לספק מידע על התנועה SV בין מנוחה ומיחזור בריכות SV זאת (בניגוד pHluorins 19), שכן מעצם הגדרתו SVS להיות עמוסה לצבוע במהלך אנדוציטוזה יהיו גלויים. כך גם צובעת FM ו pHluorins יש נקודות חוזק וחולשה הם החזקים ביותר כאשר מנוצל ניסויים עצמאיים לכתובת אותה השאלה. תמונות באיכות גבוהה הן חיוניות לצורך ניתוח reproducib תקףle התוצאות. בעוד להיסחף אופקי ניתן לתקן בקלות, ניסויים שבהם יש סחיפה של ציר Z-לא ניתן לשחזר. מסיבה זו, חשוב למקד מחדש את התמונות לפני תחילת פורקת S1 ו - S2. במקרים כאשר ריקבון פלורסנט משמעותי התרחש, תיקונים עששת עלול להיות מיושם (בדרך כלל על ידי הפחתת עקבות שהוקלטו בעבר מ-FM טעון תאים בהעדר גירוי). עם זאת, הוא הציע תיקון ריקבון מבוצע רק עבור ייצוג גרפי ולא לשמש עבור כל ניתוח כמותי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM הכומר 3 מצלמה דיגיטלית </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio מיקרוסקופ Observer.A1 </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> צלחות תרבית תאים (6 בארות) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 באינקובטור </td><td> Heraeus מכשירים </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> פלקון צינורות (15 / 50 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / ∞ 0.75 / 0.17 המטרה </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> זכוכית coverslips (Ø25mm) </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> זכוכית פסטר pipettes (230 ננומטר) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> הדמיה קאמרית </td><td> וורנר </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> זרימה למינרית ברדס </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain ופר רקמות </td><td> Mickle מעבדה הנדסה בע&quot;מ </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> מרקורי מנורה </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim מערכת חשמל ממריץ (100mV, 1ms רוחב pluse) </td><td> Digitimer בע&quot;מ </td><td> D330 </td></tr><tr><td> זלוף משאבה </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Pipettes סרולוגית (5/10/25 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> תריס בקר </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> מזרק (20 מ&quot;ל) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> מזרק מסננים (Minisart - 0.20 מיקרומטר) </td><td> סארטוריוס Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 שש שסתום ערוץ בקר </td><td> וורנר </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP Filter סט (סט 46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ציוד מכשירים ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> Bioscience קיימברידג&#39; </td><td> BT70021 </td><td> 10 מיקרומטר </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> Bioscience קיימברידג&#39; </td><td> BT70044 </td><td> 100 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Poly-D-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P7886 </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סיליקון גריז </td><td> סיגמא </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ריאגנטים ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> שור סרום אלבומין (BSA) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td> 0.3% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 0.25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 מ&quot;ל mg/100 </td></tr></tbody></table> -לעשות 100 מ&quot;ל טרי להכנת כל סטרילי, מסנן לפני השימוש לוח 3. הפתרון B להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריפסין (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> T9201 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 4. פתרון T להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> פתרון ג </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align= &quot;מרכז&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16.8 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 5. הפתרון W עבור CGN הכנה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNase, 500 U לכל המניות 0.5 מ&quot;ל, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> D5025 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סויה מעכב טריפסין (SBTI, 0.5 מ&quot;ג לכל המניות 0.5 מ&quot;ל, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> T9003 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 6. פתרון C עבור CGN הכנה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> שור סרום אלבומין (BSA) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> ארל פתרון מאוזן של מלח (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 3 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> לוח 7. EBSS פתרון להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> ציטוזין β-D-arabinofuranoside (ערה-C) * </td><td> סיגמא </td><td> C1768 </td><td> 10 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Foetal שור סרום </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 30 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> סיגמא </td><td> G3126 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> בינוני Essential מינימלי (מ) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין (P) / סטרפטומיצין (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (P), 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(S) </td></tr></tbody></table> * ערה-C יש להוסיף בינוני מ 1 ואילך DIV לוח 8. תרבות מדיה להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> גרסה </th><th> חברה </th></tr><tr><td> AxioVision Rel. </td><td> 4.8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> המכונים הלאומיים לבריאות </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> מיקרוסופט </td></tr></tbody></table> לוח 9. תוכנת מחשב ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> C7902 </td><td> 1.3 mM </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 3.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> סיגמא </td><td> P9791 </td><td> 0.4 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 שעות 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M0250 </td><td> 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH מעבדה ספקי </td><td> 10264 </td><td> 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> TES </td><td> סיגמא </td><td> T1375 </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> לוח 10. תמיסת מלח (pH 7.4)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

לאחר שחרור הנוירוטרנסמיטר במסופי העצבים המרכזית, SVS מאוחזרות במהירות על ידי אנדוציטוזה. SVS קטגוריה הם ומילא אז עם העצבי להצטרף בריכה מיחזור, כהגדרתו SVS הזמינים 1,2 exocytosis. הבריכה מיחזור בדרך כלל ניתן לחלק לשתי בריכות נפרדות - הבריכה releasable בקלות (RRP) ובריכת מילואים (RP). כמו שמותיהם לרמוז, RRP מורכב SVS כי הם מיד זמין עבור היתוך בעוד RP SVS משתחררים רק במהלך 1,2 גירוי עז. חשוב יש assay אמין כי הדיווחים חידוש ההפרש של בריכות אלה SV כדי להבין 1) איך SVS תנועה לאחר מצבים שונים של אנדוציטוזה (כגון אנדוציטוזה clathrin תלויי ופעילות תלויי אנדוציטוזה בתפזורת) ו 2) את המנגנונים שליטה על גיוס של שני RRP ו RP בתגובה לגירויים שונים. צבעים FM הם מעסיקים באופן שגרתיעורך הדו&quot;ח כדי כמותית מחזור SV במסופי העצבים המרכזית 3-8. יש להם זנב פחמימני הידרופובי המאפשר חלוקת הפיך ב bilayer השומנים, וקבוצה ראש הידרופילי כי מעבר אבני דרך ממברנות. צבעים יש הקרינה קטנה בתמיסה מימית, אך התשואה הקוונטים שלהם גדל באופן דרמטי כאשר למחיצות בקרום 9. כך צובעת FM הם בדיקות ניאון אידיאלי עבור מעקב פעיל מיחזור SVS. הפרוטוקול הסטנדרטי לשימוש FM לצבוע הוא כדלקמן. תחילה הם מוחלים על נוירונים נלקחים במהלך אנדוציטוזה (איור 1). אחרי לא הפנימו צבע נשטף הרחק הממברנה פלזמה, ממוחזר להפיץ SVS בתוך הבריכה מיחזור. SVS אלה מתרוקנים מכן באמצעות גירויים פריקה (איור 1). מאז FM תיוג צבען של SVS הוא quantal 10, הירידה הקרינה המתקבלת היא פרופורציונלית לסכום של שלפוחית ​​שפורסמו. לפיכך, מיחזור היתוך של SVS שנוצר יח&quot;צבסיבוב evious של אנדוציטוזה ניתן לכמת באופן מהימן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שונתה כדי להשיג שני מרכיבים נוספים של מידע. ראשית, גירויים פריקה רציפים משמשים דיפרנציאלי לפרוק את RRP לבין RP, על מנת לאפשר כימות של חידוש המלאי של בריכות SV ספציפיים. שנית, כל מסוף העצב עובר את הפרוטוקול פעמיים. לכן, התגובה של המסוף העצב באותו S1 ניתן להשוות נגד הנוכחות של חומר המבחן בשלב S2 (איור 2), מתן הבקרה הפנימית. זה חשוב, שכן היקף מיחזור SV ברחבי הטרמינלים עצב שונים משתנה מאוד 11. כל התרבויות חסיד עצבי ראשוני יכול לשמש עבור פרוטוקול זה, אולם צפיפות ציפוי, פתרונות התנאים גירוי מותאמים נוירונים גרגיר cerebellar (CGNs) 12,13.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית ​​סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K Views.  University of Edinburgh. טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית ​​סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.

Video: Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...